一种黑粉菌的分离方法及所用培养基的制作方法

一种黑粉菌的分离方法及所用培养基的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种黑粉菌的分离方法及所用培养基，分离方法包括：将样品涂皿培养，所用培养基成分中不含任何氮源，按质量百分比含：碳源0.4％?1％、碳酸钙0.2％?0.6％、硫酸镁0.01?0.05％、磷酸二氢钾0.01?0.03％、琼脂粉1.2?2％，pH值6.5?7.0；该培养基中还含有能抑制细菌而不抑制真菌的抗生素；培养好后挑取白色单菌落进行摇菌培养至肉眼看出浑浊，若显微观察无其他杂菌污染，则该菌就是分离得到的目的菌株。本发明很大程度上解决了材料限制和大量杂菌污染这两大问题，对分离材料无特殊要求，并极大的提高了黑粉菌的分离纯化工作效率。
【专利说明】
一种黑粉菌的分离方法及所用培养基
技术领域
[0001] 本发明涉及一种菌种分离技术，具体涉及一种黑粉菌的分离方法及所用培养基。
【背景技术】 [0002] 黑粉菌病害是农作物的一类重要病害，例如小麦矮腥黑穗病、水稻稻粒 黑粉病、高粱黑穗病和玉米瘤黑粉病等等，可导致作物严重减产。另一方面，一些黑粉菌的 次级代谢物如甘露糖赤鲜糖醇脂和黑粉菌酸等是重要的天然表面活性剂，近几年正在被研 究开发，应用前景广阔。无论是对黑粉菌病害的研究还是对其次级代谢物的开发利用，对各 类黑粉菌的分离纯化都是相关研究中最为基础的工作。提高黑粉菌的分离纯化工作效率， 可显著缩短初始阶段的研究时长，加快科研进展。
[0003] 目前国内外公开专利中还没有专门分离黑粉菌的方法，而在一些研究论文中有分 离获得黑粉菌的相关报道。大概分为两大类：
[0004] 1)对无黑粉菌病症的材料用一般真菌的分离方法得到黑粉菌：
[0005] 这类分离方法一般从自然界中采集无黑粉菌病症的样品，经表面消毒或不消毒， 将样品水液化(加水等液体研磨等)后将液汁涂布于PDA、YH)或YM等氮源丰富的常用真菌培 养基中；在合适的温度中培养到酵母类真菌菌落长出，大量挑取疑似菌落，摇菌培养，一步 步分离得到纯化的菌株;对所有分离得到的菌株进行分子鉴定等以确定是否是黑粉菌。例 如，羊宋贞等从冰箱中取样后用PDA分离真菌，从74种真菌中得到一个黑粉菌菌株 Pseudozyma aphidis(羊宋贞，冯广达，姚青，等.家庭冰箱中的微生物种类调查[J].生物技 术通报，2013，1 (2): 195-200)，而分离过程则一般需要挑取比74更大数量的菌落，最终才获 得这一个黑粉菌菌株。再例如，严亚萍等对底泥和土壤样品用YM培养基对酵母类真菌进行 分离，在分离得到的201株酵母类菌株中只有1株为黑粉菌(严亚萍，李治滢，董明华，等.云 南阳宗海酵母菌种群结构及产胞外酶测试[J].微生物学报，2013,53(11): 1205-1212);同 样，分离过程需要挑取比201个菌株更多数量的菌落进行一步步分离，并逐一鉴定。
[0006] 该方法的缺点是:a、一般的真菌分离过程目的性较差，只能从材料中尽可能多的 分离出所有疑似真菌，再从众多真菌中一一鉴定哪个菌株是黑粉菌;整个分离过程无法聚 焦于目标黑粉菌。b、基于a这样人为的判断疑似菌落的方法，有可能会遗漏、错过黑粉菌菌 落。c、此类方法针对性差，主要原因在于使用真菌常用培养基，如PDA、YM培养基等(一般都 加上抗生素，能抑制大部分细菌生长），很多数真菌都能在这些培养基上正常生长，并且在 这些培养基上生长的黑粉菌和其他酵母真菌的菌落一般都很相似，因此从众多的真菌菌落 中再进一步筛选分离出黑粉菌，难度仍较大，工作量大。d、很多酵母真菌的生长速度一般比 黑粉菌的生长速度要快，另外原材料中所含有的很多霉菌都能在真菌培养基中快速生长 (霉菌的生长速度比酵母真菌的长速更快）；因此，培养基平皿里一般长满了各种各样的真 菌菌落，其中丝状真菌（如霉菌)和一些酵母真菌的长势都超过黑粉菌，在黑粉菌还没长成 可见的菌落时已经被其它菌的菌落所覆盖，很难挑到黑粉菌菌株。e、需要对分离出来的大 量菌株进行分子鉴定，耗费大量人力和财力。
[0007] 从文献报道来看，此类方法获得的所有真菌中黑粉菌占0.5%左右，而在分离过程 中黑粉菌菌落的比例甚至更少。因此，想用上述方法从无黑粉菌病症的材料中筛选黑粉菌， 效率非常低，成功率很低。
[0008] 2)选择有黑粉菌病症的材料筛选分离黑粉菌：
[0009] 这类方法需要选取有黑粉菌病症的材料(病块组织或其中的成熟黑孢子），对材料 进行消毒处理后，再将病块内部组织或认为含有黑粉菌菌体或孢子的液体置于TOA或YEPS 等培养真菌常用的培养基上进行分离筛选黑粉菌，一步步分离纯化后对所有分离得到的疑 似菌株一一进行鉴定。例如，从黑粉病植物组织中收集孢子粉，经消毒后分离黑粉菌 (Martinez C, Roux C,Jauneau A,et al. The biological cycle of Sporisorium reilianum f.sp.zeae:an overview using microscopy[J].Mycologia,2002,94(3):505-514；Zahiri A R,Babu M R,Saville B J.Differential gene expression during teliospore germination in Ustilago maydis[J].Molecular genetics and genomics, 2005,273(5) :394-403;路秀丽，姚艳飞，王宰.高粱黑粉菌的分离鉴定[J].食品科学，2011 (17): 243-245 ;高雅，石太渊，张华，等.高粱丝黑穗病菌离体培养技术[J].食品与发酵工 业，2009(12) :97-99)。又例如，对茭白茎干(茭白茎干膨大即为黑粉菌Ustilago esculenta 侵染的结果)表面消毒后，用内部组织切片等至于PDA中培养，一步步分离出黑粉菌（曹乾 超，张雅芬，崔海峰，等.菰黑粉菌分离方法的研究[J].长江蔬菜，2015(22): 195-197)。 [0010]该方法比上述方法1)有更强的针对性，然而其缺点也非常明显:a、原材料来源限 制性较大，要收集有黑粉菌病症的材料需要等待植物的发病时间，受植物的生长季节和地 域限制;常见的黑粉菌病害可能较容易收集到病症材料，而不常见的黑粉菌资源则难以收 集到;病症材料的收集较费时费力。b、虽然对原材料有表面消毒，然而仍很难避免大量的内 生真菌污染，特别是远距离(异地)采样后无法立即处理的材料，材料内部受杂菌污染的可 能性大大增加；内生菌杂菌污染程度仍很严重，分离纯化难度大。c、采样技术要求高，需要 采样人员熟悉相关植物黑粉菌发病特征、能准确把握植物组织内部黑粉菌孢子的发育状 态，如果材料内部黑粉菌孢子尚未成熟或成熟量少，能长出黑粉菌菌落的概率变小，杂菌菌 落比例则相对增大。d、平皿中各种酵母类真菌菌落与黑粉菌菌落区分不大，挑取菌落的准 确率较低。因此，该方法受到材料取样的限制性大，且杂菌污染仍是个难题。 e、需要对分离 出来的较大量的菌株进行分子鉴定，耗费较多的人力和财力。
[0011]总而言之，此类分离方法需要获得黑粉病症明显的材料，一步步分离过程中也需 要挑取较大量的菌落，并对纯化的较多菌株进行一一鉴定。材料的获得难度较大，其他酵母 类真菌的污染也较多，此方法的整体效率仍较低。

【发明内容】

[0012] 本发明的目的是提供一种黑粉菌的分离方法，对黑粉菌具有较强针对性的筛选功 能，对材料无限制，极大的降低杂菌污染率。
[0013] 本发明的技术方案为:一种黑粉菌的分离方法，包括：
[0014] 将样品涂皿培养，所用培养基为固体HFJ培养基，培养基成分中不含任何氮源，按 质量百分比含：碳源〇 . 4 % -1 %、碳酸钙0.2 % -0.6 %、硫酸镁0.01-0.05 %、磷酸二氢钾 0.01-0.03%、琼脂粉1.2-2%，pH值6.5-7.0;该培养基中还含有能抑制细菌而不抑制真菌 的抗生素;所述碳源为蔗糖、葡萄糖、阿拉伯糖、甘露醇和山梨醇中的一种或几种；
[0015] 培养好后挑取白色单菌落进行摇菌培养至肉眼看出浑浊，若显微观察无其他杂菌 污染，则该菌就是分离得到的目的菌株。
[0016] 本发明的样品为预期含有黑粉菌的任何样品。
[0017] 具体的，是在培养好的平皿中挑选无气生菌丝、无反光光泽的白色菌落。
[0018] 在一个【具体实施方式】中，所述能抑制细菌而不抑制真菌的抗生素为链霉素和头孢 霉素。
[0019] 在一个【具体实施方式】中，平皿中固体HFJ培养基的厚度不小于4毫米;若是液体样 品直接涂皿或适当稀释后涂皿，若是固体样品则加无菌水后破碎、细化样品取水液涂皿。
[0020] 在一个【具体实施方式】中，样品涂皿后，保持平皿内透气，随后将平皿倒扣置于恒温 培养箱中，24~30 °C培养3~5天。
[0021] 在一个【具体实施方式】中，挑取白色单菌落接种于加有能抑制细菌而不抑制真菌的 抗生素的液体YEPSL培养基或不加琼脂的液体HFJ培养基。
[0022]在一个【具体实施方式】中，摇菌培养是在温度为24~30°C、转速为150~200rpm的恒 温摇床中培养至肉眼看出浑浊。
[0023]若培养好后挑取的不是单菌落或是有细菌污染，需稀释后再次涂布于固体HFJ培 养基的培养皿中，再次进行分离培养。
[0024]最后对目的菌株进行种属鉴定。
[0025] 本发明还提供一种用于分离黑粉菌的培养基，培养基成分中不含任何氮源，按质 量百分比含:碳源〇.4%-1%、碳酸钙0·2%-0·6%、硫酸镁0·01-0·05%、磷酸二氢钾0·01-0.03%、琼脂粉1.2-2%，pH值6.5-7.0;所述碳源为蔗糖、葡萄糖、阿拉伯糖、甘露醇和山梨 醇中的一种或几种。
[0026] 目前报道的其他分离方法中所使用的培养基都含有丰富的氮源（如蛋白胨、酵母 提取物等），因此其他类型的微生物都能在此类培养基上快速生长;而本发明HFJ培养基中 不含任何氮源，很多微生物就无法在HFJ培养基上生长，但黑粉菌能正常生长。HFJ培养基极 大程度的抑制了其他菌类生长，提高了对黑粉菌的筛选效率。
[0027] 本发明对对象材料无限制，不管有无黑粉菌病症，只要材料中含有黑粉菌就能将 其分呙出来。
[0028] 从本发明技术方案中的分离步骤可以看出，整个分离工作简单高效，对材料无特 殊处理要求，只需简单处理样品、用一种培养基就能极大的降低杂菌污染，一次性分离到黑 粉菌菌株。若第一次挑菌不小心带有杂菌污染，经简单稀释再重复涂皿分离一次就能完成 分呙。
[0029]为提高分离黑粉菌的工作效率，本发明在第一步分离培养中对黑粉菌具有明显的 筛选效果，极大的降低杂菌污染，杂菌率减少了90%以上，避免了分离真菌常规方法中需要 挑取大量菌落并需要一一鉴定所有菌株的繁琐工作，极大的提高了分离纯化黑粉菌的效 率。
[0030]与【背景技术】中"选择有黑粉菌病症的材料进行筛选分离黑粉菌"这一技术相比较， 本发明的优点有：（1)样品取样无限制，科研人员可以从预期含有黑粉菌的各类样品中分离 得到黑粉菌，不需要等待有黑粉病发病的材料。（2)样品处理简单，只需粉碎细化样品即可； 无需消毒，并避免了实验人员对消毒剂等有害物质的接触。（3)在本发明固体HFJ分离培养 基上，很多菌类不宜生长，因此能极大程度的减少杂菌污染，杂菌污染率减少90%以上。（4) 本发明固体HFJ分离培养基上的黑粉菌一般为无气生菌丝、无反光光泽的白色菌落，同此形 态判断可极大的提高挑取目的菌落的准确性。（5)基于上述优点，本发明能极大的提高黑粉 菌的分离工作效率。
[0031] 所以，本发明很大程度上解决了材料限制和大量杂菌污染这两大问题，对分离材 料无特殊要求，并极大的提高了黑粉菌的分离纯化工作效率。本发明具有操作简单、经济实 用的特点，能广泛的从各种材料分离得到黑粉菌。
【附图说明】
[0032] 附图1为四种培养基对无黑粉菌病症凤尾竹材料的分离效果对比图。
【具体实施方式】
[0033] 本发明的一种黑粉菌的高效分离方法，在一个优选的【具体实施方式】中，包括下述 的步骤：
[0034] 1.样品米集
[0035] 样品取样无限制，可以为预期含有黑粉菌的各类样品，无需有黑粉病病症。例如， 取材于凤尾竹、芦苇、芦荻、高粱、茭白（菰）、玉米等。
[0036] A液体样品：用无菌的可密封管子装好备用。
[0037] B固体样品：24小时内使用的固体样品，用干净的保湿盒或袋子装载待用；如果固 体样品需要长距离或长时间运输，用干净的吸水性纸包裹4-10层后装入保湿盒子或袋子中 运输。
[0038]采集到的样品应尽快做分离工作。
[0039] 2.黑粉菌分离培养基的准备
[0040] 配置固体HFJ分离培养基(该名称为本发明自定义）：培养基成分中不含任何氮源， 按质量百分比，蔗糖、葡萄糖、阿拉伯糖、甘露醇和山梨醇中的一种或几种〇.4%_1 %、碳酸 钙0.2%-0.6%、硫酸镁1%504,7!120 0.01-0.05%、磷酸二氢钾1〇12?04 0.01-0.03%、琼脂 粉1 · 2-2 %，余量为水，pH值6 · 5-7 · 0。
[0041] 配置的培养基装瓶密封后经高温高压灭菌处理。灭菌好的培养基可立即使用或放 置待用。
[0042]此培养基在液体状态时、约65 °C时加入链霉素和头孢霉素，使这两种抗生素在培 养基中的终浓度均为80~120微克/毫升;在培养基凝固前倒平皿，使平皿中培养基厚度为4 ~6毫米，凝固冷却至室温后待用。平皿中培养基的厚度不宜小于4毫米，否则在后续培养中 容易失水干掉。
[0043]固体HFJ分离培养基中含有的抗生素不限制于链霉素和头孢霉素，只要能抑制细 菌而不抑制真菌的抗生素都能使用，可使用一种抗生素或同时多种抗生素。
[0044] 3.样品处理和涂皿培养
[0045] 3.1样品若是液体样品，则可以直接取50-200微升于涂皿或适当稀释后涂皿。
[0046] 3.2样品若是泥土、动植物组织等固体样品，则取1-5克样品加1-3毫升无菌水后破 碎、细化样品，尽可能使样品中含有的黑粉菌游离到水液中；样品处理过程要求所用的器具 均为无菌，尽量避免样品外的其他杂菌污染。
[0047] 3.3取样品处理后的水液50-200微升涂布于上述HFJ分离培养皿中，涂好后平皿盖 上盖子，不要封□，保持平皿内透气。随后将平皿倒扣置于恒温培养箱中，24~30°C培养3~ 5天(30 °C -般3天可培养好，24°C左右则需要4至5天）。
[0048] 4.挑取黑粉菌菌落初步分离
[0049] 在培养好的平皿中杂菌非常稀少，而无气生菌丝、无反光光泽的白色菌落一般就 是黑粉菌菌落；同为白色菌落，但形态有差异的，有可能是不同的黑粉菌类型。直接挑取此 类白色单菌落(确保挑取的是单菌落)接种于加有浓度均为80~120微克/毫升链霉素和头 孢霉素(或者换成抗细菌生长的其他抗生素）的液体YEPSL培养基(0.8~1.2 %酵母提取物、 0.3~0.5%蛋白胨和0.3~0.5%蔗糖）中。在温度为24~30°C、转速为150~200rpm的恒温 摇床中培养至肉眼看出浑浊。
[0050] 取浑浊的菌体培养液3~10微升滴入干净的载玻片中，在显微镜下观察，若无其他 杂菌污染，则该菌就是分离得到的目的菌株。
[0051] 该步骤中，所用液体YEPSL培养基可以换成常用的真菌液体培养基，或者用液体 HFJ培养基（即不加琼脂，其他组分及配比与步骤2相同；用HFJ液培养摇菌时使用盖子能滤 菌透气的瓶或管进行培养，培养时间适当增加1-3天）。液体培养基都需加有终浓度均为80 ~120微克/毫升链霉素和头孢霉素(或者换成抗细菌生长的其他抗生素）。
[0052] 5.再次纯化
[0053]若上述第4步挑取的不是单菌落或是显微镜观察中有杂菌污染，则需要再次纯化。 根据菌液浑浊度，取0.5~2微升菌液稀释于lml无菌水中，混匀后取50~100微升再次涂布 于上述HFJ分离培养皿中，再次进行分离培养。重复第4步。一般到此就能纯化出黑粉菌菌 株，黑粉菌的分离工作到此完成。
[0054] 6.菌株鉴定
[0055] 为进一步明确所分离黑粉菌是何种属，则需要进行种属鉴定。黑粉菌鉴定可以用 真菌分子鉴定的通用方法、比如ITS、18S和28S DNA序列等。
[0056] 以下通过具体实施例和对比实验对本发明进行详细的说明。
[0057] 实施例一
[0058]该实施例是从无黑粉菌病症的凤尾竹中分离黑粉菌。
[0059] 配置几种固体培养基，分别为① PDA:200g去皮马铃薯煮水后最终过滤得马铃薯汁 约800ml，加20g葡萄糖、17g琼脂粉，自然pH值，加纯水定容至1L。②YEPSL:酵母提取物1%、 蛋白胨0.4%、蔗糖0.4%和琼脂粉1.7%，自然pH值;另外，YEPSL液体培养基不加琼脂粉。③ YPD:酵母提取物1 %、蛋白胨2%、葡萄糖2 %和琼脂粉1.7 %。④HFJ分离培养基:蔗糖0.4%、 碳酸钙0.5 %、硫酸镁0.02 %、磷酸二氢钾0.02 %、琼脂粉1.5 %，调pH值至6.8。
[0060] 上述几种培养基装瓶密封，115°C、0.20Mpa高温高压灭菌18分钟。加琼脂粉的培养 基冷却至60-65Γ时加入链霉素和头孢霉素，两者终浓度均为100微克/毫升。然后倒入无菌 的平皿中培养基厚度约为5毫米，凝固冷却至室温后待用。YEPSL液体培养基用于挑取菌落 摇菌培养。
[0061] 戴一次性PE手套，用无菌剪刀，从中国农业科学院麻类研究所院内的凤尾竹上剪 取靠基部的叶片，装入干净的一次性自封袋中。放4°C冰箱内待用，并于12小时内用于分离 实验。
[0062] 研钵经110°C烘烤2小时，冷却到室温后，加入2ml无菌水;剪碎竹枝(包括竹叶和枝 条)样品，称2g混合样品，放入研钵中捣碎，搅拌均匀。各吸取100微升水液涂布于①-④四种 培养基平皿上，盖上平皿盖子后不封口，倒扣平皿放置于28°C培养箱中培养3天。
[0063] 培养结果如图1。其中从roA和YEPSL平皿上分别挑取96个酵母样菌落，从YPD中挑 取全部菌落共15个，从HFJ中挑取10个白色单菌落;分别接种于每孔含有200微升YEPSL液体 培养基(加有浓度均为100微克/毫升的链霉素和头孢霉素)的无菌96孔板中，密封后放于28 °C、180rpm转速的摇床中培养2天。
[0064] 培养好后从96孔板中取5微升菌液滴在玻片上显微镜观察，从菌体形态上判断是 否有杂菌污染和疑似黑粉菌个数，结果如表1。疑似黑粉菌是根据多种黑粉菌形态归纳的经 验作判断。在此结果中，PDA的1个和YEPSL的2个疑似黑粉菌菌落均为混合菌落，需要重复分 离纯化。
[0065] 表1无黑粉菌病症凤尾竹材料的分离效果计数
[0066]
[0067] ITS序列鉴定：提取菌株基因组DNA，用真菌ITS序列引物ITS1和1了34(1了31:5'-TCCG TAGG TGAA CCTG CGG-3'，ITS 4:5'-TCCT CCGC TTAT TGAT ATGC-3'）对这些菌株基 因组DNA进行PCR扩增，直接用PCR产物测序后在NCBI上用Blastn比对分析。结果显示，HFJ分 离出来的10个菌株均为黑粉菌科中的Pseudozyma aphidis;而YEPSL分离出来的2个疑似黑 粉菌中1个是黑粉菌Pseudozyma aphidis〇
[0068] 由图1和表1数据可见，本发明对无黑粉菌病症的材料中分离黑粉菌菌株的效率显 著提高。（图1中：PDA、YEPSL等真菌培养基中长出的绝大部分酵母类菌落为表面光滑、反光 的菌落，部分还带有其他颜色;而本发明HFJ培养基中的黑粉菌菌落为无反光光泽的白色菌 落，与其他培养基的酵母类菌落有明显区别，用肉眼可轻易区分。但由于图1按规定为黑白 图片，因而在此图片上分辨不出明显差异。）
[0069] 实施例二
[0070] 该实施例是从有黑粉菌病症的茭白中分离黑粉菌（茭白茎干膨大是茭白黑粉菌 Ustilago esculenta侵染的结果）。
[0071] 本实施例与实施例一不同的地方是：只准备HFJ固体培养基和YEPLS的固体和液体 培养基。比较这两种培养基对茎干膨大茭白材料的分离效果。其中，固体HFJ分离培养基配 比与实施例一稍微不同：葡萄糖1 %、碳酸钙0.2%、硫酸镁0.05%、磷酸二氢钾0.03%、琼脂 粉2%，pH值6.5。
[0072]从每种培养基中各挑取15个菌落进行鉴定，结果:从YEPSL培养基中分离得出的酵 母类菌落全都是酵母菌；而从HFJ培养基中分离得到有两种黑粉菌，分别是Ustilago esculenta和Pseudozyma aphidis。
[0073]其中两个黑粉菌的ITS序列测序结果分别为：
[0074] >ITS Ustilago esculenta
[0075] TTCTTGAGGTGTGGCTCGCACCTGTCTAACTAAATCGAGCTACCACATTTTAACACGGTTGCATCGGTT GGCTGTCAAACAGTGCGCGCGGCGAATTCATTTTCGCCCGCGCTCTGCGAGACGGTCGACACTTTACCAAAAACACT GTTGATACCATAGGATTTGAACGTAGATGAAACTCGACTGGTAATGCGGTCGTCTAAAATCTAAAAACAACTTTTGG CAACGGATCTCTTGGTTCTCCCATCGATGAAGAACGCAGCGAATTGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAAGTGAATC ATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCTCCCGGCAGATCTAATCTGGGGAGCATGCCTGTTTGAGGGCCGCGAATTGT TTCGAACGACAGCTTTCTTATTTAGTTGAGAGAGCTGGCGGATCGGTATTGAGGGTCTTGCCATTTTCCACGGTGGC TCCCTCGAAATGCATTAGCGCATCCATTCGATAGGCAAGACGGACGAAAGCTCGTTATTTCGCCCACGTCTTTCCCT GCCGGGTTTTGATAATATCAGGACTTCGGAGAGGAAAGGCGCTGGGTCGAGGAGCTGGACGCGACGTTTTGCTGGTT GGAGTGCTTCTGAACCCCGCCCATGCCTCCTTCTCCGGAAGAGGAAGGGATTTAATTTCAATTCATCGGCCTCAGAT TGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAA
[0076] >ITS Pseudozyma aphidis
[0077] TTCTTGAGGTGTGGCTCGCACCTGTCTAACTAAATCGAGCTACCACATTTTAACACGGTTGCATCGGTTGGCTGTCA AACAGTGCGCGCGGCGATTTATTTCGCCTCCCCGCGCATTGCCGAGACGGTCGACATTTACCAAAAACACTGTTGAT ACCATAGGATTTGAACGTAGATGAAACTCGACTGGTAATGCGGTCGTCTAAAATCTAAAAACAACTTTTGGCAACGG ATCTCTTGGTTCTCCCATCGATGAAGAACGCAGCGAATTGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAAGTGAATCATCGAA TCTTTGAACGCACCTTGCGCTCCCGGCAGATCTAATCTGGGGAGCATGCCTGTTTGAGGGCCGCGAATTGTTTCGAA CGACAGCTTTCTTATTTAGTTGAGAAAGCTGGCGGATCGGTATTGAGGGTCTTGCCATCTTCCACGGTGGCTCCCTC GAAATGCATTAGCGCATCCATTCGATAGGCAAGACGGACGAAAGCTCGTTATTTCGCCCACGTCTTTCCCTGCCGGG TTTTGATAATATCAGGACTTCGGAGAGGAGAGGCGCAGGGTCGAGGAGCTGGACGCGACGTTTTGCTGGTTGGAGTG CTTCTGAACCCCGCCCATGCCTCGCTTCTTTGGAAGAGAGGAAGGGATTTAATTTCAATTCATCGGCCTCAGATTGG TAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAaTAA
[0078] 由此可见，本发明从有黑粉菌病症的材料中分离黑粉菌的效率也明显提高。
[0079] 实施例三
[0080]该实施例是从无黑粉菌病症的仓储稻谷中分离黑粉菌。
[0081 ]本实施例与实施例二不同的地方是：只准备HFJ固体培养基和YEPLS液体培养基。 其中，固体HFJ分离培养基配比与实施例二稍微不同：甘露醇1 %、碳酸钙0.4%、硫酸镁 0.04%、磷酸二氢钾0.05%、琼脂粉2%，pH值7.0。
[0082]将无黑粉菌病症的仓储稻谷研磨后进行分离培养。
[0083]最后挑取10个无反光光泽的白色菌落进行培养鉴定，ITS序列比对结果：8个菌落 是Ustilago esculenta(在NCBI中比对相似度100% );另外2个菌落与NCBI中的Pseudozyma antarctica相似度是 100%。
[0084] >ITS Ustilago esculenta(稻谷）
[0085] TTTTCTTGAGGTGTGGCTCGCACCTGTCTAACTAAATCGAGCTACCACATTTTAACACGGTTGCATCGG TTGGCTGTCAAACAGTGCGCGCGGCGAATTCATTTTCGCCCGCGCTCTGCGAGACGGTCGACACTTTACCAAAAACA CTGTTGATACCATAGGATTTGAACGTAGATGAAACTCGACTGGTAATGCGGTCGTCTAAAATCTAAAAACAACTTTT GGCAACGGATCTCTTGGTTCTCCCATCGATGAAGAACGCAGCGAATTGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAAGTGAA TCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCTCCCGGCAGATCTAATCTGGGGAGCATGCCTGTTTGAGGGCCGCGAATT GTTTCGAACGACAGCTTTCTTATTTAGTTGAGAGAGCTGGCGGATCGGTATTGAGGGTCTTGCCATTTTCCACGGTG GCTCCCTCGAAATGCATTAGCGCATCCATTCGATAGGCAAGACGGACGAAAGCTCGTTATTTCGCCCACGTCTTTCC CTGCCGGGTTTTGATAATATCAGGACTTCGGAGAGGAAAGGCGCTGGGTCGAGGAGCTGGACGCGACGTTTTGCTGG TTGGAGTGCTTCTGAACCCCGCCCATGCCTCCTTCTCCGGAAGAGGAAGGGATTTAATTTCAATTCATCGGCCTCAG ATTGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAA
[0086] >ITS Pseudozyma antarctica
[0087] TTTTCTTGAGGTGTGGCTCGCACCTGTCTAACTAAATCGAGCTACCACATTTTAACACGGTTGCATCGG TTGGCTGTCAAACAGTGCGCGCGGCGAATTCATTTTCGCCCGCGCTCTGCGAGACGGTCGACACTTTACCAAAAACA CTGTTGATACCATAGGATTTGAACGTAGATGAAACTCGACTGGTAATGCGGTCGTCTAAAATCTAAAAACAACTTTT GGCAACGGATCTCTTGGTTCTCCCATCGATGAAGAACGCAGCGAATTGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAAGTGAA TCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCTCCCGGCAGATCTAATCTGGGGAGCATGCCTGTTTGAGGGCCGCGAATT GTTTCGAACGACAGCTTTCTTATTTAGTTGAGCGAGCTGGCGGATCGGTATTGAGGGTCTTGCCATTTTCCACGGTG GCTCCCTCGAAATGCATTAGCGCATCCATTCGATAGGCAAGACGGACGAAAGCTCGTTATTTCGCCCACGTCTTTCC CTGCCGGGTTTTGATAATATCAGGACTTCGGAGAGGAAAGGCGCTGGGTCGAGGAGCTGGACGCGACGTTTTGCTGG TTGGAGTGCTTCTGAACCCCGCCCATGCCTCCTTCTCCGGAAGAGGAAGGGATTTAATTTCAATTCATCGGCCTCAG ATTGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATA
[0088] 实施例四
[0089] 该实施例是从无黑粉菌病症的芦苇茎叶中分离黑粉菌。
[0090]本实施例与实施例三不同的地方是:分离对象不同。采集芦苇茎叶，剪取少许样品 研磨后进行分离实验。
[0091] 最后挑取8个无反光光泽的白色菌落进行培养鉴定，ITS序列比对结果:8个菌落均 是Pseudozyma hubeiensis(在NCBI中比对相似度 100% )
[0092] >ITS Pseudozyma hubeiensis
[0093] TTTTCTGAGGTGTGGCTCGCACCTGTCCAACTAAACTTGAGCTACCTTTTTTATACACGGTTGCATCGG TCGGCCTGTCCAACAGTGCGGGAATGTATTTTCCGGCGCTGAGCAGACGAGTCGGCACTTTACACAAACACTTTTGA TAATCTAGGATTTGAATGAAAGTTCATTTTTATGATGGATCCGACTGGTAATGCGGTCGTCTAAATCTAAAAAACAA CTTTTGGCAACGGATCTCTTGGTTCTCCCATCGATGAAGAACGCAGCGAATTGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAA GTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCTCCCGGCAGATCTAATCTGGGGAGCATGCCTGTTTGAGGGCCGC GAATTGTTTCGAACGACAGCTTTTTTCAGTAAGAGCTGGCGGATCGGTATTGAGGGTCTTTTTGCCATTTACCGTGG CTCCCTCGAAATGCATTAGCGCATCCATTTGATAGGCGAAAGACGGACGAAAGCTTGATTTTTCGCCCTCTCTTCCC TGCCGGGTTTTGATAATATCAGGACTTCGGAGGCGGAGAAAGGGTTAGAGCTGGACGCAACGACTTTTGCTGGTTGG AGTGCTTCTGAACCCCGCCCTTTCTGTCAGAGAAAGGGATCTAATTTCAATTCATCGGCCTCAGATTGGTAGGACTA CCCGCTGAACTTAAGCATATCA
[0094] 从上述4个实施例可以看出，本发明可以从各种有黑粉菌的材料中快速、高效的分 离出黑粉菌，极大提高了黑粉菌的分离工作效率。
【主权项】
1. 一种黑粉菌的分离方法，其特征在于包括： 将样品涂皿培养，所用培养基为固体HFJ培养基，培养基成分中不含任何氮源，按质量 百分比含：碳源0.4%-1%、碳酸钙0.2%-0.6%、硫酸镁0.01-0.05%、磷酸二氢钾0.01- 0.03%、琼脂粉1.2-2 %，pH值6.5-7.0;该培养基中还含有能抑制细菌而不抑制真菌的抗生 素;所述碳源为蔗糖、葡萄糖、阿拉伯糖、甘露醇和山梨醇中的一种或几种； 培养好后挑取白色单菌落进行摇菌培养至肉眼看出浑浊，若显微观察无其他杂菌污 染，则该菌就是分离得到的目的菌株。2. 根据权利要求1所述的黑粉菌的分离方法，其特征在于样品为预期含有黑粉菌的任 何样品;所述能抑制细菌而不抑制真菌的抗生素为链霉素和头孢霉素。3. 根据权利要求1所述的黑粉菌的分离方法，其特征在于平皿中固体HFJ培养基的厚度 不小于4毫米;若是液体样品直接涂皿或适当稀释后涂皿，若是固体样品则加无菌水后破 碎、细化样品取水液涂皿。4. 根据权利要求1~3之一所述的黑粉菌的分离方法，其特征在于样品涂皿后，保持平 皿内透气，随后将平皿倒扣置于恒温培养箱中，24~30°C培养3~5天。5. 根据权利要求1所述的黑粉菌的分离方法，其特征在于培养好的平皿中挑选无气生 菌丝、无反光光泽的白色菌落。6. 根据权利要求1~3和5之一所述的黑粉菌的分离方法，其特征在于挑取白色单菌落 接种于加有能抑制细菌而不抑制真菌的抗生素的液体YEPSL培养基或不加琼脂的液体HFJ 培养基。7. 根据权利要求6所述的黑粉菌的分离方法，其特征在于摇菌培养是在温度为24~30 °C、转速为150~200rpm的恒温摇床中培养至肉眼看出浑浊。8. 根据权利要求1~3、5和7之一所述的黑粉菌的分离方法，其特征在于若培养好后挑 取的不是单菌落或是有细菌污染，需稀释后再次涂布于固体HFJ培养基的培养皿中，再次进 行分呙培养。9. 根据权利要求1所述的黑粉菌的分离方法，其特征在于目的菌株进行种属鉴定。10. -种用于分离黑粉菌的培养基，其特征在于培养基成分中不含任何氮源，按质量百 分比含：碳源〇.4%-1%、碳酸钙0.2%-0.6%、硫酸镁0.01-0.05%、磷酸二氢钾0.01- 0.03%、琼脂粉1.2-2%，pH值6.5-7.0;所述碳源为蔗糖、葡萄糖、阿拉伯糖、甘露醇和山梨 醇中的一种或几种。
【文档编号】C12R1/645GK106085880SQ201610541712
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年7月11日
【发明人】李智敏, 严准, 严理, 余永廷, 高春生, 曾粮斌, 陈佳, 程毅, 孙向平, 薛召东
【申请人】中国农业科学院麻类研究所