环二鸟苷酸环化酶及其编码基因在多环芳烃检测中的应用
【专利摘要】环二鸟苷酸环化酶及其编码基因在多环芳烃检测中的应用，涉及多环芳烃检测。菌株Cycloclasticus sp.P1保藏中心登记入册编号：CGMCC No.12328。环二鸟苷酸环化酶的DNA序列，具有如SEQ ID NO.1所示的碱基序列。环二鸟苷酸环化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。环二鸟苷酸环化酶的多环芳烃结合域序列如SEQ ID NO.3所示。用于表达环二鸟苷酸环化酶的重组载体，含有环二鸟苷酸环化酶的DNA序列。包含所述用于表达环二鸟苷酸环化酶的重组载体的宿主细胞及其表达纯化环二鸟苷酸环化酶。所述环二鸟苷酸环化酶及其编码基因可在多环芳烃检测中应用。CGMCC No.1232820160401
【专利说明】
环二鸟苷酸环化酶及其编码基因在多环芳烃检测中的应用
技术领域
[0001] 本发明涉及多环芳烃检测，具体是涉及一种环二鸟苷酸环化酶及其编码基因在多 环芳烃检测中的应用。
【背景技术】
[0002] 有机污染物多环芳烃，是指至少两个苯环以稠环形式相连的一类化合物，主要是 由于煤、石油、气体、垃圾及其他有机物不完全燃烧而形成的，通常存在于焦油、炼油、润滑 油、防锈油、橡胶、塑料等石化产品中。随着我国工业化程度的不断提高，日常生产中大量地 使用石油、煤、天然气等资源，海上石油开采、轮船运输、海损溢油、工业、生活污水排放，使 得多环芳烃的污染日益严重。多环芳烃脂溶性高，不易降解且易在生物体内积累，具有致 癌、致畸和致突变的作用，对人类健康和生态环境具有巨大的潜在危害，是全球关注的一类 环境污染物。
[0003] 在美国环保局提出的129种"优先污染物"中，多环芳烃类化合物有16种；1990年我 国提出的水中优先控制的68种污染物中，多环芳烃类化合物有7种;2005年欧盟发布的《关 于多环芳香烃的指令》限制包含苯并花(Bap)在内的16种PAHs的使用。因此，有机污染物多 环芳烃检测关系着环保、食品安全、卫生、化工生产、贸易竞争、外交等诸多方面。
[0004] 目前，针对环境及食品中的主流检测方法为高效液相色谱法(HPLC)和气相色谱一 质谱联用法(GC-MS)。近年来，有机污染物多环芳烃检测也有了新的进展，出现了新的方法， 这些方法包括毛细管电泳分析法、荧光法、免疫检测法以及表面增强拉曼散色光谱检测法。 然而，尽管上述这些方法在准确度和精密度虽然符合标准规定的要求，但在方法快速、灵 敏、简单等方面的要求还存在着较大的差距。未来，随着生物技术、计算机科学等学科的发 展，会有更多高效、便捷、快速的方法应用到PAHs检测中。
[0005] 环二鸟苷酸(cyclic diguanylate，c-di-GMP)是新近发现的在细菌中普遍存在的 第二信使分子，参与调节多种生理功能，包括细胞分化、从运动状态到生物被膜状态的转 变、致病因子产生等。细胞内c-di-GMP的产生受二鸟苷酸环化酶(diguanylate cyclase， DGC)合成和磷酸二酯酶(phosphodiesterase，PDE)降解两条途径调控。在结构上，通常DGC 含有保守的GGDEF结构域，PDE含有保守的EAL结构域。二者既可以直接作为跨膜蛋白感受外 界信号的变化，又能传递由信号传感器如REC、PAS和GAF等结构域传来的信号。接收信号后， DGC或PDE自身被激活，引起细胞内c-di-GMP水平发生变化，开启或关闭相关基因的转录和 翻译。因此，寻找到能够感应到外界环境PAHs的存在和浓度变化的DGC传感器，接收信号后， DGC自身被激活，合成c-di-GMP。
[0006] 目前尚没有任何感应PAHs的DGC的公开报道。
【发明内容】
[0007] 本发明的第一目的是提供菌株Cycloclasticus sp.Pl。
[0008] 本发明的第二目的是提供环二鸟苷酸环化酶。
[0009] 本发明的第三目的是提供环二鸟苷酸环化酶的编码基因。
[0010] 本发明的第四目的是提供环二鸟苷酸环化酶及其编码基因在多环芳烃检测中的 应用。
[0011 ] 所述菌株Cycloclasticus sp.Pl已于2016年04月01日保藏于中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物中心，地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物 研究所，邮编：100101，保藏中心登记入册编号:CGMCC No. 12328。
[0012] 所述菌株Cycloclasticus sp.Pl是从西太平洋深海沉积物中富集分离得到的一 株能利用芘为唯一碳源降解菌，也是第一株从深海环境中获得的解环菌。它能降解萘、2-甲 基萘、2,6_二甲基萘、苊、菲、蒽、芴、氧芴、硫芴、芘、联苯等多环芳烃;对PAHs降解范围广泛， 并且可以以芘为唯一碳源生长，使得该菌区别于该属的其他菌。
[0013] 所述环二鸟苷酸环化酶的DNA序列，具有如SEQ ID NO. 1所示的碱基序列。
[0014]所述环二鸟苷酸环化酶的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0015] 所述环二鸟苷酸环化酶的多环芳烃结合域序列如SEQ ID NO.3所示。
[0016] 本发明提供用于表达环二鸟苷酸环化酶的重组载体，含有环二鸟苷酸环化酶的 DNA序列。所述用于表达环二鸟苷酸环化酶的重组载体可为融合型表达载体，优选pET28a。
[0017] 本发明提供包含所述用于表达环二鸟苷酸环化酶的重组载体的宿主细胞及其表 达纯化环二鸟苷酸环化酶;所述宿主细胞可为大肠杆菌。
[0018] 所述环二鸟苷酸环化酶及其编码基因可在多环芳烃检测中应用。
[0019]所述多环芳烃类化合物包括但不限于萘、菲、荧蒽、芘、屈、苯并[α]芘等烃类化合 物。
[0020] 本发明所提供的环二鸟苷酸环化酶氨基酸序列分析表明，序列的Ν端区域为感受 外界信号的传感器PAS;传感器PAS能感应环境中的萘、菲、荧蒽、芘、屈、苯并[α]芘等芳烃类 化合物；当该环二鸟苷酸环化酶传感器PAS感应上述芳烃类化合物后，环二鸟苷酸环化酶自 身被激活，合成c-di-GMP。
[0021] 本发明为开发应用于环境PAHs的监测的生物传感器提供了相关酶与基因及监测 方法。
[0022] 本发明提供的用于编码环二鸟苷酸环化酶的DNA序列，其具有如SEQ ID NO. 1所示 的碱基序列。此外，本发明还提供了该DNA序列编码的环二鸟苷酸环化酶以及其在多环芳烃 检测的应用。该酶能够感应细胞体内及体外环境中多环芳烃类化合物激活环化酶活性产生 环二鸟苷酸，在多环芳烃的环境检测的生物传感器的开发方面具有一定研究价值。
【附图说明】
[0023]图1为等温滴定量热法（ITC)确定DGC的结合特性。
[0024]图2为等温滴定量热法（ITC)确定PAHs的结合特性。
[0025]在图1和2中，展示萘和芘分别与DGC蛋白结合的ITC数据;上图显示滴定的原始数 据;较低的面板显示滴定数据的集成和稀释校正峰面积；"Molar Ratio"表示配体（多环芳 烃)/DGC的摩尔比。
[0026]图3为P1菌DGC在不同浓度的PAHs的诱导下环二鸟苷酸环化酶活性的检测(PAHs检 测范围0~500μΜ)。
[0027] 图4为P1菌DGC在不同浓度的PAHs的诱导下环二鸟苷酸环化酶活性的检测(PAHs检 测范围0~40μΜ)。
[0028] 在图3和4中，Nap:萘;Phe:菲;Flu:荧蒽;Pyr:芘;Chr:屈;Bap:苯并[α]芘;CK:没有 任何PAHs。
【具体实施方式】
[0029]以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。
[0030] 除非另外指明，以下各实施例中所使用的生物材料、载体、菌株、试剂、试剂盒等均 可通过常规商购途径获得，其中涉及的生物基因工程操作技术，如质粒提取、酶切消化、片 段回收、核酸片段与质粒载体连接反应及克隆和筛选等，均为本领域内的常规操作或参照 相应产品的说明书进行操作。
[0031] 实施例1解环菌Cycloclasticus sp.Pl环二鸟苷酸环化基因 DGC的克隆
[0032] 1.基因组的提取：
[0033] 解环菌(Cycloclasticus sp. )P1接种于30mL培养基(培养基组成（g.L-4如下：氯 化钠 30g/L，硝酸铵lg/L，KC1 0 · 35g/L，磷酸二氢钾lg/L，磷酸氢二钾lg/L，溴化钾0 · 08g/L， 氯化钙0.05g/L，六水合氯化锶24mg/L，七水合硫酸锌1 X 10_4g/L，七水合硫酸镁3.5g/L，氯 化铁0.0 lg/L，丙酮酸钠 3g/L，柠檬酸钠 3g/L，酵母膏0.5g/L，胰蛋白胨lg/L，加 DDW至1L，调 pH 8.0。121°(：高压蒸汽灭菌20min。）中，30°C培养至对数生长期，使用细菌基因组DNA提取 试剂盒(购自北京全式金生物技术有限公司）提取基因组。
[0034] 2、扩增DGC全长序列：
[0035] 根据解环菌Cycloclasticus sp.Pl基因组已有的DGC全长DNA序列信息，在引物的 5'端和3'端分别引入BamHI和Sea頂每切位点(见横线部分），引物序列如下：
[0036] DGCf:5'-GAG AGG ATC CATGTTAAACA AAGATCAGCT-3'；
[0037] DGCr:5 '-TCT CGA GCT CTTAATAAATTCGATTTCTGCCT-3'。
[0038] PCR反应扩增体系： DNA 模板（~50ng) 1 μΕ 正向引物(10 μΜ) 1 μι 反向引物(10 μΜ) lpL Taq DNA聚合酶 1?
[0039] dNTP(10 mM ) 1 μL lOxPCR缓冲液 5pL 25 mM Mg02 4 μL DDW 补足 5(HiL。
[0040] PCR条件如下：
[0041 ] 94°C变性5min;按如下参数循环30次:94°C变性lmin 52°C退火30s，72°C延伸30s; 最后72°C延伸lOmin。
[0042]凝胶电泳分离纯化约1338bp的PCR产物，进行胶回收。将回收产物连接到PMD18T- simple，构建PMD18T-DGC重组质粒。
[0043] 3. DGC基因表达载体的构建
[0044] 采用BamHI和SacI双酶切PMD18T-DGC重组质粒和几种不同质粒(包括pET28a质粒、 pET15b质粒、pET22b质粒等），并连接酶切产物，获得相应的重组质粒，结果显示，质粒 pET28a明显优于其他质粒。
[0045] 实施例2表达解环菌DGC基因的大肠杆菌工程菌株的构建、筛选及IPTG诱导表达
[0046] 1.采用该重组质粒pET28a_DGC转化不同的宿主(包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和 毕赤酵母等），结果显示，大肠杆菌明显优于其他宿主。
[0047] 2.采用该重组质粒pET28a-DGC转化大肠杆菌DH5a，挑取单菌落，接种到装有5mL LB液体培养基的50mL离心管中，37°C，220rpm下培养8~12h。提取质粒，经PCR和双酶切筛选 获得含有DGC基因的重组表达质粒，并经过测序确认重组质粒的阅读框正确。
[0048] 3.将获得的重组质粒通过热击转化大肠杆菌，具体操作如下：取lyL重组质粒，加 入到100yL大肠杆菌Rosetta感受态细胞液中，冰上放置30min后，42°C热击90s，立即取出放 冰上2min，加入900yLLB液体培养基，37°C，220rpm下培养lh后，取150yL培养液涂布含有氯 霉素和卡拉霉素的LB固体培养基，37°C培养12h后所得的单菌落即为重组菌。提取质粒，以 质粒为模板，进行PCR验证。
[0049] 4.挑取上述中筛选出的重组菌大肠杆菌(pET28a-DGC)及含有pET28a空质粒的对 照菌大肠杆菌至含50mg/L卡拉霉素和20mg/L氯霉素的LB液体培养基中，37°C，220rpm培养 过夜。
[0050] 按2%接种量分别接种到新鲜培养液中，37°(：，220印111培养至00600约为0.6时，加 入 IPTG 至终浓度 0.8111]\1，30°(：，220邝111，诱导表达711后，8000印111，4°(：离心5111丨11，菌泥用200111]\1 Tris-HCl(pH8.0)重悬，超声破碎细胞（功率200W，超声3s，间歇4s，共3min)，6500rpm，4°C离 心5min，测定上清液的酶活。
[0051 ] 实施例3纯化重组蛋白
[0052] 1.在注射器中注满去离子水，拔掉预装柱塞子，与注射器连接，往预装柱中逐滴加 入去离子水避免空气进入。
[0053] 2.除去预装柱密封端。用5mL去离子水清洗柱子。
[0054] 3.在柱中加入0.5mL 0.1M NiS〇4。
[0055] 4.再用5mL去离子水清洗。
[0056] 5.加入5倍体积连接缓冲液后，再加入5倍体积洗脱缓冲液。
[0057] 6.柱子准备好后，用5~10倍体积的连接缓冲液平衡。
[0058] 7.用新注射器注入样品。
[0059] 8.用5~10倍体积的连接缓冲液冲洗。
[0060] 9.用2~5倍体积洗脱缓冲液洗脱。
[0061 ] 10.将Hi Trap与装柱接于FPLC上。
[0062] 11.将上述裂解液上柱。
[0063] 12.用4mL连接缓冲液冲洗柱子，两次，分别收集。
[0064] 13.用0.5mL洗脱缓冲液洗脱，四次，分别收集。
[0065] 14 · SDS-PAGE分析收集组分。
[0066] 实施例4环二鸟苷酸环化酶的多环芳烃结合特性
[0067] 使用温滴定量热法测试上述环二鸟苷酸环化酶DGC与多环芳烃结合能力。
[0068] 1.测量是使用等温滴定量热仪NANO ITC 2G，该反应在20°C下进行。
[0069] 2.使用透析缓冲液（15mM Tris，50mM NaCl，9%(v/v)glycerol，和ImM DTT，pH值 7.8的缓冲液），对DGC蛋白进行透析。
[0070] 3.将透析过的DGC蛋白质导入到样品小室，随后，等分滴定多环芳烃配体溶液。配 体溶液为多环芳烃(萘，菲，芘)溶解在DMS0中。
[0071] 4. 一系列注射方案:使用250yL注射器填充上述配体溶液。第一注射:2μΜ随后的 注射每次1〇μL。在70min的间隔总共进行25次注射。
[0072] 5.数据分析使用Nano分析软件的独立模型。由于ITC实验是在只有一个缓冲液进 行的，该结合常数是在该特定缓冲液条件下获得。
[0073]结果表明，DGC蛋白与所有测试的多环芳烃均有结合。在20°C条件下，分别计算出 了萘和芘与DGC蛋白结合的KD值是1.68 X 10_5和2.16 X 10_7M(图1和2)。这意味着，DGC具与芘 有一个更高的亲和力。
[0074] 实施例5多环芳烃(PAHs)激活环二鸟苷酸环化酶活性测定
[0075] 将制备纯化好的上述解环菌P1DGC蛋白加入2mL反应体系：终浓度为20mmol/L Tris(pH7.5)、20mmol/L NaCl、2mmol/L MgCl 2、2mmol/L GTP DGC蛋白约2mg及不同PAHs (萘、菲、荧蒽、芘、屈、苯并[a ]芘溶解在DSMO中；反应体系中每种PAHs终浓度分别为ΙμΜ、2μ Μ、5μΜ、1 ΟμΜ、20μΜ、40μΜ、80μΜ、1 ΟΟμΜ、200μΜ、500μΜ; DMS0为对照），加入超纯水至50mL，缓慢 摇摆，室温条件(22°C)下反应约2~3h。按照标准操作程序，使用EnzChd< k焦磷酸反应试剂 盒，测试上述不同浓度、不同PAHs的反应体系中环二鸟苷酸的产生量计算出该环二鸟苷酸 环化酶活性(结果如图3和4)。
[0076] 结果表明，解环菌P1DGC在体外反应体系中，感应不同PAHs(萘、菲、荧蒽、芘、屈、苯 并[a]芘）后自身被激活，合成c-di-GMP。解环菌P1DGC感应上述所有PAHs的浓度范围为1~ 500μΜ〇
[0077] 环化酶DGC的DNA序列（SEQ ID Ν0.1):
[0078] 1 ττ.ΛΛτ.ΛΛΛΤτ γγ'λτττγτ(?γ γττοττγγττ
[0079]
[0080]
[0081 ] 环化酶DGC的氨基酸序列（SEQ ID N0.2):
[0082]
[0083] 环化酶DGC的底物特异性结合域氨基酸序列（SEQ ID NO.3):
[0084]
【主权项】
1. 菌株Cycloclasticus sp.Pl，已于2016年04月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号:CGMCC No. 12328。2. 环二鸟苷酸环化酶，其特征在于其DNA序列具有如SEQ ID NO. 1所示的碱基序列。3. 如权利要求2所述环二鸟苷酸环化酶，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所 不。4. 如权利要求2所述环二鸟苷酸环化酶，其特征在于其多环芳烃结合域序列如SEQ ID NO. 3所示。5. 用于表达环二鸟苷酸环化酶的重组载体，其特征在于含有环二鸟苷酸环化酶的DNA 序列。6. 如权利要求5所述重组载体，其特征在于所述重组载体为融合型表达载体。7. 如权利要求6所述重组载体，其特征在于所述融合型表达载体为pET28a。8. 如权利要求5所述重组载体，其特征在于包含用于表达环二鸟苷酸环化酶的重组载 体的宿主细胞及其表达纯化环二鸟苷酸环化酶;所述宿主细胞可为大肠杆菌。9. 环二鸟苷酸环化酶及其编码基因在多环芳烃检测中应用。10. 如权利要求9所述应用，其特征在于所述多环芳烃类化合物包括但不限于萘、菲、荧 蒽、芘、屈、苯并[α]芘。
【文档编号】C12N1/20GK106085914SQ201610539484
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年7月11日
【发明人】邵宗泽, 王万鹏
【申请人】国家海洋局第三海洋研究所