低磷环境下能促进台湾相思磷元素吸收的混合内生真菌的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种在低磷环境下能促进台湾相思磷元素吸收的混合内生真菌。所述混合内生真菌由丝黑粉菌属（Filobasidium sp.）F菌株与青霉属（Penicillium sp.）H菌株组成，其已于2016年1月27日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，其中，F菌株的保藏号为CGMCC No. 12102，H菌株的保藏号为CGMCC No. 11914。本发明混合内生真菌中所用菌株是从台湾相思植株中分离纯化得到的，其具有缓解低磷胁迫的作用，可在低磷环境下促进台湾相思植株对磷元素的吸收，可用于台湾相思苗木的根际土壤浇施与苗木直接接种。CGMCC No. 1210220160127CGMCC No. 1191420160127
【专利说明】
低磷环境下能促进台湾相思磷元素吸收的混合内生真菌
技术领域
[0001] 本发明涉及一种在低磷环境下能促进台湾相思磷元素吸收的混合内生真菌及其 应用。
【背景技术】
[0002] 植物内生菌的研究始于19世纪末，Vogl从黑麦草Lolium temulentum L.种子中分 离出第一株内生菌。但真正开始大量研究植株中的内生菌起始于上世纪八十年代，主要是 在温带地区、亚热带地区和热带地区的植被中开展研究。
[0003] 植物内生真菌的分布广、种类多，前人研究表明，绝大多数植物体内都能分离得到 内生真菌，由此可见内生真菌普遍存在于植物体内。在全世界范围内至少在80多个属290多 种的禾本科农作物中发现了内生菌。目前从植物中分离的内生菌根据其具有的独特功能可 以分为：固氮菌、固钾菌、固磷菌等植物促生菌、具有抗病虫害的生防菌和具有促进植物对 不良环境的修复能力的抗性菌。
[0004] 经查阅文献材料，目前有关内生真菌对台湾相思生长的影响研究还为空白。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种在低磷环境下能促进台湾相思磷元素吸收的混合内 生真菌，其所用菌株是从台湾相思植株中分离纯化得到的，其具有缓解低磷胁迫的作用，可 在低磷环境下促进台湾相思植株对磷元素的吸收，从而促进植株生长。
[0006] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案： 一种在低磷环境下能促进台湾相思磷元素吸收的混合内生真菌，其由台湾相思内生真 菌丝黑粉菌属S/7. )F菌株和青霉属（Pe/jiciDi? S/7. )H菌株组成；所述丝 黑粉菌属（/7^〇如5_/〇7^/?5/7.奸菌株和青霉属（/?6/^(^_/_/_^?5/7.)!1菌株已于2016年1月27 日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏(地址为北京市朝阳区北辰 西路1号院3号），其中^菌株的保藏号为061(：0化.12102，!1菌株的保藏号为061(：〇化. 11914。
[0007] 所用台湾相思内生真菌的分离、纯化过程包括： A、 材料:将采集得到不同年份的根、枝茎、叶分成三个部分，用自来水清洗干净，分装到 自封袋内，于4°C冰箱保存； B、 消毒:75%酒精漂洗30s-无菌水冲洗3-4次-15%的次氯酸钠漂洗(根10min，茎5min， 叶2min)-无菌水冲洗4-5次;将样品最后一次浸洗后的水盛于灭菌的小烧杯中，在平板上 划线作为对照，以检验样品的消毒是否彻底，若干天后如有菌落生成，则表明样品表面消毒 不彻底，需继续调整消毒方法； C、 接种部位的选择:叶片：叶尖部、叶中部和叶基部3个处理;枝茎:上中下分为3部位， 其中第3部位为枝茎交接处;根部:分为根尖和根基2个部分； D、 接种:将消毒后的外植体用接种刀切开，铺放在培养基表面，于28°C恒温培养箱内培 养5-7天后观察菌落生长状况;有的菌株繁殖迅速，可先将其产生的菌株进行分离纯化;生 长缓慢且数量较少的菌株可延长观察时间，直到其生长稳定后纯化； 固体培养:使用改良马丁固体培养基，配方为蛋白胨5.Og/L、酵母浸出粉2.Og/L、葡萄 糖20 · Og/L、磷酸氢二钾1 · Og/L、硫酸镁0 · 5g/L、琼脂14 · Og/L、其它为无菌水，pH值6 · 4土 0.2，培养温度为28 °C，培养方式为平板培养，培养时间为48h; E、将分离繁殖出的不同种类的内生真菌接入平板培养基进行纯化，经过2-3次点接纯 化、转接后分别得到单一菌种的上述S/7.和PaoiciDit? S/7.功能菌株。
[0008] 所得在低磷环境下能促进台湾相思磷元素吸收的混合内生真菌可制备成应用菌 液，用于台湾相思苗木的根际土壤浇施与苗木直接接种。
[0009] 所述应用菌液的制备方法是分别将丝黑粉菌属邓.）F菌株、青霉 属)H菌株接入液体培养基，摇床振荡培养，培养温度为28°C，培养时间48 ~72h，利用血球计数板计算菌液浓度，将菌液用超纯水稀释成5.5 X 106cfu/mL，再按体积比 1:1将两种菌液混合制得； 所述液体培养基为改良马丁培养基，其中蛋白胨5.0g/L、酵母浸出粉2.0g/L、葡萄糖 20 · 0g/L、磷酸氢二钾1 · 0g/L、硫酸镁0 · 5g/L、其它为无菌水、pH值6 · 4 ± 0 · 2。 所述苗木根际土壤的浇施具体是按每株l〇〇mL将所得应用菌液浇施于台湾相思的根 际。
[0010] 本发明所用菌株是从台湾相思植株中分离纯化得到的，其具有缓解低磷胁迫的作 用，可在低磷环境下促进台湾相思植株对磷元素的吸收。
[0011] 将该混合内生真菌制备的应用菌液通过浇施的方法接种于台湾相思幼苗，并在接 种15天后进行低磷胁迫试验，在胁迫90d时测定其植株磷含量。结果显示，台湾相思内生真 菌FH处理的植株磷含量均较大程度高于对照，表明其在低磷环境下对促进植株磷元素吸收 具有很大功用，进一步证实该混合内生真菌FH能在低磷环境下促进台湾相思植株对磷元素 的吸收。
【附图说明】
[0012] 图1为不同处理对台湾相思幼苗磷含量的影响。
【具体实施方式】
[0013] -种在低磷环境下能促进台湾相思磷元素吸收的混合内生真菌，其由台湾相思内 生真菌丝黑粉菌属S/7. )F菌株和青霉属（PaoiciDi? S/7. )H菌株组成；所 述丝黑粉菌属Sj〇. )F菌株和青霉属Sj〇. )H菌株已于2016年1 月27日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，其中，F菌株的保藏号 为〇6110：如.12102，!1菌株的保藏号为0610：如.11914。
[0014] 所述在低磷环境下能促进台湾相思磷元素吸收的混合内生真菌可制备成应用菌 液，用于台湾相思苗木的根际土壤浇施与苗木直接接种。
[0015] 所述应用菌液的制备方法是分别将丝黑粉菌属邓.）F菌株、青霉 属)H菌株接入液体培养基，摇床振荡培养，培养温度为28°C，培养时间48 ~72h，利用血球计数板计算菌液浓度，将菌液用超纯水稀释成5.5 X 106cfu/mL，再按体积比 1:1将两种菌液混合制得;所述液体培养基为改良马丁培养基，其中蛋白胨5.Og/L、酵母浸 出粉2. Og/L、葡萄糖20.0 g/L、磷酸氢二钾1. Og/L、硫酸镁0.5g/L、其它为无菌水、pH值6.4 土 0.2。
[0016] 为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合【具体实施方式】对本发明所述的 技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
[0017] 根际土壤浇施与苗木直接接种应用 本试验采用土培盆栽试验，试验所用材料为福建省漳州市市林业局提供的台湾相思一 年生苗。选择长势一致的台湾相思苗木定植于直径15cm、高10cm的塑料盆中。所用土壤是严 格经过熏蒸消毒的黄心土。经过混匀称量，每盆放入3kg 土壤。经过一个月的恢复性生长后， 连续三天于台湾相思根际施入100mL浓度为5.5 X 106cfu/mL的菌液FH，另用蒸馏水溶液浇 施作为空白对照CK。
[0018] 菌液制备:将供试菌株分别接入40mL的液体培养基，培养基为改良马丁培养基，其 中蛋白胨5.0g/L、酵母浸出粉2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、磷酸氢二钾1.0g/L、硫酸镁0.5g/L、 其它为无菌水、pH值6.4 ± 0.2;在恒温振荡培养箱中经过72h的培养，用无菌生理盐水按十 倍稀释法将菌液稀释，利用血球计数板计算菌液浓度，然后将菌液用超纯水稀释成5.5 X 106cfu/mL，再按体积比1:1将两种菌液混合制得。
[0019] 低磷胁迫试验设计 盆栽试验土壤的基质为黄心土，经测定该土壤中各养分物质见表1。接种15天后进行低 磷胁迫试验处理主要是让接种菌株侵入植株。
[0020] 本试验设计了 4个磷处理水平，分别为:重度胁迫、中度胁迫、轻度胁迫、正常条件， 每个水平3个重复(表2)。磷肥采用KH2P〇4,定期施氮肥、钾肥及其他微量元素，直至收获。低 磷胁迫于2015年5月4日进行。根据天气状况及时为台湾相思苗补充水分。
[0021 ]在胁迫90d时测定植株的磷含量。检测方法如下： (1)植株磷含量:采用钼锑抗比色法进行测定，每个样品做三个重复。
[0022]计算公式：
式中：办为磷含量，g/kg;c为从工作曲线上查得显色液磷(P)的浓度，yg/mL;V为显色液 体积，50mL; m为烘干样品质量，g; ts为分取倍数。
[0023] (2)数据处理 数据整理与作图采用Excel2003，数据的统计学分析采用SPSS20.0。
[0024] 图1为不同处理对台湾相思幼苗磷含量的影响。如图1所示，从地上部分来看，在重 度胁迫下，菌株FH处理的台湾相思幼苗植株磷含量明显高于对照组（sig=0.121，显著水平 为0.05)，磷含量为对照组的1.26倍，在中度胁迫下，其磷含量极显著高于对照组（sig= 0.005,显著水平为0.01)，磷含量为对照组的1.24倍;从地下部分来看，在重度胁迫和中度 胁迫下，菌株FH处理的台湾相思幼苗植株磷含量均极显著高于对照组（sig=0.000，显著水 平为0.01)，分别为对照组的1.62倍和1.52倍，说明在低磷胁迫下，菌株FH具有缓解低磷胁 迫的作用，对促进台湾相思吸收磷元素有积极作用。
[0025] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与 修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
【主权项】
1. 一种在低磷环境下能促进台湾相思磷元素吸收的混合内生真菌，其特征在于:该混 合内生真菌由台湾相思内生真菌丝黑粉菌属SjO. )F菌株和青霉属 SjO. )H菌株组成；所述丝黑粉菌属（FiioAasit/i? SjO. )F菌株和青霉属 (PaoiciDi? SjO. )H菌株已于2016年1月27日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生 物中心登记保藏，其中，F菌株的保藏号为CGMCC No. 12102，H菌株的保藏号为CGMCC No. 11914。2. -种如权利要求1所述在低磷环境下能促进台湾相思磷元素吸收的混合内生真菌的 应用，其特征在于:将所述混合内生真菌制备成应用菌液，用于台湾相思苗木的根际土壤浇 施与苗木直接接种。3. 根据权利要求2所述在低磷环境下能促进台湾相思磷元素吸收的混合内生真菌的应 用，其特征在于:所述应用菌液的制备方法是分别将丝黑粉菌属(〇如sic/i? s/7. )F菌 株、青霉属)H菌株接入液体培养基，摇床振荡培养，培养温度为28°C，培 养时间48~72h，利用血球计数板计算菌液浓度，将菌液用超纯水稀释成5.5 X 106cf u/mL，再 按体积比1:1将两种菌液混合制得； 所述液体培养基为改良马丁培养基，其中蛋白胨5.Og/L、酵母浸出粉2.Og/L、葡萄糖 20 · Og/L、磷酸氢二钾1 · Og/L、硫酸镁0 · 5g/L、其它为无菌水、pH值6 · 4 ± 0 · 2。
【文档编号】C12N1/14GK106085873SQ201610452325
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月22日
【发明人】吴承祯, 林晗, 周艳芬, 陈灿, 谢安强, 李键
【申请人】福建农林大学