一株具有降解T?2毒素的乳酸乳球菌（Lactococcus lactis） CAMT22361的制作方法
【专利摘要】本发明属于毒素生物处理技术领域，具体公开了一株具有降解T?2毒素的乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）CAMT22361，所述乳酸乳球菌Lactococcus lactis CAMT22361于2015年5月13日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCC NO：M 2015295。所述乳酸乳球菌Lactococcus lactis CAMT22361的发酵液与T?2毒素反应72小时后对T?2毒素降解率可以达到61％。将其应用在饲料中T?2毒素的去除，降解率达到50%以上。本发明的乳酸乳球菌Lactococcus lactis CAMT22361具有高效快速降解T?2毒素的能力，在生物降解饲料等中T?2毒素处理具有很好的应用前景。CCTCC NO：M 201529520150513
【专利说明】
_株具有降解T-2毒素的乳酸乳球菌(Z_aciOcocci/s /aci7s ) CAMT22361
技术领域
[0001] 本发明属于毒素生物处理技术领域，更具体地，涉及一株具有降解T-2毒素的乳酸 乳球菌Zaciococct/s _/aciis CAMT22361。
【背景技术】
[0002] T-2毒素即4,15-二乙酰氧基-8-(异戊酰氧基)-12,13-环氧单端孢霉-9-烯-3醇， 属倍半萜烯类化合物，为单端孢霉族毒素中的典型代表。主要由拟枝孢镰孢菌 SjDoiO iricoic/es)、木贼镜抱菌(Ft/sari? eqw'se ii)、梨抱镜抱菌（Ft/sari? pose)、串珠 镰孢菌(/^sari? acuffiioai腫)等真菌产生的毒性次级代谢产物。T-2毒素可以通过不同途 径对人畜的各种组织和器官产生毒害作用，尤其对增殖活跃细胞如骨髓、肝脏、淋巴细胞和 粘膜上皮细胞等危害严重，最终可致畸，甚至致癌等。1973年，联合国粮农组织(FA0)和世界 卫生组织(WHO)把T-2毒素划为自然界存在的最危险的食品污染源。T-2毒素不仅毒性强，而 且污染率较高。随着国际贸易的发展和国际粮食运输日渐频繁，加速了产毒真菌在世界范 围内的传播，导致人类食用粮与动物饲料被污染的机率加大。因此，预防产毒真菌的污染、 T-2毒素的检测以及T-2毒素的有效降解等方面的研究引起广泛的关注。目前用于去除T-2 毒素的物理法、化学法及生物法。
[0003 ]用于去除T-2毒素的物理法，如利用蒙脱石、铝硅酸盐、硅藻土、环湖精和凹凸棒石 等吸附剂，虽然对粮食或饲料中T-2毒素有较高的脱除效率，但仍达不到完全清除的效果， 甚至有的吸附剂还能将一定量的营养物质吸附掉。加热法利用热降解机制破坏毒素，该类 方法操作简单，但需要设备且需要消耗能源。紫外与γ射线光辐照照射可以破坏毒素的化 学结构，使之降解，该技术具备高效、快速和避免二次污染的优点，但需要投入辐照设备，且 福照对操作人员健康有一定的影响。
[0004] 用于去除Τ-2毒素的化学法，如氢氧化钠、氨、次氯酸钠、臭氧、阿魏酸等，化学试剂 可与毒素发生一定的化学反应，起到转化降解的作用，从而达到降低或去除的目的。总的来 说，这类方法较物理法效果好，但化学试剂可能会有一定的残留，引起二次污染。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于根据现有技术中的不足，提供了一株具有降解Τ-2毒素的新菌 株。
[0006] 本发明的目的通过以下技术方案实现： 一株具有降解Τ-2毒素 的乳酸乳球菌Zaciococcus CAMT 22361，所述乳酸乳球 菌Zaciococct/s _/aciis CAMT22361于2015年5月13日保藏于中国典型培养物保藏中心 (CCTCC)，保藏编号为CCTCC Ν0:Μ 2015295。
[0007] 所述乳酸乳球菌CAMT22361的16S rDNA序列如SEQ ID N0:1所示。
[0008] 所述乳酸乳球菌Zaciococct/s _/aciis CAMT 22361在MRS平板上菌落呈圆形、不透 明、菌落为白色突起、有光泽、边缘整齐，菌株革兰氏染色在显微镜下菌体形态为球形，革兰 氏染色呈阳性。
[0009] 将所述乳酸乳球菌Zaciococct/s hciis CAMT 22361的发酵液对T-2毒素进行降 解，在72小时后其降解率可达到61%，将其应用在饲料中T-2毒素的去除，降解率达到50%以 上。显示了其较强的降解效果。
[0010] 与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果： 本发明提供了一株具有降解T-2毒素的乳酸乳球菌CAMT22361，所述菌株能够显著降解 T-2毒素，其发酵液与T-2毒素反应72小时后对T-2毒素降解率可以达到61%。将其应用在饲 料中T-2毒素的去除，降解率达到50%以上。本发明的乳酸乳球菌CAMT22361具有高效快速降 解T-2毒素的能力，在生物降解饲料等中T-2毒素具有很好的应用前景。
【附图说明】
[0011] 图1为乳酸乳球菌CAMT22361形态特征图，A为菌落图，B为显微图。
[0012] 图2为基于乳酸乳球菌CAMT22361的16S rRNA与相关菌种的系统发育树。SHAPE \* MERGEF0RMAT 。
【具体实施方式】
[0013] 以下结合具体实施例和附图来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何 形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法 和设备。
[0014] 除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。
[0015] 实施例1 :菌株的分离与鉴定 乳酸菌分离：用灭菌海水冲洗沙虫表面，晾干，称取25 g肠道样品并剪碎。采用10倍稀 释法进行稀释，并涂布于含有1.5%|丐的MRS固体培养基上，在25 °C下培养3~5 d后观察， 挑取有溶钙圈的菌落纯化，然后进行革兰氏染色及过氧化氢酶试验。将革兰氏染色阳性、过 氧化氢酶试验阴性的菌株确认为乳酸菌，并进行斜面保存。
[0016] 具有降解T-2毒素乳酸菌的筛选:将分离到的乳酸菌接种加到每毫升含有50 ng T-2毒素的改良的MRS液体培养基中，（改良的MRS培养基配方g/L:蛋白胨10 g，牛肉膏10 g K2HP〇4 2 g，柠檬酸二铵2 g，乙酸钠 5 g，葡萄糖20 g，吐温-80 1 mL，MgS〇4.7H20 0.58 g， MnS〇4,4H20 0.25 g，蒸馏水 1000 mL，pH 6.2~6.4)，使菌的浓度达到1080?1]/11^，与不接 菌的做对照。将其放在37 °C下150 r/min摇床培养72 h。再吸取发酵液2 mL于一玻璃管 中，并加入2 mL乙酸乙酯，超声萃取10 min，旋祸混合5 min，4000 r/min离心10 min，取上 层液于另一玻璃管中，反复提取3次，合并提取液。将提取液在60 °C氮吹仪下吹干。吸取2 mL 30%甲醇水溶解，旋涡5 min，用一次性无菌注射器吸取，并经过0.22 uL滤膜过滤于样品 瓶中，通过L C - M S / M S检测。结果发现，接种菌株C A Μ T 2 2 3 61的与对照的（即没有接种 CAMT22361)相比，其Τ-2毒素的降解率为61%。由此筛选到降解Τ-2毒素能力较强的菌株 CAMT22361。
[0017] 乳酸乳球菌CAMT22361形态学和生化鉴定：在MRS平板上菌落凸起、圆形、边缘整 齐、乳白色、不透明的光滑型菌落(见图1，A);细胞为球形，革兰氏染色呈阳性(见图1，B);其 生长温度范围为10 °C~45 °C，最适生长温度是30 °C;其生长pH范围为3~10,最适pH为 6~7;不运动，能发酵麦芽糖、半乳糖、核糖、乳糖产酸，水解精氨酸，不发酵蜜二糖、棉籽糖 和松三糖，不产生硫化氢，还原0.1%的美兰牛乳，可忍受4.5%的NaCl。
[0018] 乳酸乳球菌CAMT22361基因水平鉴定：通过16S rDNA特异性引物(27F与1492R)进 行PCR扩增，27F的序列见SEQIDN0:2所示，1492R的序列见SEQIDN0 :3所示，并经生工生 物工程(上海)股份有限公司测序，并将所测基因序列与GenBank相关数据进行BLAST相 似性分析，下载相似性高的相关菌株的模式菌株序列，利用MEGA 5. 0软件，采用邻接法（ Neighbor-Joiningmethod)进行聚类分析和系统进化树构建，乳酸乳球菌CAMT22361系统 发育树见图2。
[0019] 乳酸乳球菌Lactococcus lactis CAMT22361于2015年5月13日保藏于中国典型培 养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO.M2015295。
[0020] 实施例2: 1、乳酸乳球菌CAMT22361活化 在超洁净操作台中，挑取上述乳酸乳球菌CAMT22361接种在实施例1中改良的MRS液体 培养基中（pH为6.2~6.4)，37 °C摇床培养24 h，得到活化菌液。
[0021] 2、接种发酵液 在超洁净操作台中，取一定量活化菌液，10000 r/min离心2 min，弃上清，用无菌生理 盐水洗两次沉淀后重悬到原来体积，以无菌水为空白对照，测〇D6QQ nm，并用无菌生理盐水 稀释至吸光值为0.3，制成菌悬液，并按1%的接种量将菌悬液接种在改良的MRS液体培养基 中上，使肉汤培养基的初始菌数大约为1 〇8 CFU/mL。
[0022] 3、Τ_2毒素的添加 添加 Τ-2毒素到初始菌数大约为108 CFU/mL的改良的MRS液体培养基中，Τ-2毒素初始 浓度为50.0 ng/mL。以含有50.0 ng/mL的T-2毒素的无菌PBS作为对照。悬浮液于37 °C摇床 培养72h(150 r/min)。
[0023] 4、Τ_2毒素提取与检测 菌株的发酵液取三管，每管2 mL，加入2 mL乙酸乙酯，超声萃取10 min，旋涡混合5 min，4000 r/min离心1 Omin，取上层液于另一试管中，反复提取3次，合并提取液。将提取液 在60 °C氮吹仪下吹干。吸取2 mL 30%甲醇水溶解，旋涡5 min，用一次性无菌注射器吸取， 并经过0.22 uL滤膜过滤于样品瓶中，通过LC-MS/MS检测，记录实验数据。
[0024] 其中，LC-MS/MS方法检测条件如下： 液相色谱质谱联用仪:TSQ Quantum Access，美国THERMO Fisher; 4.1色谱条件 色谱柱:Hypersil Gold (100mm X 2.1mm, 5yL);流动相：甲醇_5mmol/L乙酸铵溶液 (含0.1%甲酸）。进样量：10yL;针头到瓶底距离：1.0mm;进样速度：10.0 yL/s;淋洗体积：1500 此;淋洗速度：100 · 00yL/s; 冲洗体积：1500yL;进样速度：250.0 yL/min。梯度洗脱条件见表1。流动相:A:甲醇B: 5mmol/L乙酸铵溶液(含0· 1%甲酸） 表1
4. 2质谱条件 喷雾电压：4500V;鞘气压力：35au;辅助气压：15au;毛细管温度：270°C;碰撞压： 1.5mT〇rr。离子化模式电喷雾电离正离子(ESI+)模式，选择二级质谱中响应值较高的两个 子离子作为定性离子，响应值最高的作为定量离子进行选择离子扫描模式质谱条件优化， 结果如表2所示。
[0025] 表 2
5、 数据处理 T-2毒素的去除率计算： T-2去除率/% =( 1-样品中T-2含量/空白对照中T-2含量）X 100 计算得到本发明CAMT22361发酵72h后其发酵液T-2浓度(ng/mL)为1.663±0.064(ng/ mL)，降解率为61%。（样品中添加毒素初始浓度为50 ng/mL)。
[0026] 实施例3:乳酸乳球菌CAMT22361对南美白对虾饲料中T-2毒素的降解作用 1、乳酸乳球菌CAMT22361菌悬液制备 在超洁净操作台中，挑取斜面保存的乳酸乳球菌CAMT22361接种于MRS肉汤培养基中， 37 °C培养24~28 h，使菌悬液终浓度达到108 CFU/mL。
[0027] 2、T-2毒素毒液配制 精确称取T-2毒素标准品(Enzo，USA，纯度彡98%) 1 mg溶解在乙腈，定容至lmL，配制成 1 mg/mL T-2毒素毒液。
[0028] 3、南美白对虾带毒饵料的制备 将对虾基础饲料(进口鱼粉33%，乌贼粉4%，豆柏18%，花生柏8%，虾糠4%，矿物质预混料 1%，高筋面粉22%，鱼油1%，大豆磷脂3%，预混料5.7 %，复合维生素0.3%，粉碎至全部饲料通 过40目筛。将2 mL T-2毒素毒液均匀喷洒在1 Kg粉碎后的对虾基础饲料中，即每Kg饲料中 含2 mg T-2毒素。
[0029] 4、接种发酵液降解T-2毒素 将浓度为1〇8 CFU/mL菌悬液按8%的接种量以喷洒的方式均匀接种到含T-2毒素的南美 白对虾饵料中，同时仍以喷洒方式补加水份，使发酵混料的水分含量达45~50%，37 °C静止 发酵4天，取出晾干。
[0030] 5、南美白对虾中T-2毒素降解率检测 称取接种发酵后对奸带毒t耳料2.0 g，加入15 mL乙酸乙酯，10，000 r/min均质均勾， 超声并振荡10 min，4 000 r/min，离心10 min，取上清，残渣再加入15 mL乙酸乙酯，同样操 作，重复2次，合并上清液。将上述上清提取液用氮吹仪浓缩吹干，用1 mL 30%甲醇复溶，采 用实施例2中LC-MS/MS方法检测条件检测T-2毒素含量。
[0031] 测定后，乳酸乳球菌CAMT22361发酵后的每Kg饲料含T-2毒素0.88 mg，按T-2去除 率/% =( 1-样品中T-2含量/空白对照中T-2含量）X 100计算，T-2去除率为56%。
[0032] 实施例4:乳酸乳球菌CAMT22361对罗非鱼饲料中T-2毒素的降解作用 1、乳酸乳球菌CAMT22361菌悬液制备 在超洁净操作台中，挑取斜面保存的乳酸乳球菌CAMT22361接种于MRS肉汤培养基中， 37 °C培养24-28 h，使菌悬液终浓度达到108 CFU/mL。
[0033] 2、Τ_2毒素毒液配制 精确称取Τ-2毒素标准品(Enzo，USA，纯度彡98%) 1 mg溶解在乙腈，定容至lmL，配制成 1 mg/mL T-2毒素毒液。
[0034] 3、罗非鱼带毒饵料的制备 将罗非鱼基础饲料(麦皮10%，次粉20%，进口鱼粉12%，豆柏30%，米糠5%，Ca(H2P〇4) 2 1%，菜籽柏20%，预混料2%)混匀并粉碎，粉碎至全部饲料通过40目筛。将2 mL T-2毒素 毒液均勾喷洒在1 Kg粉碎后的对4下基础饲料中，即每Kg饲料中含2 mg T-2毒素。
[0035] 4、接种发酵液降解T-2毒素 将浓度为1〇8 CFU/mL菌悬液按8%的接种量以喷洒的方式均匀接种到含T-2毒素的罗非 鱼饵料中，仍以喷洒方式补加水份，使发酵混料终水分含量达45~50%，37 °C静止发酵4天， 取出晾干。
[0036] 5、罗非鱼饲料中T-2毒素降解率检测 称取接种发酵后罗非鱼t耳料2.0 g，加入15 mL乙酸乙酯，10，000 r/min均质均勾，超 声并振荡10 min，4 000 r/min，离心10 min，取上清，残渣再加入15 mL乙酸乙酯，同样操 作，重复2次，合并上清液。将上述上清提取液用氮吹浓缩吹干，用1 mL 30%甲醇复溶，采用 实施例2中LC-MS/MS方法条件检测T-2毒素含量。
[0037] 测定后，乳酸乳球菌CAMT22361发酵后的每Kg饲料含T-2毒素0.94 mg，按T-2去除 率/% =( 1-样品中T-2含量/空白对照中T-2含量）X 100计算，T-2去除率为53%。
【主权项】
1. 一株具有降解T-2毒素的乳酸乳球菌(Zaciococcus 2aciis)CAMT22361，其特征在 于，所述乳酸乳球菌Zaciococct/s _/aciis CAMT22361于2015年5月13日保藏于中国典型培 养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC N0:M 2015295。2. 根据权利要求1所述的乳酸乳球菌(Zaciococct/s _/aciis)CAMT22361，其特征在于， 所述乳酸乳球菌laciococcus Jaciis CAMT22361 的 16S rDNA 序列如SEQ ID NO: 1所示。
【文档编号】A23L5/20GK106085920SQ201610641387
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年8月8日 公开号201610641387.8, CN 106085920 A, CN 106085920A, CN 201610641387, CN-A-106085920, CN106085920 A, CN106085920A, CN201610641387, CN201610641387.8
【发明人】刘颖, 徐春厚, 王雅玲, 孙力军
【申请人】广东海洋大学