快速解除丙酸积累的复合菌及其制备方法和应用
【专利摘要】本发明提供了提供快速解除丙酸积累的复合菌的制备方法，该方法包括如下步骤：1)以右旋糖酐废水厌氧消化器出水为原始接种物，以丙酸钠作为碳源，进行接种培养至培养物中丙酸降解率达到50?80％，甲烷含量为30?50％；2)将步骤1)所得物转移到新鲜培养基培养，并按每ml步骤1)所得物中的培养液，加入如下细菌：Pelotomaculum schinkii 2.5?5×107个、Pelotomaculum propionicicum1?2.5×107个、Syntrophobacter wolinii 1?3×106个、Methanospirillum hungatei 0.4?1.4×107个、Methanoculleus palmolei 0.5?1.4×107个、Methanoculleus bourgensis 0.5?1.4×107个、Methanosarcina barkeri0.5?2.5×107个、Methanosarcina mazei 1?3×107个；将步骤2)所得物进行密封培养，即得所述快速解除丙酸积累的复合菌。本发明还提供了上述复合菌在厌氧消化技术中，特别在沼气发酵的应用。本发明所得复合菌能快速高效的解除丙酸的积累，大幅提升厌氧消化的效率和稳定性。
【专利说明】
快速解除丙酸积累的复合菌及其制备方法和应用
技术领域
[0001] 本发明属于发酵工程领域，具体涉及快速解除丙酸积累的复合菌及其制备方法和 应用。
【背景技术】
[0002] 厌氧消化技术常用于处理有机废物(如城市污水、工业废水和农业废料）。在厌氧 消化技术中，有机酸(丙酸、丁酸和乙酸)积累常常导致有机负荷过高和酸化现象，造成厌氧 消化工艺运行效率低、稳定性差，严重影响了该技术的广泛应用。
[0003] 丙酸是有机废弃物厌氧转化过程中的一种重要中间产物。丙酸比其它挥发性脂肪 酸更加难以降解，原因在于丙酸的降解需要更多的能量和更低的氢分压。这使得丙酸的降 解成为影响厌氧消化的效率和稳定性至关重要的问题。因此，获得高效水解丙酸的菌系，快 速解除丙酸积累，对提高厌氧消化运行效率和稳定性具有重要的意义。
[0004]然而，目前所知具有丙酸氧化能力的细菌只有为数不多几类，如Pelotomaculum和 Methanospirillum。然而，现有技术中，对丙酸实现完全水解通常需要三个月以上，即使在 2013年实现了对水解周期的缩短，但对高浓度丙酸却无法实现很好的水解。
[0005] 因此，亟待寻找能够快速且高效水解丙酸的菌系。
【发明内容】
[0006] 针对现有技术的缺点，本发明的目的之一在于提供快速解除丙酸积累的复合菌的 制备方法，该方法包括如下步骤：
[0007] 1)以右旋糖酐废水厌氧消化器出水为原始接种物，以丙酸钠作为碳源，进行接种 培养至培养物中丙酸降解率达到50-80%，甲烷含量为30-50% ;
[0008] 2)将步骤1)所得物转移到新鲜培养基培养，并按每ml步骤1)所得物中的细胞，加 入如下细菌：
[0009]
[0010] 3)将步骤2)所得物进行密封培养，即得所述快速解除丙酸积累的复合菌。
[0011] 丙酸的厌氧氧化反应是一个吸热反应（吉布斯自由能AG>0)，不能自发发生。但 是，当其与氢营养型的产甲烷菌共培养时，氢营养型产甲烷菌将其产生的氢气转化为甲烷， 降低反应体系中的氢分压，此时AG〈0,丙酸的厌氧氧化过程可以自发进行，这一过程也可 称为丙酸的互营氧化。
[0012] 然而，虽然研究人员对上述原理已然知晓，但如何稳定而高效的解除丙酸积累，是 一直尚未攻克的难题。
[0013] 本发明的发明人经过大量实验的摸索发现，当将上述细菌进行互配时，可以显著 的促进丙酸的积累的解除。如本发明的一个实施例所示，由本发明制备方法所得复合菌可 以在启动后11天内便可完全的水解浓度高达15000m g//L的丙酸钠。原因可能在于本发明复 合菌系对包含丁酸和乙酸在内的有机酸均有较好的水解功能，从而维持了厌氧发酵的正常 运行。但尽管有如此推测，本发明所得的效果依然令人惊讶。
[0014] 优选的，在步骤1)接种时，接种量为1-20 %，培养条件为于25-55°C、pH= 6.0-9.0 下密封培养。
[0015] 本发明的发明人通过大量的生理生化实验发现，在上述培养条件下所得的效果较 好。
[0016] 优选的，步骤1)中，丙酸钠的添加量为1000-15000mg/L。
[0017] 优选的，步骤1)和步骤2)中所用培养基，按每升培养基计，包括lg NH4Cl，lg酵母 粉，lg胰蛋白胨，〇.5g半胱氨酸盐酸盐，50ml大量元素溶液，10ml微量元素溶液，10ml维生素 141，10mg 刃天青；所述大量元素每升包括 6g KH2P〇4，12g NaCl，2g MgCl2.6H20，1.6g CaCl2 · 2H20;所述微量元素溶液每升包括12.8g氨基三乙酸，1.35g FeCl3 · 6H20,0.1g MnCl2 · 4H20,0.1g C0CI2 · 6H20,0. lg ZnCl2,0.025g CuCl2 · 2H20,0 . Olg H3B03,0.024g Na2Mo〇4 · 2H20，lg NaCl，0.12g NiCh · 6H20,0.026g Na2Se03 · 5H20。
[0018] 优选的，步骤3)中培养条件为:培养温度为25-55°C，pH为6.0-9.0。
[0019] 本发明的另一个目的在于提供上述方法制备得到的复合菌。
[0020] 本发明的另一个目的在于提供上述复合菌在厌氧消化上的应用，特别是在沼气发 酵上的应用。
[0021]本发明的有益效果:本发明所得复合菌能快速高效的解除丙酸的积累，可以在8天 内完全水解浓度为3000mg/L的丙酸钠，对于浓度高达15000mg/L的丙酸钠也可以在11天内 完全水解;本发明所得复合菌解除了发酵酸化带来的不利影响，使得厌氧消化的效率和稳 定性大为提升。
【附图说明】
[0022]图1为本发明复合菌对丙酸的水解能力图；
[0023]图2为复合菌群对pH的适应能力图；
[0024]图3为复合菌群对丙酸钠的代谢能力图。
【具体实施方式】
[0025]下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是以下实施例只是用 于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练 人员根据上述
【发明内容】
所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。 [0026]下述实施例中所用的BCTY培养基的配方为:按每升培养基计，由lg NH4Cl，lg酵母 粉，lg胰蛋白胨，〇.5g半胱氨酸盐酸盐，50ml大量元素溶液，10ml微量元素溶液，10ml维生素 141，10mg 刃天青；所述大量元素每升包括 6g KH2P〇4，12g NaCl，2g MgCl2.6H20，1.6g CaCl2 · 2H20;所述微量元素溶液每升包括12.8g氨基三乙酸，1.35g FeCl3 · 6H20,0.1g MnCl2 · 4H20,0.1g C0CI2 · 6H20,0. lg ZnCl2,0.025g CuCl2 · 2H20,0 . Olg H3B03,0.024g Na2Mo〇4 · 2H20，lg NaCl，0.12g NiCh · 6H20,0.026g Na2Se03 · 5H20组成。
[0027] 实施例1
[0028] 配制厌氧的BCTY培养液，加入终浓度为3000mg/L的丙酸钠，分装150ml于250ml厌 氧瓶中，接种10% (V/ν)右旋糖酐废水厌氧消化器出水，密封，40°C静止培养。待丙酸降解率 达到80%，甲烷含量为50%左右，按照以下三种方案添加功能菌株(个细胞/ml培养液）：
[0029] 方案一 ：Pelotomaculum schinkii 2 · 5 X 107，Pelotomaculum propionicicum 1 X 107，Syntrophobacter wolinii 1 X 106，Methanospiri 1 lum hungate i 4X106， Methanoculleuspalmolei 5X 106，Methanoculleus bourgensis 5X 106，Methanosarcina barkeri 5X 106，Methanosarcina mazei 1X107。
[0030] 方案二：Pelotomaculum schinkii 4 X 107，Pelotomaculum propionicicum 1.5 X 107，Syntrophobacter wolinii 3 X 106，Methanospiri 1 lum hungatei 1.4X107， Methanoculleuspalmolei 1X 107，Methanoculleus bourgensis 1X 107，Methanosarcina barkeri 1 ·5X 107，Methanosarcina mazei 2X107。
[0031] 方案三：Pelotomaculum schinkii 5 X 107，Pelotomaculum propionicicum 2.5 X 107，Syntrophobacter wolinii 3 X 106，Methanospiri 1 lum hungatei 1.4X107， Methanoculleuspalmolei 1 · 4 X 107，Methanocul leus bourgensis 1.4X107， Methanosarcina barkeri 2·5X107，Methanosarcina mazei 3 X107；
[0032] 密封，40°C静止培养，监测丙酸降浓度和甲烷产量，结果见图1。实施例2复合菌群 对pH的适应能力
[0033] 配制厌氧的BCTY培养液，加入终浓度为3000mg/L的丙酸钠，分装150ml于250ml厌 氧瓶中，接种20% (V/V)右旋糖酐废水厌氧消化器出水，密封，20°C静止培养。待丙酸降解率 达到70 %，甲烷含量为40 %左右，按照以下方案添加功能菌株（个细胞/ml培养液）： Pelotomaculum schinki i 5 X 107，Pelotomaculumpropionicicum 2.5Χ107， Syntrophobacter wolinii 3 X 106，Methanospiri 1 lum hungate i 1.4X107， Me thanocul 1 euspalmo 1 e i 1 · 4 X 107，Methanocul leus bourgensis 1.4X107， Methanosarcina barkeri 2 · 5 X 107，Methanosarcina mazei 3X107。
[0034] 密封，20°C静止培养，获得水解丙酸产甲烷复合菌群。将获得的菌群分别接种于pH 6.0，pH 7.0，pH 8.0，pH 9.0的新鲜BCTY培养基中，接种量20%(V/V)，丙酸终浓度为 3000mg/L，监测丙酸浓度和甲烷产量，结果见图2。
[0035]实施例3复合菌群对丙酸钠的代谢能力
[0036] 配制厌氧的BCTY培养液，加入终浓度为10000mg/L的丙酸钠，分装150ml于250ml厌 氧瓶中，接种1%(v/v)右旋糖酐废水厌氧消化器出水，密封，55°C静止培养。待丙酸降解率 达到50 %，甲烷含量为30 %左右，按照以下方案添加功能菌株（个细胞/ml培养液）： Pelotomaculum schinki i 5 X 107，Pelotomaculumpropionicicum 2.5Χ107， Syntrophobacter wolinii 3 X 106，Methanospiri 1 lum hungate i 1.4X107， Me thanocul 1 euspalmo 1 e i 1 · 4 X 107，Methanocul leus bourgensis 1.4X107， Methanosarcina barkeri 2.5X 107,Methanosarcina mazei 3X107。
[0037] 密封，55°C静止培养，获得水解丙酸产甲烷复合菌群。将获得的菌群接种于pH 7.0 的新鲜BCTY培养基中，接种量1 % (V/V)，丙酸终浓度分别为lg/L，3g/L，5g/L，7g/L，10g/L， 15g/L，20g/L，30g/L，密封，40 °C静止培养，监测培养液中的丙酸相对含量，结果见图3。
[0038] 丙酸相对含量=监测时发酵液中的丙酸浓度(mg/L)/培养液中的初始丙酸浓度 (mg/L) X100%〇
【主权项】
1. 快速解除丙酸积累的复合菌的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤： 1) 以右旋糖酐废水厌氧消化器出水为原始接种物，以丙酸钠作为碳源，进行接种培养 至培养物中丙酸降解率达到50-80%，甲烷含量为30-50% ; 2) 将步骤1)所得物转移到新鲜培养基培养，并按每ml步骤1)培养液，加入如下细菌： Pelotomaculum schinkii 2·5_5 X107个 Pelotomaculum propionicicum 1-2.5X107个 Syntrophobacter wolinii 1-3 X106个 Methanospirilium hungatei 0.4-1·4X107个 Methanoculleuspalmolei 0.5-1 ·4Χ 107 个 Methanoculleus bourgensis 0.5-1.4X107个 Methanosarcina barkeri 0 ·5_2·5 X107个 Methanosarcina mazei 1-3X107个； 3) 将步骤2)所得物进行密封培养，即得所述快速解除丙酸积累的复合菌。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤1)接种时，接种量为1-20 %，培养条 件为于25-55°C、pH=6.0-9.0下密封培养。3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，丙酸钠的添加量为1500-10000mg/L〇4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)和步骤2)中所用培养基，按每升培 养基计，包括lg NH4C1，lg酵母粉，lg胰蛋白胨，0.5g半胱氨酸盐酸盐，50ml大量元素溶液， 10ml微量元素溶液，10ml维生素141，10mg刃天青；所述大量元素每升包括6g KH2PO4,12g NaCl，2g MgCl2 · 6H20，1.6g CaCl2 · 2H20;所述微量元素溶液每升包括12.8g氨基三乙酸， 1.35g FeCb · 6H20,0.1g MnCl2 · 4H20,0.1g C0CI2 · 6H20,0.1g ZnCl2,0.025g CuCl2 · 2H20,0.01g H3B03,0.024g Na2Mo04 · 2H20,lg NaCl,0.12g N1CI2 · 6H20,0.026g Na2Se03 · 5H20〇5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中培养条件为：培养温度为25-55 Γ，ρΗ*6·0-9·0。6. 权利要求1-5所述方法制备得到的复合菌。7. 权利要求6所述的复合菌在厌氧消化上的应用。8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用为在沼气发酵上的应用。
【文档编号】C12N1/20GK106085926SQ201610725109
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年8月25日
【发明人】马诗淳, 黄艳, 凡慧, 邓宇, 施国中, 张敏, 王春芳, 尹小波
【申请人】农业部沼气科学研究所