一种极细链格孢菌激活蛋白的增产方法

文档序号:10715608阅读:958来源:国知局
一种极细链格孢菌激活蛋白的增产方法
【专利摘要】本发明涉及一种极细链格孢菌激活蛋白的增产方法,该方法经过孢子的制备,孢子悬浮液的制备,以及在菌株液体培养时,在发酵培养基中加入β?谷甾醇和甜菜碱,从而增加极细链格孢菌激活蛋白的产量;采取本发明,一是优化的培养基和培养条件使激活蛋白产量提高四倍多,二是培养基成分均源自植物,来源方便安全,价格便宜,便于规模化生产;三是研究了摇瓶发酵的动态参数,获得了适宜菌株生长的发酵培养基;研究了接种量、发酵培养基初始pH值、摇瓶装液量和温度等对发酵的影响,确定了极细链格孢菌产激活蛋白培养基组成,以及最适摇瓶发酵培养条件。
【专利说明】
一种极细链格孢菌激活蛋白的増产方法
技术领域
[0001 ]本发明涉及一种极细链格孢菌激活蛋白的增产方法,尤其涉及在极细链格孢菌培 养基中加入β-谷留醇与甜菜碱,提高其激活蛋白产量的方法。
【背景技术】
[0002] 极细链格孢菌(Alternaria tenuissima)作为自然生态系统和农业生态系统中的 重要成员,既可引起植物病害,又可作为有用的生物资源为人类所利用。其在生物防治、生 物除草剂、环境废弃物处理、品种选育等方面显现出可利用的广阔前景。研究表明,细极链 格孢菌对环境污染物具有较强的降解作用,能产生酸性蛋白酶和β-l,3葡聚糖酶,分解硫化 橡胶并能在合成纤维上存活;此外,还能产生具有抗病增产功能的多种蛋白激发子【邱德 文,微生物蛋白农药研究进展,中国生物防治,2004,20(2):91-94】。
[0003] 激活蛋白有较强的诱导植物抗病,促进植物生长以及抗旱、抗逆的生物活性。不同 来源的激活蛋白在理化性质上略有差异,但生物活性相近或相似。该类激活蛋白主要通过 激活植物体内分子免疫系统,提高植物自身免疫力;激发植物体内的一系列代谢调控,促进 植物根茎叶生长,从而达到提高作物产量的目的。随着可持续农业的不断发展以及化学农 药抗性和污染问题的日益严重,生物农药越来越受到重视,并成为综合防治的主要部分。植 物激活蛋白农药是基于诱导增强植物抗病性、抗逆性而研制的新型蛋白质农药,产品安全 无毒,对植物有显著抗病增产作用,同时能提高作物品质【邱德文,杨秀芬,蛋白质农药研究 与产业化进展,中国农业科技导报,2006,8(6): 1-4】,生产上可以减少或不使用化学农药, 生产的产品可以达到绿色产品和有机食品的要求,特别是在有机蔬菜和果品生产中将发挥 重要作用,符合当前我国农业产业结构调整,有利于提高农产品附加值,具有非常广阔的市 场前景和良好的市场竞争力。
[0004] 极细链格孢菌是一种好氧微生物,一般在马铃薯蔗糖培养基上采用菌丝块接种培 养,这种方法获得的激活蛋白产量低。培养出的种子往往形成较大的团块,不利于进一步发 酵培养。而采用孢子悬浮液的方法可以弥补上述不足。如金鑫等人在马铃薯液体培养基上 培养极细链格孢菌,60h后获得激活蛋白1.39 g/L(金鑫,产激活蛋白极细链格孢菌发酵工 艺优化和中试生产技术,硕士学位论文,中国农业科学院研究生院,2007),经过优化培养基 和培养条件后,激活蛋白产量为5.17 g/L【金鑫,提高蛋白激发子产量的培养基及发酵条 件的优化.微生物学杂志,2009,29(2): 6-11】。
[0005] 极细链格孢菌在对数生长期生长速度较快,产生较多的菌丝,之后到达静止期、衰 亡期。由于激活蛋白是一类初级代谢产物,本发明为了增大激活蛋白的产量,设想延长极细 链格孢菌的生长期。细胞衰老必然会涉及膜结构的变化,其中谷留醇在细胞膜结构中起 着支架的作用,能阻止细胞双层膜由流动相向凝胶相的转变,保持细胞膜完整性,从而延缓 细胞的衰老【吴时敏,吴谋成,植物留醇的研究进展与趋向,中国油脂,2002,27(2):73-75】。 甜菜碱有维持细胞渗透压的作用。当受盐碱或水分胁迫时,细胞质中积累大量有机渗透调 节剂如甜菜碱,而将细胞质中的无机渗透调节剂挤向液泡,使细胞质与细胞内液泡环境维 持渗透平衡,这样避免了细胞质高浓度无机离子对酶和代谢的毒害(王欢,BADH基因转化羊 草的研究,硕士学位论文,吉林农业大学,2008)。甜菜碱的溶解度很高,不带净电荷,其高 浓度对许多酶及其他生物大分子没有影响,甚至有保护作用。

【发明内容】

[0006] 本发明针对上述技术现状,往培养基中加入了 β-谷留醇和甜菜碱,与现有技术相 比,使激活蛋白的产量增加了四倍以上,同时公开了适合极细链格孢菌发酵产激活蛋白的 培养基和产孢条件,提供了 一种极细链格孢菌激活蛋白的增产方法。
[0007] 本发明采取的技术方案是:一种极细链格孢菌激活蛋白的增产方法,其特征在于 具体步骤如下:(1)孢子的制备:在无菌操作台中,火焰保护下用接种针将-90~-70°c冻存 管中保存的极细链格孢菌菌丝,涂布在PSA培养基平板上,放入培养皿中并将培养皿边缘用 封口膜封死,在20~35°C的恒温条件下,在培养箱中倒置培养,直到其变黑产孢;(2)孢子悬 浮液的制备:在无菌操作台中,取出培养皿中的PSA培养基平板,在PSA培养基平板上打取菌 丝块,将一定量的已灭菌的0.05%吐温-20的蒸馏水均匀的倾注在菌丝块表面,将孢子与菌 丝分离并悬浮在无菌水中,之后将菌悬液过滤后得到孢子悬浮液储存在无菌环境中备用; (3)极细链格孢菌液的培养:在无菌操作台中,将制备好的孢子悬浮液接入装有75~200mL 发酵培养基的500 mL器皿中,每瓶接种3~20 mL,将接种后的器皿放入旋转式恒温摇床中, 转速为120~200 r/min,培养温度为20~35°C,培养50~70h后即得;(4)激活蛋白的提取和 含量测定:将500mL器皿中培养的极细链格孢菌液抽滤到定性滤纸上,将抽滤好的菌饼连同 滤纸一起在烘箱中55~65°C干燥至恒重,将干燥后的菌饼研磨成粉末,加入激活蛋白提取 缓冲液,振荡均匀,在2~6°C冰箱中放置10~30 min,在沸水浴中加热10~30 min,之后 12000~14000 r/min离心10~20 min,取上清即得激活蛋白粗提液,使用双缩脲方法测定 激活蛋白粗提液中激活蛋白的含量。
[0008] 所述的一种极细链格孢菌激活蛋白的增产方法,其特征在于按质量组份,发酵培 养基为:1~5 g/L β-谷甾醇,1~5 g/L甜菜碱,12~18 g/L蔗糖,2~8 g/L玉米淀粉,15~ 25 g/L土豆淀粉,7~13 g/L谷氨酸,2~8 g/L胰蛋白胨,7~13 g/L黄豆粉,2~8 g/L硝酸 钾。
[0009] 所述的一种极细链格孢菌激活蛋白的增产方法,其特征在于按质量组份,发酵培 养基优选为:4 g/L β-谷甾醇,2 g/L甜菜碱,15 g/L鹿糖,5 g/L玉米淀粉,20 g/L土豆淀 粉,10 g/L谷氨酸,5 g/L胰蛋白胨,10 g/L黄豆粉,5 g/L硝酸钾。
[0010] 所述的一种极细链格孢菌激活蛋白的增产方法,其特征在于发酵培养基起始 pH5.5~8.5,用HC1或NaOH调成不同的pH值。
[0011] 所述的一种极细链格孢菌激活蛋白的增产方法,其特征在于激活蛋白提取缓冲液 为0.02 mol/L Tris缓冲液,用HC1 调pH到8.0。
[0012] 所述的一种极细链格孢菌激活蛋白的增产方法,其特征在于极细链格孢菌激活蛋 白的生物活性的测试方法为:将提取的极细链格孢菌激活蛋白用蒸馏水稀释成1~20 yg/ mL的蛋白液,将小麦种子用蛋白液浸泡7~9h,每处理20粒种子,置于铺有至少两层湿纱布 的培养皿中,以蒸馏水浸泡为空白实验,每个处理均重复2~4次,期间喷水使纱布保湿,至 少2天后观察记录小麦的发芽率,若各处理发芽率明显高于空白对照,则认为该蛋白处理有 激活蛋白活性。
[0013] 采取本发明,具有如下有益效果:一是优化的培养基和培养条件使激活蛋白产量 提高四倍多,从原来(马铃薯蔗糖培养基)的1.35 g/L提高到10.85 g/L以上;二是培养基成 分均源自植物,来源方便安全,价格便宜,便于规模化生产;三是研究了摇瓶发酵的动态参 数,获得了适宜菌株生长的发酵培养基;研究了接种量、发酵培养基初始pH值、摇瓶装液量 和温度等对发酵的影响,确定了极细链格孢菌产激活蛋白培养基组成,以及最适摇瓶发酵 培养条件。
【附图说明】
[0014] 图1是本发明在极细链格孢菌激活蛋白的生物活性测定中,八个实验组激活蛋白 产量(g/L)和种子发芽率(%)的对比图。
【具体实施方式】
[0015] 以下结合实施例来进一步解释本发明,但实施例并不对本发明做任何形式的限 定。
[0016] -、实施例一。具体包括如下步骤: (1)孢子的制备:在无菌操作台中,火焰保护下用接种针将-90~-70°C冻存管中保存的 极细链格孢菌菌丝,涂布在PSA培养基平板上,放入培养皿中并将培养皿边缘用封口膜封 死,在20~35°C的恒温条件下,在培养箱中倒置培养,直到其变黑产孢。
[0017] (2)孢子悬浮液的制备:在无菌操作台中,用6mm打孔器在PSA培养基上打取菌丝 块,将5 mL的已灭菌的0.05%吐温-20的蒸馏水均匀的倾注在菌丝块表面,用已灭菌的玻璃 涂布棒轻轻扫过菌落表面,将孢子与菌丝分离并悬浮在无菌水中,之后将菌悬液用两层纱 布过滤后得到孢子悬浮液储存在无菌玻璃三角瓶中备用。
[0018] (3)极细链格孢菌液的培养:在无菌操作台中,在四个500 mL三角烧瓶中中分别加 入75mL,100mL,150mL,200mL发酵培养基,每瓶接种孢子悬浮液8mL,将接种后的三角烧瓶放 入旋转式恒温摇床中,设置转速为120~200 r/min(优选180 r/min),培养温度为20~35°C (优选28°C),培养50~70h(优选60 h)后提取激活蛋白。
[0019] 其中的发酵培养基为:1~5g/L (优选3 g/υβ-谷留醇(优选3 g/L),1~5 g/L(优 选3 g/L)甜菜碱,12~18 g/L(优选15 g/L)蔗糖,2~8 g/L(优选5 g/L)玉米淀粉,15~25 g/L(优选20 g/L)土豆淀粉,7~13 g/(优选10 g/L)L谷氨酸,2~8 g/L(优选5 g/L)胰蛋白 胨,7~13 g/L(优选10 g/L)黄豆粉,2~8 g/L(优选5 g/L)硝酸钾;且发酵培养基用HC1或 NaOH调成起始pH7.0。
[0020] (4)激活蛋白的提取和含量测定:将500mL摇瓶培养的极细链格孢菌液抽滤到定性 滤纸上,将抽滤好的菌饼连同滤纸一起在烘箱中55~65°C干燥至恒重,将干燥后的菌饼在 研钵中研磨成粉末,加入激活蛋白提取缓冲液(0.02 mol/L Tris缓冲液,用HC1调pH到 8.0),振荡均匀,在2~6°C冰箱中放置10~30 min,在沸水浴中加热10~30 min,之后12000 ~14000 r/min离心10~20 min,取上清即得激活蛋白粗提液,使用双缩脲方法测定激活蛋 白提取液中激活蛋白的含量。
[0021] (5)实验结果表明75mL,100mL,150mL,200mL装液量,激活蛋白产量分别为9.9g/L, 9 · 74g/L,9 · 72g/L,8 · 62g/L;所以培养基装液量在75 mL比较适宜。
[0022]二、实施例二。具体包括如下步骤: (1)孢子的制备:在无菌操作台中,火焰保护下用接种针将-90~-70°c冻存管中保存的 极细链格孢菌菌丝,涂布在PSA培养基平板上,放入培养皿中并将培养皿边缘用封口膜封 死,在20~35°C的恒温条件下,在培养箱中倒置培养,直到其变黑产孢。
[0023] (2)孢子悬浮液的制备:在无菌操作台中,用6mm打孔器在PSA培养基上打取菌丝 块,将5 mL的已灭菌的0.05%吐温-20的蒸馏水均匀的倾注在菌丝块表面,用已灭菌的玻璃 涂布棒轻轻扫过菌落表面,将孢子与菌丝分离并悬浮在无菌水中,后将菌悬液用两层纱布 过滤后储存在无菌玻璃三角瓶中备用。
[0024] (3)极细链格孢菌液的培养:在无菌操作台中,将制备好的孢子悬浮液接入装有 100mL发酵培养基的五个500 mL三角烧瓶中,接入不同体积(3%、5%、10%、15%、20%)的孢子悬 浮液,将接种后的三角烧瓶放入旋转式恒温摇床中,设置转速为120~200 r/min(优选180 r/min),培养温度为20~35°C(优选28°C),培养50~70h(优选60 h)后提取激活蛋白。
[0025]其中的发酵培养基为:1~5g/L (优选3 g/L)i3-谷留醇(优选3 g/L),l~5 g/L(优 选3 g/L)甜菜碱,12~18 g/L(优选15 g/L)蔗糖,2~8 g/L(优选5 g/L)玉米淀粉,15~25 g/L(优选20 g/L)土豆淀粉,7~13 g/(优选10 g/L)L谷氨酸,2~8 g/L(优选5 g/L)胰蛋白 胨,7~13 g/L(优选10 g/L)黄豆粉,2~8 g/L(优选5 g/L)硝酸钾;且发酵培养基用HC1或 NaOH调成起始pH7.0。
[0026] (4)激活蛋白的提取和含量测定:将500mL摇瓶培养的极细链格孢菌液抽滤到定性 滤纸上,将抽滤好的菌饼连同滤纸一起在烘箱中55~65°C干燥至恒重,将干燥后的菌饼在 研钵中研磨成粉末,加入激活蛋白提取缓冲液(0.02 mol/L Tris缓冲液,用HC1调pH到 8.0),振荡均匀,在2~6°C冰箱中放置10~30 min,在沸水浴中加热10~30 min,之后12000 ~14000 r/min离心10~20 min,取上清即得激活蛋白粗提液,使用双缩脲方法测定激活蛋 白提取液中激活蛋白的含量。
[0027] (5)实验结果表明3%、5%、10%、15%、20%的接种量,激活蛋白产量分别为6.84 g/L, 7.9 g/L,9.66 g/L,9.64 g/L,9.32 g/L;所以10%的接种量的发酵结果激活蛋白产量最大。 [0028]三、实施例三。具体包括如下步骤: (1)孢子的制备:在无菌操作台中,火焰保护下用接种针将-90~-70°c冻存管中保存的 极细链格孢菌菌丝,涂布在PSA培养基平板上,放入培养皿中并将培养皿边缘用封口膜封 死,在20~35°C的恒温条件下,在培养箱中倒置培养,直到其变黑产孢。
[0029] (2)孢子悬浮液的制备:在无菌操作台中,用6mm打孔器在PSA培养基上打取菌丝 块,将5 mL的已灭菌的0.05%吐温-20的蒸馏水均匀的倾注在菌丝块表面,用已灭菌的玻璃 涂布棒轻轻扫过菌落表面,将孢子与菌丝分离并悬浮在无菌水中,后将菌悬液用两层纱布 过滤后储存在无菌玻璃三角瓶中备用。
[0030] (3)极细链格孢菌液的培养:在无菌操作台中,将制备好的孢子悬浮液接入装有 1 OOmL发酵培养基的五个500 mL三角烧瓶中,接入1 OmL的孢子悬浮液,将接种后的三角烧瓶 放入旋转式恒温摇床中,分别设置转速为120 r/min、160 r/min、180 r/min、200 r/min,培 养温度为20~35°C(优选28°C),培养50~70h(优选60 h)后提取激活蛋白。
[0031]其中的发酵培养基为:1~5g/L (优选3 g/L)i3-谷留醇(优选3 g/L),1~5 g/L(优 选3 g/L)甜菜碱,12~18 g/L(优选15 g/L)蔗糖,2~8 g/L(优选5 g/L)玉米淀粉,15~25 g/L(优选20 g/L)土豆淀粉,7~13 g/(优选10 g/L)L谷氨酸,2~8 g/L(优选5 g/L)胰蛋白 胨,7~13 g/L(优选10 g/L)黄豆粉,2~8 g/L(优选5 g/L)硝酸钾;且发酵培养基用HC1或 NaOH调成起始pH7.0。
[0032] (4)激活蛋白的提取和含量测定:将500mL摇瓶培养的极细链格孢菌液抽滤到定性 滤纸上,将抽滤好的菌饼连同滤纸一起在烘箱中55~65°C干燥至恒重,将干燥后的菌饼在 研钵中研磨成粉末,加入激活蛋白提取缓冲液(0.02 mol/L Tris缓冲液,用HC1调pH到 8.0) ,振荡均匀,在2~6°C冰箱中放置10~30 min,在沸水浴中加热10~30 min,之后12000 ~14000 r/min离心10~20 min,取上清即得激活蛋白粗提液,使用双缩脲方法测定激活蛋 白提取液中激活蛋白的含量。
[0033] (5)实验结果表明转速 120 r/min、160 r/min、180 r/min、200 r/min,激活蛋白产 量分别为6.42 g/L,8.1 g/L,9.66 g/L,9.62 g/L;所以转速为 180 r/min比较适宜。
[0034] 四、实施例四。具体包括如下步骤: (1)孢子的制备:在无菌操作台中,火焰保护下用接种针将-90~-70°c冻存管中保存的 极细链格孢菌菌丝,涂布在PSA培养基平板上,放入培养皿中并将培养皿边缘用封口膜封 死,在20~35°C的恒温条件下,在培养箱中倒置培养,直到其变黑产孢。
[0035] (2)孢子悬浮液的制备:在无菌操作台中,用6mm打孔器在PSA培养基上打取菌丝 块,将5 mL的已灭菌的0.05%吐温-20的蒸馏水均匀的倾注在菌丝块表面,用已灭菌的玻璃 涂布棒轻轻扫过菌落表面,将孢子与菌丝分离并悬浮在无菌水中,后将菌悬液用两层纱布 过滤后储存在无菌玻璃三角瓶中备用。
[0036] (3)极细链格孢菌液的培养:在无菌操作台中,将制备好的孢子悬浮液接入装有 1 OOmL发酵培养基的五个500 mL三角烧瓶中,接入1 OmL的孢子悬浮液,将接种后的三角烧瓶 放入旋转式恒温摇床中,设置转速为120~200 r/min(优选180 r/min)180 r/min,分别在 20°C,25°C,28°C,31°C,35°C的温度下培养,培养50~70h(优选60 h)后提取激活蛋白。 [0037]其中的发酵培养基为:1~5g/L (优选3 g/L)i3-谷留醇(优选3 g/L),1~5 g/L(优 选3 g/L)甜菜碱,12~18 g/L(优选15 g/L)蔗糖,2~8 g/L(优选5 g/L)玉米淀粉,15~25 g/L(优选20 g/L)土豆淀粉,7~13 g/(优选10 g/L)L谷氨酸,2~8 g/L(优选5 g/L)胰蛋白 胨,7~13 g/L(优选10 g/L)黄豆粉,2~8 g/L(优选5 g/L)硝酸钾;且发酵培养基用HC1或 NaOH调成起始pH7.0。
[0038] (4)激活蛋白的提取和含量测定:将500mL摇瓶培养的极细链格孢菌液抽滤到定性 滤纸上,将抽滤好的菌饼连同滤纸一起在烘箱中55~65°C干燥至恒重,将干燥后的菌饼在 研钵中研磨成粉末,加入激活蛋白提取缓冲液(0.02 mol/L Tris缓冲液,用HC1调pH到 8.0) ,振荡均匀,在2~6°C冰箱中放置10~30 min,在沸水浴中加热10~30 min,之后12000 ~14000 r/min离心10~20 min,取上清即得激活蛋白粗提液,使用双缩脲方法测定激活蛋 白提取液中激活蛋白的含量。
[0039] (5)实验结果表明培养温度20 °C,25 °C,28 °C,31 °C,35°C,激活蛋白产量分别为 8.28 g/L,9.04 g/L,9.66 g/L,9.24 g/L,8.1 g/L;所以培养温度28°C较为适宜。
[0040]五、实施例五。具体包括如下步骤: (1)孢子的制备:在无菌操作台中,火焰保护下用接种针将-90~-70°C冻存管中保存的 极细链格孢菌菌丝,涂布在PSA培养基平板上,放入培养皿中并将将培养皿边缘用封口膜封 死,在20~35°C的恒温条件下,在培养箱中倒置培养,直到其变黑产孢。
[0041] (2)孢子悬浮液的制备:在无菌操作台中,用6mm打孔器在PSA培养基上打取菌丝 块,将5 mL的已灭菌的0.05%吐温-20的蒸馏水均匀的倾注在菌丝块表面,用已灭菌的玻璃 涂布棒轻轻扫过菌落表面,将孢子与菌丝分离并悬浮在无菌水中,后将菌悬液用两层纱布 过滤后储存在无菌玻璃三角瓶中备用。
[0042] (3)极细链格孢菌液的培养:在无菌操作台中,将制备好的孢子悬浮液接入装有 1 OOmL发酵培养基的七个500 mL三角烧瓶中,接入1 OmL的孢子悬浮液,将接种后的三角烧瓶 放入旋转式恒温摇床中,设置转速为120~200 r/min(优选180 r/min)180 r/min,培养温 度为20~35°C(优选28°C),培养50~70h(优选60 h)后提取激活蛋白。
[0043]其中的发酵培养基为:1~5g/L (优选3 g/L)i3-谷甾醇(优选3 g/L),l~5 g/L(优 选3 g/L)甜菜碱,12~18 g/L(优选15 g/L)蔗糖,2~8 g/L(优选5 g/L)玉米淀粉,15~25 g/L(优选20 g/L)土豆淀粉,7~13 g/(优选10 g/L)L谷氨酸,2~8 g/L(优选5 g/L)胰蛋白 胨,7~13 g/L(优选10 g/L)黄豆粉,2~8 g/L(优选5 g/L)硝酸钾;且发酵培养基用HC1或 NaOH调成起始分别设置发酵培养基起始pH值为5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5。
[0044] (4)激活蛋白的提取和含量测定:将500mL摇瓶培养的极细链格孢菌液抽滤到定性 滤纸上,将抽滤好的菌饼连同滤纸一起在烘箱中55~65°C干燥至恒重,将干燥后的菌饼在 研钵中研磨成粉末,加入激活蛋白提取缓冲液(0.02 mol/L Tris缓冲液,用HC1调pH到 8.0),振荡均匀,在2~6°C冰箱中放置10~30 min,在沸水浴中加热10~30 min,之后12000 ~14000 r/min离心10~20 min,取上清即得激活蛋白粗提液,使用双缩脲方法测定激活蛋 白提取液中激活蛋白的含量。
[0045] (5)实验结果表明?!1值5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5,激活蛋白产量分别为5.76 8/1, 7.68 g/L,9.58 g/L,9.66 g/L,9.7 g/L,8.42 g/L,8.06 g/L;所以培养基起始ρΗ6·5-7·5 较为适宜。
[0046] 六、制得的极细链格孢菌激活蛋白的生物活性测定: 1、本实验分为8组(所述发酵培养基起始pH7.0): (D发酵培养基为1 g/L 谷甾醇,5 g/L甜菜碱,15 g/L蔗糖,5 g/L玉米淀粉,20 g/L土豆淀粉,10 g/L谷氨酸,5 g/L胰蛋白胨,10 g/L黄豆粉,5 g/L硝酸钾; :'1)发酵培养基为2 g/L β-谷甾醇,4 g/L甜菜碱,15 g/L蔗糖,5 g/L玉米淀粉,20 g/L土豆淀粉,10 g/L谷氨酸,5 g/L胰蛋白胨,10 g/L黄豆粉,5 g/L硝酸钾; 議发酵培养基为3 g/L β-谷甾醇,3 g/L甜菜碱,15 g/L蔗糖,5 g/L玉米淀粉,20 g/L土豆淀粉,10 g/L谷氨酸,5 g/L胰蛋白胨,10 g/L黄豆粉,5 g/L硝酸钾; 发酵培养基为4 g/L β-谷甾醇,2 g/L甜菜碱,15 g/L蔗糖,5 g/L玉米淀粉,20 g/L土豆淀粉,10 g/L谷氨酸,5 g/L胰蛋白胨,10 g/L黄豆粉,5 g/L硝酸钾; 发酵培养基为5 g/L β-谷甾醇,1 g/L甜菜碱,15 g/L蔗糖,5 g/L玉米淀粉,20 g/L土豆淀粉,10 g/L谷氨酸,5 g/L胰蛋白胨,10 g/L黄豆粉,5 g/L硝酸钾; @发酵培养基为15 g/L蔗糖,5 g/L玉米淀粉,20 g/L土豆淀粉,10 g/L谷氨酸,5 g/L胰蛋白胨,10 g/L黄豆粉,5 g/L硝酸钾; (?)发酵培养基为200 g/L马铃薯,20 g/L蔗糖; 空白组为蒸馏水。
[0047] 2、上述中的ip~(2)组按照以下步骤分别进行实验提取激活蛋白,测定生物活性, 具体如下: (1)孢子的制备:在无菌操作台中,火焰保护下用接种针将-90~-70°C冻存管中保存的 极细链格孢菌菌丝,涂布在PSA培养基平板上,之后放入培养皿中将培养皿边缘用封口膜封 死,在20~35°C的恒温条件下,在培养箱中倒置培养,直到其变黑产孢。
[0048] (2)孢子悬浮液的制备:在无菌操作台中,用6mm打孔器在PSA培养基上打取菌丝 块,将5 mL的已灭菌的0.05%吐温-20的蒸馏水均匀的倾注在菌丝块表面,用已灭菌的玻璃 涂布棒轻轻扫过菌落表面,将孢子与菌丝分离并悬浮在无菌水中,后将菌悬液用两层纱布 过滤后储存在无菌玻璃三角瓶中备用。
[0049] (3)极细链格孢菌液的培养:在无菌操作台中,将制备好的孢子悬浮液接入装有 100mL发酵培养基的500 mL三角烧瓶中,每瓶接种10mL,将接种后的三角烧瓶放入旋转式恒 温摇床中,设置转速为120~200 r/min(优选180 r/min)180 r/min,培养温度为20~35°C (优选28°C),培养50~70h(优选60 h)后提取激活蛋白。
[0050] (4)激活蛋白的提取和含量测定:将500mL摇瓶培养的极细链格孢菌液抽滤到定性 滤纸上,将抽滤好的菌饼连同滤纸一起在烘箱中55~65°C干燥至恒重,将干燥后的菌饼在 研钵中研磨成粉末,加入激活蛋白提取缓冲液(0.02 mol/L Tris缓冲液,用HC1调pH到 8.0),振荡均匀,在2~6°C冰箱中放置10~30 min,在沸水浴中加热10~30 min,之后12000 ~14000 r/min离心10~20 min,取上清即得激活蛋白粗提液,使用双缩脲方法测定激活蛋 白提取液中激活蛋白的含量。
[0051] (5)将〔|)~(|)组提取的激活蛋白分别用蒸馏水稀释成1~20 yg/mL(优选3yg/mL) 的蛋白液,将小麦种子分别用蛋白液浸泡7~9 h(优选8 h),其它条件保持相同,每处理20 粒种子,置于铺有两层湿纱布的培养皿中于5°C培养,以蒸馏水浸泡为空白实验,每个处理 均重复2~4次;期间喷水使纱布保湿,至 少2天,一般3天后观察记录各组小麦的发芽率,结果如附图1所示。 (6)从附图1结果分析,各处理批次发芽率相差无几,但明显高于空白组,表明培养基中 加入β-谷留醇与甜菜碱与否,不影响激活蛋白的活性。
[0052] (7)从附图1结果分析,发酵培养基的优选配方为:4 g/L β-谷留醇,2 g/L甜菜碱, 15 g/L鹿糖,5 g/L玉米淀粉,20 g/L土豆淀粉,10 g/L谷氨酸,5 g/L胰蛋白胨,10 g/L黄 豆粉,5 g/L硝酸钾。
【主权项】
1. 一种极细链格孢菌激活蛋白的增产方法,其特征在于具体步骤如下:(1)孢子的制 备:在无菌操作台中,火焰保护下用接种针将-90~-70°c冻存管中保存的极细链格孢菌菌 丝,涂布在PSA培养基平板上,放入培养皿中并将培养皿边缘用封口膜封死,在20~35 °C的 恒温条件下,在培养箱中倒置培养,直到其变黑产孢;(2)孢子悬浮液的制备:在无菌操作台 中,取出培养皿中的PSA培养基平板,在PSA培养基平板上打取菌丝块,将一定量的已灭菌的 0.05%吐温-20的蒸馏水均匀的倾注在菌丝块表面,将孢子与菌丝分离并悬浮在无菌水中, 之后将菌悬液过滤后得到孢子悬浮液储存在无菌环境中备用;(3)极细链格孢菌液的培养: 在无菌操作台中,将制备好的孢子悬浮液接入装有75~200mL发酵培养基的500 mL器皿中, 每瓶接种3~20 mL,将接种后的器皿放入旋转式恒温摇床中,转速为120~200 r/min,培养 温度为20~35°C,培养50~70h后即得;(4)激活蛋白的提取和含量测定:将500mL器皿中培 养的极细链格孢菌液抽滤到定性滤纸上,将抽滤好的菌饼连同滤纸一起在烘箱中55~65°C 干燥至恒重,将干燥后的菌饼研磨成粉末,加入激活蛋白提取缓冲液,振荡均匀,在2~6°C 冰箱中放置10~30 min,在沸水浴中加热10~30 min,之后12000~14000 r/min离心10~ 20 min,取上清即得激活蛋白粗提液,使用双缩脲方法测定激活蛋白粗提液中激活蛋白的 含量。2. 根据权利要求1所述的一种极细链格孢菌激活蛋白的增产方法,其特征在于按质量 组份,发酵培养基为:1~5 g/L β-谷甾醇,1~5 g/L甜菜碱,12~18 g/L鹿糖,2~8 g/L玉 米淀粉,15~25 g/L土豆淀粉,7~13 g/L谷氨酸,2~8 g/L胰蛋白胨,7~13 g/L黄豆粉,2 ~8 g/L硝酸钾。3. 根据权利要求1所述的一种极细链格孢菌激活蛋白的增产方法,其特征在于按质量 组份,发酵培养基优选为:4 g/L β-谷留醇,2 g/L甜菜碱,15 g/L蔗糖,5 g/L玉米淀粉,20 g/L土豆淀粉,10 g/L谷氨酸,5 g/L胰蛋白胨,10 g/L黄豆粉,5 g/L硝酸钾。4. 根据权利要求1所述的一种极细链格孢菌激活蛋白的增产方法,其特征在于发酵培 养基起始PH5.5~8.5,用HC1或NaOH调成不同的pH值。5. 根据权利要求1所述的一种极细链格孢菌激活蛋白的增产方法,其特征在于激活蛋 白提取缓冲液为0.02 mol/L Tris缓冲液,用HC1调pH到8.0。6. 根据权利要求1所述的一种极细链格孢菌激活蛋白的增产方法,其特征在于极细链 格孢菌激活蛋白的生物活性的测试方法为:将提取的极细链格孢菌激活蛋白用蒸馏水稀释 成1~20 yg/mL的蛋白液,将小麦种子用蛋白液浸泡7~9h,每处理20粒种子,置于铺有至少 两层湿纱布的培养皿中,以蒸馏水浸泡为空白实验,每个处理均重复2~4次,期间喷水使纱 布保湿,至少2天后观察记录小麦的发芽率,若各处理发芽率明显高于空白对照,则认为该 蛋白处理有激活蛋白活性。
【文档编号】C12N3/00GK106085869SQ201610437036
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月20日
【发明人】龚国华, 徐迪凡, 宋会鸣, 黄晓华
【申请人】浙江龙游东方阿纳萨克作物科技有限公司
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