一种防治水稻稻瘟病的复合微生物制剂及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种防治水稻稻瘟病的复合微生物制剂及其制备方法。该复合微生物制剂的原料由津岛链霉菌发酵液，紫丁香链霉菌发酵液，阿氏芽孢杆菌发酵液，美丽短芽孢杆菌发酵液组成；本发明的菌种能够全面的利用微生物种间或种内的抗生、竞争、重寄生、溶菌作用，以及通过次级代谢产物诱导水稻产生抗病性，能产生多种抗菌素如红网链霉菌素，无活菌素和缬氨霉素，能对水稻稻瘟病病原菌产生超强抑制效果；本发明中所使用的这4株菌株都是可从土壤中直接分离得到，都具有根迹促生作用，可在作物表面、植株内部或土壤中繁殖生长的同时，并定向植物根际分泌某些次生代谢产物，能够提高植物对养分的吸收、刺激植株生长起到肥料的效果。
【专利说明】
一种防治水稻稻瘟病的复合微生物制剂及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明属于农业生物防治与微生物菌剂应用技术领域，具体涉及一种防治水稻稻 瘟病的复合微生物制剂及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 水稻稻瘟病又称稻热病、叩头瘟等，是一种世界性真菌病害，对全球水稻生产造成 极大危害，被列为水稻三大病害之首，是水稻苗期和抽穗期最重要的病害，在我国所有稻区 均有发生，在病害流行年份一般造成减产10% - 20%，病害重的年份减产40%-50%，甚至颗粒 无收。20世纪90年代以来，我国稻瘟病的年发生面积均在380万hm2以上，年损失稻谷达数亿 公斤。在生产上我国目前主要是应用化学农药来防治稻瘟病，一般在苗期时采用化学杀菌 剂浸种防治苗瘟，移栽本田后使用叶面喷雾防治叶瘟与穗颈瘟。现阶段生产上主要应用春 雷霉素、三环哩或以三环哩与硫磺、三环哩与异稻瘟净复配的复配杀菌剂在苗期和抽穗期 喷雾防治稻瘟病。但稻瘟病的发生受品种、气候影响较大，对稻瘟病的发生程度、发生期的 预测预报精度不高，应用化学农药防治稻瘟病，因药剂本身没有内吸性，很难在防治适期用 药，且由于病菌对常用药剂抗药性的逐渐增强，使得防效不断下降。另外化学药剂的成倍使 用，农田生态系统已遭到严重破坏，收获后加工成的大米农药残留严重，已给人们健康带来 不可忽视的严重危胁。
[0003] 化学农药对农田生态系统的严重破坏，病原菌对药剂的抗性越来越明显。同时，化 学农药不易降解，高残留，对人畜极不安全都严重限制了在将来的农业生产上的使用。因 此，非化学性防治措施目前已成为防治水稻病害的核心方式，而生物防治则为其中最有前 途。郭坚华等在专利号2011100743369中公开了一种防治水稻纹枯病和稻瘟病的生防菌株 JH21及其生防菌剂；徐正君等在专利号2010100281327中公开了一种防治水稻稻瘟病和纹 枯病的芽孢杆菌菌株；由于病原菌的多样性和同步进化特性，现有的单一拮抗菌株由于其 作用方式单一、防治效果不稳定、生产和使用也无法达到很理想的防治效果，因此，生防菌 的很多生物功能需要依靠两株或两株以上的细菌间的协同作用，才能发挥出更好的作用。
【发明内容】
[0004] 本发明的第一目的在于提供一种防治水稻稻瘟病的复合微生物制剂。该复合微生 物制剂的原料配比为:津岛链霉菌发酵液20-40份，紫丁香链霉菌发酵液20-40份，阿氏芽孢 杆菌发酵液20-40份，美丽短芽孢杆菌发酵液20-40份。在所述微生物制剂中的津岛链霉菌， 紫丁香链霉菌，阿氏芽孢杆菌，美丽短芽孢杆菌等4种菌是从400多株微生物菌株中筛选得 到的能共生共存，能产生多种抗菌素如红网链霉菌素，无活菌素和缬氨霉素，能对水稻稻瘟 病病原菌一梨孢霉产生超强抑制效果，从而达到防治水稻稻瘟病的作用；另一方面，本发明 的菌种能够全面的利用微生物种间或种内的抗生、竞争、重寄生、溶菌作用，或者通过次级 代谢产物诱导水稻产生抗病性，增强其防病效果;再次，本发明中所使用的这4株菌株都是 可从土壤中直接分离得到，都具有根迹促生作用，可在作物表面、植株内部或土壤中繁殖生 长的同时，并定向植物根际分泌某些次生代谢产物，能够提高植物对养分的吸收、刺激植株 生长起到肥料的效果； 本发明的第二目的在于提供一种防治水稻稻瘟病的复合微生物制剂的制备方法，该方 法步骤简单，确保微生物制剂的药肥效果突出。
[0005] 为了达到上述目的，该防治水稻稻瘟病的复合微生物制剂的制备方法，包括以下 步骤： 步骤一:津岛链霉菌发酵液的制备 取出津岛链霉菌菌种保藏管，用高氏一号固体培养基划平板进行复苏，30Γ培养7天。 在平板下挑取单个菌落划线接种装有150毫升高氏一号固体培养基的茄子瓶中，在培养箱 中30°C培养6-8天，待菌苔长满茄子瓶，产生大量孢子粉即可用500毫升的无菌生理盐水洗 脱，调节孢子浓度为0.1亿cfu/ml，即为津岛链霉菌种子液； 发酵:将上述制备的津岛链霉菌种子液以1%的接种量接种至装有灭菌的600L的津岛链 霉菌发酵培养基的1000L发酵罐中，控温28-32 °C，开搅拌200r/min，前24小时，通气量为每 分钟为200L空气，24-36小时，通气量为400L，36小时后，通气量为600L，培养40-48小时，待 菌体含量达到60g/L，即可停罐，即得到津岛链霉菌发酵液； 其中，所述的高氏一号固体培养基:硝酸钾：1克，可溶性淀粉:20克，磷酸氢二钾:0.5 克，硫酸镁:. 5克，氯化钠:0.5克，硫酸亚铁:0.01克，琼脂:20克，蒸馏水补足1000ml，PH7. 2 ~7.4; 其中，所述的津岛链霉菌发酵培养基:花生柏粉3%，葡萄糖1%，石粉1%，大豆糖蜜2%，磷 酸氢二钾〇. 04%，硫酸镁0.05%，各培养基灭菌的条件为:0.10-0.15MPa，121°C灭菌30分钟。
[0006] 步骤二:紫丁香链霉菌发酵液的制备 取出紫丁香链霉菌菌种保藏管，用高氏一号固体培养基划平板进行复苏，30°c培养7 天。在平板下挑取单个菌落划线接种装有150毫升高氏一号固体培养基的茄子瓶中，在培养 箱中30°C培养6-8天，待菌苔长满茄子瓶，产生大量孢子粉即可用500毫升的无菌生理盐水 洗脱，调节孢子浓度为0.1亿cfu/ml，即为紫丁香链霉菌种子液； 发酵:将上述制备的紫丁香链霉菌种子液以1%的接种量接种至装有灭菌的600L的紫丁 香链霉菌发酵培养基的1000L发酵罐中，控温28-30°C，开搅拌200r/min，前18小时，通气量 为每分钟为300L空气，18-32小时，通气量为500L，32小时后，通气量为700L，培养40-48小 时，待菌体含量达到80g/L，即可停罐，即得到紫丁香链霉菌发酵液； 其中，所述的高氏一号固体培养基:硝酸钾：1克，可溶性淀粉:20克，磷酸氢二钾:0.5 克，硫酸镁:. 5克，氯化钠:0.5克，硫酸亚铁:0.01克，琼脂:20克，蒸馏水补足1000ml，PH7. 2 ~7.4; 其中，所述的紫丁香链霉菌发酵培养基:芝麻柏粉3%，棉柏1%，玉米淀粉2%，石粉1%，甘 蔗糖蜜3%，硫酸锰0.002%，磷酸氢二钾0.01%，硫酸镁0.02%，各培养基灭菌的条件为:0.10_ 0 · 15MPa，121°C 灭菌 30 分钟。
[0007] 步骤三，阿氏芽孢杆菌发酵液的制备 取出阿氏芽孢杆菌保藏管，用LB固体培养基分别划平板进行复苏，30°C培养48小时。在 平板下挑取单个菌落接种至装有LB固体培养基，在30 °C培养箱中培养48小时，用3000ml无 菌水将三个茄子瓶中的菌苔洗脱，接种至装有300L阿氏芽孢杆菌发酵培养基的500L发酵罐 中，开搅拌120r/min，前12小时通气量为200L/min，12小时后通气量为320L/min，30°C培养 26-36小时，待总芽孢含量不低于60亿cfu/ml，即可作为阿氏芽孢杆菌发酵液； 其中，所述LB固体培养基:酵母提取物5.0 g，蛋白胨10.0，NaC110.0 g，琼脂20 g，水 1000mL，pH7.2; 其中，所述阿氏芽孢杆菌发酵培养基：葡萄糖5g/L，玉米淀粉25 g/L，豆柏粉30 g/L， 鱼粉5 g/L，硫酸镁0.4 g/L，硫酸锰0.5 g/L，磷酸二氢钾0.5 g/L，碳酸钙5 g/L，pH7.0。各 培养基灭菌的条件为:0.10-0.15MPa，121°C灭菌30分钟。
[0008] 步骤四，美丽短芽孢杆菌发酵液的制备 取出美丽短芽孢杆菌保藏管，用营养肉汤固体培养基分别划平板进行复苏，30°C培养 48小时。在平板下挑取单个菌落接种至装有营养肉汤固体培养基，在30°C培养箱中培养48 小时，用3000ml无菌水将三个茄子瓶中的菌苔洗脱，接种至装有300L美丽短芽孢杆菌发酵 培养基的500L发酵罐中，开搅拌120r/min，前8小时通气量为200L/min，8小时后通气量为 300L/min，30°C培养24-36小时，待总芽孢含量不低于80亿cfu/ml，即可作为美丽短芽孢杆 菌发酵液； 其中，所述营养肉汤固体培养基:蛋白胨10.0 g/L，牛肉膏3.0 g/L，氯化钠5.0 g/L， 琼脂20 g/L，pH 7.2 ± 0.2; 其中，所述美丽短芽孢杆菌发酵培养基:葡萄糖8g/L，木薯粉20 g/L，菜柏粉30 g/L， 玉米浆干粉10 g/L，硫酸镁0.4 g/L，硫酸锰0.5 g/L，磷酸二氢钾0.2 g/L，碳酸钙5 g/L， pH7.0。各培养基灭菌的条件为:0.10-0.15MPa，121°C灭菌30分钟。
[0009] 步骤五，混合发酵液 将前四个步骤制备的菌液按津岛链霉菌发酵液20-40份，紫丁香链霉菌发酵液20-40 份，阿氏芽孢杆菌发酵液20-40份，美丽短芽孢杆菌发酵液20-40份，混匀，即得到防治水稻 稻瘟病的复合微生物制剂。
[0010] 其中，该复合微生物制剂在防治水稻稻瘟病的方法为叶面喷施每次2-5L该复合微 生物制剂/亩，其稀释的倍数为100-200倍，连续使用2-3次，每7-10天使用一次。
[0011] 本发明具有的优点和有益效果:?:、本发明中包含的津岛链霉菌，紫丁香链霉菌， 阿氏芽孢杆菌，美丽短芽孢杆菌等4种菌是从400多株微生物菌株中筛选得到的能共生共 存，能在植株的根，茎，叶以及土壤中能够生长繁殖，能产生多种抗菌素如红网链霉菌素，无 活菌素和缬氨霉素；它们对抑制水稻稻瘟病病原菌一梨孢霉有特别强大的效果，从而达到 超强防治水稻稻瘟病的效果，其对水稻稻瘟病的药效高，平均防效在90. 0%以上，且针对性 强;?、本发明的菌种能够全面的利用微生物种间或种内的抗生、竞争、重寄生、溶菌作用， 或者通过次级代谢产物诱导水稻产生抗病性，增强其防病效果;纖、本发明中所使用的这4 株菌株都是可从土壤中直接分离得到，都具有根迹促生作用，可在作物表面、植株内部或土 壤中繁殖生长的同时，并定向植物根际分泌某些次生代谢产物，能够提高植物对养分的吸 收、刺激植株生长起到肥料的效果；（4)、本发明复合微生物制剂对人、畜安全，属于环境友 好型，利用本发明方法防治水稻稻瘟病不易产生抗药性，本发明制备方法稳定、菌种多，相 对于单一拮抗菌，产生的拮抗物质广泛，效果显著，成本低、使用简单。
【具体实施方式】
[0012] 实施例1 一种防治水稻稻瘟病的复合微生物制剂，该微生物制剂的原料配比为:津岛链霉菌发 酵液30份，紫丁香链霉菌发酵液40份，阿氏芽孢杆菌发酵液30份，美丽短芽孢杆菌发酵液30 份。
[0013] 为了达到上述目的，该防治水稻稻瘟病的复合微生物制剂的制备方法，包括以下 步骤： 步骤一:津岛链霉菌发酵液的制备 取出津岛链霉菌菌种保藏管，用高氏一号固体培养基划平板进行复苏，30Γ培养7天。 在平板下挑取单个菌落划线接种装有150毫升高氏一号固体培养基的茄子瓶中，在培养箱 中30°C培养6-8天，待菌苔长满茄子瓶，产生大量孢子粉即可用500毫升的无菌生理盐水洗 脱，调节孢子浓度为0.1亿cfu/ml，即为津岛链霉菌种子液； 发酵:将上述制备的津岛链霉菌种子液以1%的接种量接种至装有灭菌的600L的津岛链 霉菌发酵培养基的1000L发酵罐中，控温28-32 °C，开搅拌200r/min，前24小时，通气量为每 分钟为200L空气，24-36小时，通气量为400L，36小时后，通气量为600L，培养44小时，检测其 菌体含量为65g/L，停罐，即得到津岛链霉菌发酵液； 其中，所述的高氏一号固体培养基:硝酸钾：1克，可溶性淀粉:20克，磷酸氢二钾:0.5 克，硫酸镁:. 5克，氯化钠:0.5克，硫酸亚铁:0.01克，琼脂:20克，蒸馏水补足1000ml，PH7. 2 ~7.4; 其中，所述的津岛链霉菌发酵培养基:花生柏粉3%，葡萄糖1%，石粉1%，大豆糖蜜2%，磷 酸氢二钾〇. 04%，硫酸镁0.05%，各培养基灭菌的条件为:0.10-0.15MPa，121°C灭菌30分钟。
[0014] 步骤二:紫丁香链霉菌发酵液的制备 取出紫丁香链霉菌菌种保藏管，用高氏一号固体培养基划平板进行复苏，30°C培养7 天。在平板下挑取单个菌落划线接种装有150毫升高氏一号固体培养基的茄子瓶中，在培养 箱中30°C培养6-8天，待菌苔长满茄子瓶，产生大量孢子粉即可用500毫升的无菌生理盐水 洗脱，调节孢子浓度为0.1亿cfu/ml，即为紫丁香链霉菌种子液； 发酵:将上述制备的紫丁香链霉菌种子液以1%的接种量接种至装有灭菌的600L的紫丁 香链霉菌发酵培养基的1000L发酵罐中，控温28-30°C，开搅拌200r/min，前18小时，通气量 为每分钟为300L空气，18-32小时，通气量为500L，32小时后，通气量为700L，培养42小时，检 测其菌体含量为85g/L，停罐，即得到紫丁香链霉菌发酵液； 其中，所述的高氏一号固体培养基:硝酸钾：1克，可溶性淀粉:20克，磷酸氢二钾:0.5 克，硫酸镁:. 5克，氯化钠:0.5克，硫酸亚铁:0.01克，琼脂:20克，蒸馏水补足1000ml，PH7. 2 ~7.4; 其中，所述的紫丁香链霉菌发酵培养基:芝麻柏粉3%，棉柏1%，玉米淀粉2%，石粉1%，甘 蔗糖蜜3%，硫酸锰0.002%，磷酸氢二钾0.01%，硫酸镁0.02%，各培养基灭菌的条件为:0.10_ 0 · 15MPa，121°C 灭菌 30 分钟。
[0015]步骤三，阿氏芽孢杆菌发酵液的制备 取出阿氏芽孢杆菌保藏管，用LB固体培养基分别划平板进行复苏，30°C培养48小时。在 平板下挑取单个菌落接种至装有LB固体培养基，在30 °C培养箱中培养48小时，用3000ml无 菌水将三个茄子瓶中的菌苔洗脱，接种至装有300L阿氏芽孢杆菌发酵培养基的500L发酵罐 中，开搅拌120r/min，前12小时通气量为200L/min，12小时后通气量为320L/min，30°C培养 29小时，检测其总芽孢含量为64亿cfu/ml，即可作为阿氏芽孢杆菌发酵液； 其中，所述LB固体培养基:酵母提取物5.0 g，蛋白胨10.0，NaC110.0 g，琼脂20 g，水 1000mL，pH7.2; 其中，所述阿氏芽孢杆菌发酵培养基：葡萄糖5g/L，玉米淀粉25 g/L，豆柏粉30 g/L， 鱼粉5 g/L，硫酸镁0.4 g/L，硫酸锰0.5 g/L，磷酸二氢钾0.5 g/L，碳酸钙5 g/L，pH7.0。各 培养基灭菌的条件为:0.10-0.15MPa，121°C灭菌30分钟。
[0016] 步骤四，美丽短芽孢杆菌发酵液的制备 取出美丽短芽孢杆菌保藏管，用营养肉汤固体培养基分别划平板进行复苏，30°C培养 48小时。在平板下挑取单个菌落接种至装有营养肉汤固体培养基，在30°C培养箱中培养48 小时，用3000ml无菌水将三个茄子瓶中的菌苔洗脱，接种至装有300L美丽短芽孢杆菌发酵 培养基的500L发酵罐中，开搅拌120r/min，前8小时通气量为200L/min，8小时后通气量为 300L/min，30°C培养32小时，检测其总芽孢含量为86亿cfu/ml，即可作为美丽短芽孢杆菌 发酵液； 其中，所述营养肉汤固体培养基:蛋白胨10.0 g/L，牛肉膏3.0 g/L，氯化钠5.0 g/L， 琼脂20 g/L，pH 7.2 ± 0.2; 其中，所述美丽短芽孢杆菌发酵培养基:葡萄糖8g/L，木薯粉20 g/L，菜柏粉30 g/L， 玉米浆干粉10 g/L，硫酸镁0.4 g/L，硫酸锰0.5 g/L，磷酸二氢钾0.2 g/L，碳酸钙5 g/L， pH7.0。各培养基灭菌的条件为:0.10-0.15MPa，121°C灭菌30分钟。
[0017] 步骤五，混合发酵液 将前四个步骤制备的菌液按津岛链霉菌发酵液30份，紫丁香链霉菌发酵液40份，阿氏 芽孢杆菌发酵液30份，美丽短芽孢杆菌发酵液30份，混匀，即得到防治水稻稻瘟病的复合微 生物制剂。
[0018] 实施例2平板抑菌试验 按照《植病研究法》中平板对峙培养试验方法，对实施例1制备的复合微生物制剂对稻 瘟病菌的抑制效果进行评价，待清水对照处理组病菌菌丝长满平板时统计结果如下，该复 合微生物制剂对稻瘟病菌生长抑制率为95. 44%。
[0019] 实施例3复合微生物制剂在水稻稻瘟病温室试验 每小区为6.7m2，三个重复;水稻植株长至分蘖期时接种病原菌； 接种稻瘟病菌抱子后，至对照组开始发病时第一次喷施复合微生物制剂30ml，将其稀 释100倍喷施，此后每隔7-10天喷施一次菌剂，连续三次。至水稻收获，调查防效和产量；以 20%三环唑WP(江苏丰登农化有限公司）为对照药剂。空白对照组为每次喷清水。
[0020] 试验结果：如表1所述，复合微生物制剂在温室试验中对水稻稻瘟病防效达90. 74%，远远高于三环唑处理组。同时，使用本复合微生物制剂的能够明显促进水稻植株的生 长，生物量增长率为87. 95%。
[0021 ]表1复合微生物制剂在水稻稻瘟病温室试验结果
实施例4复合微生物制剂在水稻大田中的应用效果 1、 试验选择在水稻高产区中稻中进行； 2、 试验地址选择在湖南省隆回县滩头镇一农户责任田中；在同一块有明显的稻瘟病的 田， 3、 药剂用法与用量： 试验组：出现稻瘟病后，叶面喷施每次3L该复合微生物制剂/亩，其稀释的倍数为100-200倍，连续使用3次，每7天使用一次； 对照组：出现稻瘟病后，以20%三环唑WP(江苏丰登农化有限公司）为对照药剂进行喷 施，每组使用面积为2亩。施肥水平为纯氮20 kg/667m2，P205 10kg/667m2，K20 20 kg/ 667m2，基:蘖:穗=5:2:3。喷施器械选用农民通用手动背负式喷雾器，病虫害防治及田间管 理略高于大田生产。其它管理措施相同。
[0022] 4、试验结果:从表2可以看出，本发明的复合微生物制剂相对于化学药剂在大田试 验中具有明显的优势，使用本发明的复合微生物制剂的平均亩产可以达到688kg/亩，稻瘟 病指只有3.12,而使用化学药剂的产量只有612kg，稻瘟病指高达12.45,本发明的复合微生 物制剂相对于化学药剂能够在大田上增产12.4 %，相对化学药剂对稻瘟病的防效高达 74.94%，具有显著的效果。
[0023]表2各试验组的水稻产量
【主权项】
1. 一种防治水稻稻瘟病的复合微生物制剂，其特征在于，该微生物制剂的原料配比为： 津岛链霉菌发酵液20-40份，紫丁香链霉菌发酵液20-40份，阿氏芽孢杆菌发酵液20-40份， 美丽短芽孢杆菌发酵液20-40份。2. 根据权利要求1所述的一种防治水稻稻瘟病的复合微生物制剂，其特征在于，其制备 方法，包括以下步骤： 步骤一:津岛链霉菌发酵液的制备 取出津岛链霉菌菌种保藏管，用高氏一号固体培养基划平板进行复苏，30Γ培养7天， 在平板下挑取单个菌落划线接种装有150毫升高氏一号固体培养基的茄子瓶中，在培养箱 中30°C培养6-8天，待菌苔长满茄子瓶，产生大量孢子粉即可用500毫升的无菌生理盐水洗 脱，调节孢子浓度为0.1亿cfu/ml，即为津岛链霉菌种子液； 发酵:将上述制备的津岛链霉菌种子液以1%的接种量接种至装有灭菌的600L的津岛链 霉菌发酵培养基的1000L发酵罐中，控温28-32 °C，开搅拌200r/min，前24小时，通气量为每 分钟为200L空气，24-36小时，通气量为400L，36小时后，通气量为600L，培养40-48小时，待 菌体含量达到60g/L，即可停罐，即得到津岛链霉菌发酵液； 其中，所述的高氏一号固体培养基：硝酸钾：1克，可溶性淀粉：20克，磷酸氢二钾：0.5 克，硫酸镁:. 5克，氯化钠：0.5克，硫酸亚铁：0.01克，琼脂：20克，蒸馏水补足1000ml， PH7.2~7.4; 其中，所述的津岛链霉菌发酵培养基:花生柏粉3%，葡萄糖1%，石粉1%，大豆糖蜜2%，磷 酸氢二钾〇. 04%，硫酸镁0.05%，各培养基灭菌的条件为:0.10-0.15MPa，121°C灭菌30分钟； 步骤二:紫丁香链霉菌发酵液的制备 取出紫丁香链霉菌菌种保藏管，用高氏一号固体培养基划平板进行复苏，30°C培养7 天，在平板下挑取单个菌落划线接种装有150毫升高氏一号固体培养基的茄子瓶中，在培养 箱中30°C培养6-8天，待菌苔长满茄子瓶，产生大量孢子粉即可用500毫升的无菌生理盐水 洗脱，调节孢子浓度为0.1亿cfu/ml，即为紫丁香链霉菌种子液； 发酵:将上述制备的紫丁香链霉菌种子液以1%的接种量接种至装有灭菌的600L的紫丁 香链霉菌发酵培养基的1000L发酵罐中，控温28-30°C，开搅拌200r/min，前18小时，通气量 为每分钟为300L空气，18-32小时，通气量为500L，32小时后，通气量为700L，培养40-48小 时，待菌体含量达到80g/L，即可停罐，即得到紫丁香链霉菌发酵液； 其中，所述的高氏一号固体培养基与步骤一的高氏一号固体培养基相同； 其中，所述的紫丁香链霉菌发酵培养基：芝麻柏粉3%，棉柏1%，玉米淀粉2%，石粉1%，甘 蔗糖蜜3%，硫酸锰0.002%，磷酸氢二钾0.01%，硫酸镁0.02%，各培养基灭菌的条件为:0.10_ 0 · 15MPa，121°C 灭菌 30 分钟； 步骤三，阿氏芽孢杆菌发酵液的制备 取出阿氏芽孢杆菌保藏管，用LB固体培养基分别划平板进行复苏，30°C培养48小时，在 平板下挑取单个菌落接种至装有LB固体培养基，在30 °C培养箱中培养48小时，用3000ml无 菌水将三个茄子瓶中的菌苔洗脱，接种至装有300L阿氏芽孢杆菌发酵培养基的500L发酵罐 中，开搅拌120r/min，前12小时通气量为200L/min，12小时后通气量为320L/min，30°C培养 26-36小时，待总芽孢含量不低于60亿cfu/ml，即可作为阿氏芽孢杆菌发酵液； 其中，所述LB固体培养基:酵母提取物5.0 g，蛋白胨10.0，NaCllO.O g，琼脂20 g，水 1000mL，pH7.2; 其中，所述阿氏芽孢杆菌发酵培养基：葡萄糖5g/L，玉米淀粉25 g/L，豆柏粉30 g/L， 鱼粉5 g/L，硫酸镁0.4 g/L，硫酸锰0.5 g/L，磷酸二氢钾0.5 g/L，碳酸钙5 g/L，pH7.0;各 培养基灭菌的条件为:0.10-0.15MPa，121°C灭菌30分钟； 步骤四，美丽短芽孢杆菌发酵液的制备 取出美丽短芽孢杆菌保藏管，用营养肉汤固体培养基分别划平板进行复苏，30°C培养 48小时，在平板下挑取单个菌落接种至装有营养肉汤固体培养基，在30°C培养箱中培养48 小时，用3000ml无菌水将三个茄子瓶中的菌苔洗脱，接种至装有300L美丽短芽孢杆菌发酵 培养基的500L发酵罐中，开搅拌120r/min，前8小时通气量为200L/min，8小时后通气量为 300L/min，30°C培养24-36小时，待总芽孢含量不低于80亿cfu/ml，即可作为美丽短芽孢杆 菌发酵液； 其中，所述营养肉汤固体培养基：蛋白胨10.0 g/L，牛肉膏3.0 g/L，氯化钠5.0 g/L， 琼脂20 g/L，pH 7.2 ± 0.2; 其中，所述美丽短芽孢杆菌发酵培养基：葡萄糖8g/L，木薯粉20 g/L，菜柏粉30 g/L， 玉米浆干粉10 g/L，硫酸镁0.4 g/L，硫酸锰0.5 g/L，磷酸二氢钾0.2 g/L，碳酸钙5 g/L， pH7.0，各培养基灭菌的条件为:0.10-0.15MPa，121°C灭菌30分钟； 步骤五，混合发酵液 将前四个步骤制备的菌液按津岛链霉菌发酵液20-40份，紫丁香链霉菌发酵液20-40 份，阿氏芽孢杆菌发酵液20-40份，美丽短芽孢杆菌发酵液20-40份，混匀，即得到防治水稻 稻瘟病的复合微生物制剂。3.根据权利要求1所述的一种防治水稻稻瘟病的复合微生物制剂，其特征在于，该复合 微生物制剂在防治水稻稻瘟病的方法为叶面喷施每次2-5L复合微生物制剂/亩，其稀释的 倍数为100-200倍，连续使用2-3次，每7-10天使用一次。
【文档编号】C12R1/07GK106085930SQ201610746763
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年8月29日
【发明人】蒋常德, 胡艳晖
【申请人】佛山市艳晖生物科技有限公司