食品级纳豆激酶表达菌的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种食品级纳豆激酶表达菌，该重组菌是经过改造使得基因组中含有至少一个拷贝纳豆激酶基因的地衣芽胞杆菌。优选地，该表达菌基因组中负调控因子基因hrcA失活。本发明的生产菌株符合食品级表达系统的要求，纳豆激酶基因多个拷贝无痕整合到地衣芽胞杆菌基因组中表达，表达量比现有技术显著提高显著，通过失活负调控基因hrcA，酶活力和表达量进一步提高，酶活力达到1350FU/mL，蛋白含量达1.45g/L。本发明中重组菌制备的纳豆激酶，纯度较高，可以加工成保健品或作为疗脑梗塞药物的有效成分。
【专利说明】
食品级纳豆激酶表达菌
技术领域
[0001] 本发明涉及微生物基因工程技术领域，具体涉及一种安全级别为食品级的纳豆激 酶表达菌，其中表达菌是一种重组的地衣芽胞杆菌。
【背景技术】
[0002] 日本学者Hiroyuki Sumi于1987年首次在日本传统食品纳豆中发现并且提取出具 有溶解血栓功能的活性物质--纳豆激酶(Nattokinase，NK) (Cellular and Molecular Life Sciences，1987,43(10) :1110-1111 ·)。纳豆激酶是由纳豆芽胞杆菌（Baci 1 lus subti 1 is var. natto)产生的一种具有强烈溶栓功能的蛋白酶，是一种枯草杆菌蛋白酶。该 酶不仅易于提取纯化，成本低廉，溶栓效果好，作用迅速，药效时间长，而且安全性好，无任 何毒副作用;较目前已开发研制的一些溶栓药物如尿激酶、链激酶、组织型纤溶酶原激活剂 等具有独特的优越性，可直接将纤维蛋白尤其是交联形式的纤维蛋白水解成小肽和氨基 酸，有望成为一种新型溶栓药物。
[0003] 纳豆激酶来源于传统发酵食品，生产工艺简单，无副作用，安全性高，完全符合治 疗血栓病的药品或食品基料的要求，因此有着很好的应用前景和广阔的市场。目前全世界 患有各种血栓性疾病的患者超过1500万，每年约有300万患者死亡，并且这种状况向低龄化 发展。所需的溶栓剂的潜在市场约20亿美元。
[0004] 目前，纳豆激酶的溶栓功效已经得到各方的认可。各国已开始积极开发纳豆激酶 产品。日本、韩国、朝鲜等国家已研制出多种以纳豆激酶为主要成分的产品。日本是纳豆激 酶产品的最大生产国，已有10余家大公司生产出多种以纳豆激酶为主要成分的产品上市。 近年来纳豆激酶作为功能性食品、食品添加剂和普通食品的发展也非常迅速，每年以17% ~20%的增长率逐年增加。在我国，已有多家厂商生产纳豆激酶胶囊制品，但由于生产菌株 产量过低致使市售纳豆激酶保健品与日本进口产品相比，活力单位相差很大。因此有必要 对纳豆激酶生产菌株进行改造，以大幅增加菌株产量，提高最终产品品质。
[0005] 目前国内纳豆激酶研发和生产相关的文献和专利也逐年增加，从菌种选育、发酵 生产、工艺优化、产品加工工艺等都有涉及。纳豆激酶的生产采用纳豆芽胞杆菌固态发酵开 发保健食品的研究较多（如专利文献CN201410009197)，受选育的生产菌株产酶能力和发酵 水平的限制，野生菌株发酵生产的纳豆激酶的产量和活力偏低，与进口产品还存在较大差 距。
[0006] 近年来，从分子水平研究纳豆激酶成为很多研究人员的一个主攻方向，很多研究 者在纳豆激酶基因克隆表达方面，已经从不同菌株(枯草杆菌、纳豆杆菌、解淀粉芽胞杆菌） 中克隆了纳豆激酶成熟肽基因，包括前导肽和成熟肽的纳豆激酶原基因。与传统育种相比， 依靠基因工程手段，用模式宿主如大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、酿酒酵母以及毕赤酵母等来生 产重组纳豆激酶是提高纳豆激酶产量的捷径。目前为止，利用上述几种表达系统表达的重 组纳豆激酶的产酶量和活力整体都还偏低，无法满足产业化的需求，仍需要对于生产菌株 做进一步的优化和提升，且还存在各种问题。
[0007] 当前的表达系统多以大肠杆菌表达系统为主，高表达载体常使表达产物以包涵体 的形式存在，该包涵体可以保护蛋白免受水解，但是溶栓活性较低，故常需体外诱导表现酶 活。另外，表达的蛋白背景杂蛋白很多，表达量一般不高。而且，大肠杆菌不是食品安全级的 GRAS(Generally Recognized as Safe)菌株，分泌能力差，有内毒素污染的风险，表达的重 组纳豆激酶用于保健食品和药品的生产可能存在食品安全性的问题。
[0008] 枯草芽胞杆菌表达纳豆激酶的活力不高，且分泌的多种胞内胞外蛋白酶可能会部 分降解目的产物。酿酒酵母和枯草芽胞杆菌虽然都是GRAS菌株，但同样存在分泌表达量低 的问题，且发酵周期较长。毕赤酵母表达的重组纳豆激酶同样存在发酵周期长、活力低等问 题。采用以上四种重组表达系统进行表达时，重组菌株中都转入了带有外源抗性基因的重 组质粒（如专利文献 CN201410109952，CN201410068833，CN201310562366)，甚至有些出发菌 株都含有外源抗性基因，如枯草芽胞杆菌WB600(如专利文献CN201410068833)。带游离质粒 的重组菌株，在生产过程中容易发生质粒丢失，造成菌株产酶退化，尤其是芽胞杆菌中的游 离质粒，传代过程中比较容易丢失。这些含有抗性基因重组生产菌株不符合食品级表达系 统的要求，用于保健食品和药品的生产可能存在食品安全性的问题和潜在的副作用。地衣 芽胞杆菌被认为是GRAS菌株，且能分泌大量的胞外蛋白，分泌水平是枯草芽胞杆菌的2倍以 上。尽管地衣芽胞杆菌中表达纳豆激酶也有文献报道（J Ind Microbiol Bioethanol， 2015,42(2) :287-95)，但采用的还是游离质粒表达，同样存在上述问题。
[0009] 另外，目前国内外的公司绝大部分还是通过纳豆或其它豆类的固体或半固体发酵 来生产纳豆激酶制品，发酵提取物均为混合物，大部分产品当中混有嘌呤、维生素 K2等具有 副作用的多功能因子，有苦氨味，预防和治疗血栓疾病的效果受到很大的影响。
[0010] 食品级基因表达系统必须具备如下基本条件：（1)表达宿主必须是安全的、特性清 楚而稳定的食品级微生物，如乳酸球菌、乳酸杆菌、芽胞杆菌等在食品工业中有着悠久应用 历史且被认为是GRAS的微生物；宿主菌经过遗传改造后，在食品中和人的肠道中都必须足 够稳定。（2)对于诱导型表达系统来说，诱导物必须是食品级的，如乳糖、蔗糖、嘌呤、嘧啶、 Nisin等可被人食用的物质。（3)关于载体方面必须满足以下几个标准:载体必须是食品级 的，与宿主菌一样具有安全性;能与食品共存，无抗生素抗性标记;不能使用有害化合物(如 重金属)作为载体系统的选择压力，即使载体系统对此化合物有抗性，可在工业范围或食品 生产中应用。
[0011]到目前为止，还未见有采用食品级基因表达系统生产重组纳豆芽胞杆菌的报道。
【发明内容】
[0012] 本发明的目的在于解决现有技术中的上述问题，提供一种符合食品级表达系统的 地衣芽胞杆菌重组菌。
[0013] 本发明提供的食品级纳豆激酶表达菌，是经过改造使得基因组中含有至少一个拷 贝纳豆激酶基因的地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis);纳豆激酶基因前具有启动 子，纳豆激酶基因后具有终止子。
[0014] 纳豆激酶蛋白序列和纳豆激酶基因序列均为已知，蛋白序列可以参照SEQ ID NO. 1所示序列，基因序列可以根据公开的文献例如NCBI上公布的Bacillus subtil is subsp · nattoBEST195菌株的基因组DNA序列（Accession Number AP011541)中纳豆激酶 aprN的序列进行引物设计，扩增获得。所述的纳豆激酶基因优选的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0015] 纳豆激酶基因的插入导致地衣芽胞杆菌自身的多个胞外蛋白酶基因失活，改善地 衣芽胞杆菌的分泌水平。
[0016] 优选的纳豆激酶基因拷贝数是2个、3个或4个，更优选的是3个拷贝。一般情况下， 产量是随着拷贝数增加而增加的，但是随着基因组中同一基因拷贝数增加，基因组的不稳 定性的概率会增加，从而导致产量的下降，因为超过3个拷贝，正向重复序列和反向重复序 列至少有2对，分子内的同源重组会导致基因组的不稳定;另外，随着拷贝数的增加，无痕敲 入的难度会逐渐增加，在3拷贝基础上整合第4个拷贝的难度也会较大，因为敲入载体与基 因组发生单交换的位点增加到5个。综合稳定性和操作简易性等原因，选择3个拷贝是最佳 的。
[0017] 优选地，上述食品级纳豆激酶表达菌，该表达菌基因组中负调控因子基因 hrcA失 活。负调控因子基因 hrcA失活可以进一步改善分泌水平，增加纳豆激酶的分泌量。
[0018] 优选地，以上任一所述的食品级纳豆激酶表达菌，所述纳豆激酶基因的启动子为： 纳豆激酶基因原始启动子，或来自地衣芽胞杆菌碱性蛋白酶基因（apr)的启动子(Papr);优 选纳豆激酶基因原始启动子(PaprN);所述纳豆激酶基因的终止子为纳豆激酶基因原始终 止子。
[0019] 优选地，纳豆激酶基因原始启动子序列如SEQ ID N0.4所示，地衣芽胞杆菌碱性蛋 白酶基因（apr)的启动子(Papr)序列如SEQ ID N0.3所示。纳豆激酶基因的终止子序列如 SEQIDN0.5**。
[0020] 以上任一所述的食品级纳豆激酶表达菌，该表达菌的原始菌株为CICC 10182、 CICC 10266、ATCC53926或ATCC 21415。其中优选CICC 10266和ATCC 21415,更优选用CICC 10266作为本发明的地衣芽胞杆菌原始菌株。
[0021] 其中CICC 10182全称B.licheniformis CICC 10182,购自中国工业微生物菌种保 藏管理中心（CICC) ;CICC 10266全称B.licheniformis CICC 10266,购自中国工业微生物 菌种保藏管理中心（CICC) ;ATCC 53926全称Bacillus licheniformis ATCC 53926,购自美 国模式培养物集存库;ATCC 21415全称Bacillus licheniformis ATCC 21415,购自美国模 式培养物集存库。
[0022] 上述地衣芽胞杆菌所有基因片段的扩增，均可以参照NCBI中B.licheniformis ATCC14580的基因组序列序列(Accession NumberAE017333)设计引物进行扩增获得。
[0023 ] 优选地，上述任一食品级纳豆激酶表达菌，所述纳豆激酶基因替换了地衣芽胞杆 菌基因组中的至少一个胞外蛋白酶基因，所述胞外蛋白酶基因包括apr、mpr、bpr2、vpr、epr 和 bprl。更优选 apr，bpr2 和 mpr。
[0024] apr，bpr2和mpr这三个基因表达的蛋白酶在胞外的分泌量较大，在这三个位点替 换纳豆激酶基因，使得最终胞外蛋白酶的量最少，纳豆激酶被蛋白酶降解的风险最小。
[0025] 本发明的另一目的是提供一种温敏型敲入载体，用于改造地衣芽胞杆菌以获得以 上任一所述的食品级纳豆激酶表达菌，该载体是将PWEBK15质粒复制子替换成温敏型复制 子，插入或不插入荧光蛋白基因，以及插入纳豆激酶蛋白基因构建而成的；其中纳豆激酶蛋 白基因上游连接地衣芽胞杆菌基因组中胞外蛋白酶基因的上游序列，纳豆激酶蛋白基因下 游连接地衣芽胞杆菌基因组中该胞外蛋白酶基因的下游序列。所述单一抗生素抗性基因优 选卡拉霉素抗性基因 Kan。
[0026] 温敏型复制子是特指在芽胞杆菌中具有温敏特性的复制子片段，该片段包括芽胞 杆菌中复制起点和复制起始蛋白的完整CDS序列。
[0027] 口'^81(15质粒是中国专利公开号0附042326754(【公开日】2014.12.24)公开的含有单 一抗生素抗性基因的大肠杆菌-枯草芽胞杆菌穿梭表达载体。
[0028] 上述温敏型敲入载体中，优选插入荧光蛋白基因，该基因插入后，载体有双筛选标 记，转化后筛选的时候，挑取的单克隆的阳性率更高，抗性平板上有荧光的克隆子的阳性率 是100%;而只有单一抗性筛选，阳性率不是100%，如果长的杂菌恰好又能在抗性板子上 长，且形态和我们的芽孢杆菌类似，阳性率就会下降。另外，双筛选标记的敲入载体在与芽 胞杆菌的基因组发生双交换的时候，除了抗性会丢失，菌体在紫外下也没有荧光，这样筛选 到发生双交换克隆子的概率会增加。第三，也可以判断最终的敲入菌株还有没有游离的质 粒存在，若有就会有荧光;若没有就没有荧光;最终无痕敲除的菌株中无论是抗性基因还是 荧光蛋白基因都会从基因组中消除掉，不会对最终生产造成任何影响。
[0029] 优选地，上述温敏型敲入载体，所述胞外蛋白酶基因为apr、mpr、bpr2、vpr、epr或 bprl 〇 更优选 apr，bpr2 和 mpr〇
[0030] apr，bpr2和mpr这三个基因表达的蛋白酶在胞外的分泌量较大，在这三个位点替 换纳豆激酶基因，使得最终胞外蛋白酶的量最少，纳豆激酶被蛋白酶降解的风险最小。
[0031] 本发明还提供以上任一所述的温敏型敲入载体的制备方法，包括以下步骤：
[0032] (1)人工合成或PCR扩增获得温敏型复制子片段，通过无缝克隆方式插入到 pWEBK 15质粒，替换pWEBK 15质粒中的复制子序列，得到pKan 1941s质粒；
[0033] (2)人工合成或PCR扩增获得荧光蛋白基因，通过无缝克隆方式插入到pKanl94ts 质粒，得到pKGFP194ts质粒；
[0034] (3)将上游连接地衣芽孢杆菌基因组中胞外蛋白酶基因的上游序列、下游连接地 衣芽孢杆菌基因组中该胞外蛋白酶基因的下游序列的纳豆激酶蛋白基因，通过无缝克隆的 方式插入到pKGFP194ts质粒中。
[0035] 本发明还提供以上任一所述的食品级纳豆激酶表达菌的制备方法，包括以下步 骤：
[0036] (1)使用本发明的温敏型敲入载体，通过无缝克隆的方式导入到地衣芽孢杆菌； [0037] (2)步骤（1)导入载体后的地衣芽孢杆菌在42~44°C的高温环境下培养，通过PCR 的方法验证同源单交换和同源双交换的菌株，成功实现无痕敲入的菌株即是纳豆激酶基因 单拷贝整合到地衣芽胞杆菌基因组中的重组菌，该重组菌即为食品级纳豆激酶单拷贝表达 菌；
[0038]当需要纳豆激酶基因两拷贝的食品级纳豆激酶表达菌时，在步骤(2)获得的食品 级纳豆激酶单拷贝表达菌作为宿主进行第二轮导入温敏型敲入载体，获得食品级纳豆激酶 两拷贝表达菌；当需要纳豆激酶基因三拷贝的食品级纳豆激酶表达菌时，则以食品级纳豆 激酶两拷贝表达菌作为宿主进行第三轮导入；以此类推，获得所需纳豆激酶拷贝数的食品 级纳豆激酶多拷贝表达菌；要求每一轮导入的温敏型敲入载体之间，其含有的胞外蛋白酶 基因的上下游序列应该不同；
[0039] 当所述食品级纳豆激酶表达菌中基因组负调控因子基因 hrcA失活时，还包括步骤 (3):敲除负调控因子基因 hrcA，具体是将含有hrcA基因的上下游序列的质粒pKGFP194-hrcAFR导入到步骤(2)最终获得的食品级纳豆激酶单拷贝表达菌或食品级纳豆激酶多拷贝 表达菌；
[0040] 所述质粒pKGFP194-hrcAFR的构建方法为:将hrcA基因的上下游序列，通过无缝克 隆的方式插入到pKGFP194ts质粒中；
[00411 pKGFP194ts质粒的制备方法为:人工合成或PCR扩增获得温敏型复制子片段，通过 无缝克隆方式插入到PWEBK15质粒，替换pWEBK15质粒中的复制子序列，得到pKanl94ts质 粒；人工合成或PCR扩增获得荧光蛋白基因，通过无缝克隆方式将荧光蛋白基因插入到 pKanl94ts质粒，得到 pKGFP194ts质粒。
[0042] 本发明还提供一种液体发酵培养基，用于培养纳豆激酶表达菌，其成分包括:麦芽 糖30g/L、大豆蛋白胨 14g/L、酵母浸出粉3g/L、KH2P〇4 2g/L、K2HP〇4 5g/L、MgS〇4 0.5g/L和 CaCl2 0.2g/L。该液体发酵培养基特别适合于培养本发明的食品级纳豆激酶表达菌。
[0043] 本发明还提供以上任一所述的食品级纳豆激酶表达菌分泌的纳豆激酶在制备保 健品或制备治疗脑梗塞药物中的应用。
[0044] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0045] 本发明首次实现了食品级表达系统生产重组纳豆芽胞杆菌，生产菌株符合食品级 表达系统的要求，纳豆激酶基因多个拷贝无痕整合到在地衣芽胞杆菌基因组中表达，表达 量比现有技术显著提高显著，通过失活负调控基因 hrcA，酶活力和表达量进一步提高，酶活 力达到1350FU/mL，蛋白含量达1.45g/L。本发明中重组菌制备的纳豆激酶，纯度较高，可以 加工成保健品或作为疗脑梗塞药物的有效成分。
【附图说明】
[0046] 图1质粒pKGFP194ts的图谱；
[0047]图2纳豆激酶基因 aprN在地衣芽胞杆菌某一基因（X基因）位点的敲入载体构建示 意图；
[0048]图3重组地衣芽胞杆菌表达纳豆激酶发酵液上清的SDS-PAGE分析;M:蛋白Marker， 1-3:纳豆芽胞杆菌CICC20132，三个aprN拷贝的地衣芽胞杆菌CICC10266 (apr: : aprN yh謂 mpr::aprNAbprlbpr2::aprN^PCICC10266(ap;r::aprNyhfNmp;r::aprNAbp;rlbpr2:: aprN hrcA)，每个样品取10yL发酵液上清上样。
【具体实施方式】
[0049]下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的 理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
[0050] 本发明中用到的菌株Bacillus natto CICC20132(纳豆芽胞杆菌CICC20132)、 B.licheniformis CICC 10182和B.licheniformis CICC 10266(地衣芽胞杆菌CICC10266) 购自中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICChBacillus licheniformis ATCC53926和 Bacillus licheniformis ATCC 21415购自美国模式培养物集存库。
[00511 本发明所用到的原始质粒pE 194和pMUT IN-GFP +质粒购买来源为美国BGSC (Bacillus Genetic Stock center)；
[0052] pET-28a( + )、pUC57、pWB980均购自杭州宝赛生物科技有限公司，枯草芽胞杆菌 BS168购自MoBiTec公司，大肠杆菌DH5a购自湖北晶茂生物技术有限公司。
[0053] PWEBK15载体质粒参照专利CN201410430501文献构建；本发明中用到的所有的 Phusion DNA聚合酶和限制性内切酶等分子生物学试剂购自Thermofisher公司；无缝克隆 试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司；其它常用生化试剂均是市售分析纯。
[0054] PCR产物回收和胶回收DNA的方法均采用omega公司的试剂盒的方法。Bradf or d蛋 白浓度测定试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司。下述实施例中的实验材料，如无特殊说 明，均可以通过常规的商业途径购得。下述实施例中所采用的方法，如无特殊说明，均为常 规方法。
[0055] 本发明中所有引物见表1。
[0056] 表1扩增引物与测序引物
[0057]
[0058]
[0059]
[0060] 实例1温敏型质粒pKGFP194ts的构建
[0061 ]以PE194质粒为模版，以引物F1和R1扩增载体温敏型复制子194ts片段。
[0062] PCR体系为：10 XPCR Buffer 5yL，2mM dNTP 5yL，25mM MgS〇45yL，10yM primer F/R各 1.5yL，模版DNA 0.5yL，K0D-Plus-Neo lyL，dH2〇 32.5yL〇
[0063] PCR反应条件如下：94°C，；30个循环（98°C10s，58°C30s，68°C1.5min);68°C5min，4 °C保温;后续实验中PCR体系和反应条件均参照以上条件配置和设定，退火温度和延伸时间 根据实际情况而调整，其它参数不变。
[0064] 参考CN201410430501专利文献中的方法构建pWEBK15质粒。
[0065] pWEBK15质粒构建方法如下：
[0066] 提取pET-28a( + )载体质粒和pUC57质粒。以pET-28a( + )质粒DNA为模版，以引物P1 (5'-CGAGATATCATGAGCCATATTCAACGGGA-3'WPP2(5'-CCCACATGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGA-3'）扩增pET-28a( + )载体上的Kan基因片段。EcoRV和Pci I双酶切Kan基因片段和pUC57质 粒，PCR产物回收产物，连接，转化大肠杆菌DH5a，测序正确的中间载体命名为pUCKan;
[0067] 提取pUCKan质粒，EcoR I和EcoRV双酶切pUCKan质粒后回收大片段；以枯草芽胞杆 菌BS168基因组DNA为模版，以引物P3 (5 ' -CCGGAATTCACACAGGGATAAAATCGGCG-3 '）和P4 (5 ' -CGAGATATCTATGCGCTGCATCTCC TCAC-3 '）扩增pEBl 启动子;EcoRI和EcoRV双酶切pEBl，用PCR 产物回收试剂盒回收酶切后的DNA片段，分别再与双酶切后的pUCKan质粒片段连接，转化大 肠杆菌DH5a，涂布到含有50yg/mL卡拉霉素的LB固体培养基平板上筛选，最终测序成功的中 间载体命名为pUCKanEBl;
[0068] 提取pUCKanEBl质粒DNA，以其为模版，以磷酸化处理的引物P5(5'-ACCTGACGTCTA AGAAACCA-3 '）和P6(5 '-GTGAGTTTTCGTTCCACT GA-3 '）进行扩增，扩增产物经胶回收试剂盒 纯化后，采用平末端连接的条件，在22°C连接2h，转化大肠杆菌DH5a，涂布到含有50yg/mL卡 拉霉素的LB固体培养基平板上筛选，最终测序成功的中间载体命名为pKanEB8;
[0069] 以pWB980质粒DNA为模版，以P7(5 ' -CCGGAATTCGAGCTCAGCA TTAT-3 '）和P8(5 ' -CTGGACGTCAGCATCTAATCTTCAACAAAC-3 '）为引物扩增基因片段psr。提取pKanEB8质粒DNA，用 EcoRI和Aat II双酶切psr和pKanEB8质粒，回收大片段，连接，转化大肠杆菌DH5a，涂布到含 有50yg/mL卡拉霉素的LB固体培养基平板上筛选，最终测序成功的载体命名为pWEBK15。
[0070] 以PWEBK15质粒为模版，用引物F2和R2进行全质粒PCR扩增，扩增产物37°C经Dpnl 酶过夜消化后回收，采用无缝克隆试剂盒的操作说明对载体片段和温敏型复制子194ts片 段进行连接，转化大肠杆菌JM110,涂布在50μg/ml卡拉霉素抗性LB平板(酵母提取物5g/L， 蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，琼脂20g/L)上，置30°C培养20h后筛选克隆子，用引物F3和R3进 行PCR验证和测序验证，测序成功的载体命名pKanl94ts质粒。
[0071] 以pMUTIN-GFP+质粒为模版，用引物F4和R4扩增Cycle 3GFP基因；以pKanl94ts为 模版，用引物F5和R5扩增载体片段，基因和载体的扩增产物37°C经Dpnl酶过夜消化后回收， 采用无缝克隆试剂盒按照操作说明对载体片段和基因片段进行连接，转化大肠杆菌DH5a， 涂布在50μg/ml卡拉霉素抗性平板上筛选克隆子，挑取紫外光下有绿色荧光的克隆子，用引 物F2和R3进行PCR验证和测序验证，测序成功的载体命名pKGFP194ts(图1)。
[0072]实例2温敏型敲除(入)质粒的构建
[0073]采用CTAB法(十六烷基三甲基溴化铵)提芽胞杆菌的基因组DNA作为基因扩增的模 板(微生物学报，2006，46 (1): 7-12 ·)。
[0074] 以地衣芽胞杆菌CICC10266基因组DNA为模版，以apr-UF/R为引物扩增apr基因的 上游同源臂apr-U，以apr-DF/R为引物扩增apr基因的下游同源臂apr-D。
[0075] 以纳豆芽胞杆菌CICC20132基因组DNA为模版，以aprN-F2/R2为引物扩增纳豆激酶 基因 aprN基因片段1;以apr-U片段，apr-D片段和aprN片段1的混合物为模版，以apr-UF/ apr-DR为引物扩增三片段的重叠片段aprUD-aprN;aprN基因在地衣芽胞杆菌某一基因（X基 因）位点的敲入载体构建示意图如图2所示。
[0076]以pKGFP194ts质粒为模版，以引物F4和R1扩增载体片段，载体片段的扩增产物37 °CSDpn頂每过夜消化后回收，采用无缝克隆试剂盒按照操作说明对载体片段和重叠片段 aprUD-aprN进行连接，转化大肠杆菌JM110，涂布在50μg/ml卡拉霉素抗性平板上筛选阳线 克隆子，用引物apr-UF和apr-DR进行测序验证，测序成功的载体命名为pKGFP194-aprUD-aprN〇
[0077] 采用上述同样的方法，用引物对mpr-UF/R和mpr-DF/R分别扩增mpr基因的上下游 同源臂mpr-U和mpr-D;用引物aprN-F3/R3扩增aprN基因片段2;以mpr-U片段，mpr-D片段和 aprN基因片段2的混合物为模版，以mpr-UF/mpr-DR为引物扩增重叠片段mprUD-aprN;采用 上述无缝克隆方法将重叠片段mprUD-aprN克隆到pKGFP194ts载体中，用引物mpr-UF和mpr-DR进行测序验证，测序成功的载体命名为pKGFP194-mprUD-aprN。
[0078] 采用上述同样的方法，用引物对bpr-UF/R和bpr-DF/R分别扩增bpr基因的上下游 同源臂bpr-U和bpr-D;用引物aprN-F4/R4扩增aprN基因片段3;以bpr-U片段，bpr-D片段和 aprN片段3的混合物为模版，以bpr-UF/bpr-DR为引物扩增重叠片段bprUD-aprN;采用上述 无缝克隆方法将重叠片段bprUD-aprN克隆到pKGFP194ts载体中，用引物bpr-UF和bpr-DR进 行测序验证，测序成功的载体命名为pKGFP194-bprUD-aprN。
[0079]实例3纳豆激酶基因无痕敲入地衣芽胞杆菌 [0080] (1)纳豆激酶基因单拷贝菌株构建
[0081 ] 提取质粒pKGFP194-aprUD-aprN，将其电转化到地衣芽胞杆菌CICC10266菌株中， 感受态细胞制备和电转化方法参照以下文献:J Microbiol Meth. 1999,34(3): 183-191。
[0082] 转化的细胞涂布到20μg/ml卡拉霉素的LB固体抗性平板上30°C培养16h，PCR验证 阳线克隆子，将阳线克隆子接种到LB液体培养基中于44°C培养，每8-12h转接0.2mL菌液到 20mL新鲜LB培养基中传代培养，从传代第2次开始取样，在抗性平板上划线，利用敲除基因 上下游同源臂的外侧引物apr-UF2和apr-DR2和待敲除基因敲除载体中的引物对单菌落进 行菌落PCR扩增，验证单交换菌株;将发生单交换的菌株接种到20mL新鲜LB培养基中于42°C 传代培养继续培养，从传代第2次开始取样，将菌液稀释10-6涂布无抗性LB平板置于37 °C培 养8-10h，将无抗平板上的单菌落进行标记，用无菌牙签挑取到抗性平板上37°C培养8-10h， 将抗性平板上不长的克隆子挑取出来做菌落PCR验证和测序验证，正确的克隆子即是纳豆 激酶基因无痕敲入的菌株，命名为CICC10266(apr: :aprN yhfN)。
[0083] (2)纳豆激酶基因双拷贝菌株构建
[0084] 提取质粒pKGFP194-mprUD-aprN，将其电转化到地衣芽胞杆菌CICC10266(apr:: aprN yhfN)菌株中，按照上述（1)方法进行单交换和双交换筛选，利用敲除基因上下游同源 臂的外侧引物mpr-UF2和mpr-DR2和待敲除基因敲除载体中的引物对单菌落进行菌落PCR扩 增，验证单交换菌株。
[0085] 对mpr位点成功敲入aprN基因的菌株再用引物apr-UF和apr-DR验证apr位点的 aprN基因是否完整，apr基因位点aprN基因完整的克隆子即是aprN基因双拷贝无痕敲入的 菌株，命名为CICC10266(apr: :aprNyhfNmpr: :aprN)。
[0086] (3)纳豆激酶基因三拷贝菌株构建
[0087] 提取质粒pKGFP194-bprUD-aprN，将其电转化到地衣芽胞杆菌CICC10266(apr:: aprN yhfN mpr: :aprN)菌株中，按照上述方法进行单交换和双交换筛选。利用敲除基因上 下游同源臂的外侧引物bpr-UF2和bpr-DR2和待敲除基因敲除载体中的引物对单菌落进行 菌落PCR扩增，验证单交换菌株。
[0088] 对bpr位点成功敲入aprN基因的菌株，再用引物对apr-UF/R和mpr-UF/R分别验证 apr和mpr基因位点的aprN基因是否完整，apr和mpr基因位点aprN基因完整的克隆子即是 aprN基因三拷贝无痕敲入的菌株，命名为CICC10266(apr::aprN yhfN mpr::aprNAbprl bpr2::aprN)〇
[0089]实例4三个纳豆激酶基因拷贝的地衣芽胞杆菌中hr cA基因的敲除
[0090] 以地衣芽胞杆菌CICC10266基因组DNA为模版，以hrcA-UF/R为引物扩增hrcA基因 的上游同源臂hrcA-U，以hrcA-DF/R为引物扩增hrcA基因的下游同源臂hrcA_D。
[0091 ] 以hrcA-U片段和hrcA-D片段的混合物为模版，以hrcA-UF/hrcA-DR为引物扩增重 叠片段hrcAUD;采用上述无缝克隆方法将重叠片段hrcAUD克隆到pKGFP194ts载体中，用引 物hr cA-UF和hr cA-DR进行测序验证，测序成功的载体命名为pKGFP 194-hr cAUD。
[0092] 提取质粒pKGFP194-hrcAUD，将其电转化到含有3个aprN基因拷贝的地衣芽胞杆菌 CICC10266(apr::aprN yhfN mpr::aprNAbprl bpr2::aprN)中，按照上述方法进行单交换 和双交换筛选。利用敲除基因上下游同源臂的外侧引物hrcA-UF2和hrcA-DR2和待敲除基因 敲除载体中的引物对单菌落进行菌落PCR验证，筛选单交换和双交换菌株，hrcA基因成功敲 除的菌株命名为CICC10266(apr::aprN yhfN mpr::aprNAbprl bpr2::aprN hrcA)〇
[0093] 实例5纳豆激酶液体发酵
[0094] 以野生纳豆芽胞杆菌为对照菌株，挑取不同纳豆芽胞杆菌拷贝数的地衣芽胞杆菌 的单菌落接种于5mL的LB培养基中，37°C，200r/min振荡培养过夜。再以4%的接种量转接到 50mL新鲜的液体发酵培养基(麦芽糖30g/L，大豆蛋白胨14g/L，酵母浸出粉3g/L，KH 2P〇4 2g/ L，K2HP〇4 5g/L，MgS〇4 0.5g/L，CaCl2 0.2g/L;pH7.0)中，37°C，200r/min，发酵30h结束，测 定不同菌株发酵液上清产纳豆激酶的活力和总蛋白含量(结果参见表2)。总蛋白含量的测 定采用Bradford蛋白浓度测定试剂盒说明书的方法操作。纳豆激酶活性参照日本纳豆激酶 协会建立的方法(http: // jnattokinase · org/jnka_nk_english .html) 〇对部分样品进行 SDS-PAGE分析，分析结果见图3。
[0095]表2不同菌株产纳豆激酶的活力和总蛋白含量
[0096]
[0097] 所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不 限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保 护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
【主权项】
1. 食品级纳豆激酶表达菌，其特征在于，是经过改造使得基因组中含有至少一个拷贝 纳?激酶基因的地衣芽胞杆菌;纳?激酶基因如具有启动子，纳?激酶基因后具有终止子。2. 根据权利要求1所述的食品级纳豆激酶表达菌，其特征在于，该表达菌基因组中负调 控因子基因 hrcA失活。3. 根据权利要求1或2所述的食品级纳豆激酶表达菌，其特征在于，所述纳豆激酶基因 的启动子为:纳豆激酶基因原始启动子，或来自地衣芽胞杆菌碱性蛋白酶基因的启动子;优 选纳豆激酶基因原始启动子;所述纳豆激酶基因的终止子为纳豆激酶基因原始终止子。4. 根据权利要求1~3任一所述的食品级纳豆激酶表达菌，其特征在于，该表达菌的原 始菌株为CICC 10182、CICC 10266、ATCC53926或ATCC 21415。5. 根据权利要求1~3任一所述的食品级纳豆激酶表达菌，其特征在于，所述纳豆激酶 基因替换了地衣芽胞杆菌基因组中的至少一个胞外蛋白酶基因，所述胞外蛋白酶基因包括 apr、mpr、bpr2、vpr、epr^Pbprl〇6. -种温敏型敲入载体，用于改造地衣芽胞杆菌以获得权利要求1~5任一所述的食品 级纳豆激酶表达菌，其特征在于，该载体是将PWEBK15质粒复制子替换成温敏型复制子，插 入或不插入荧光蛋白基因，以及插入纳豆激酶蛋白基因构建而成的；其中纳豆激酶蛋白基 因上游连接地衣芽胞杆菌基因组中胞外蛋白酶基因的上游序列，纳豆激酶蛋白基因下游连 接地衣芽胞杆菌基因组中该胞外蛋白酶基因的下游序列。7. 根据权利要求6所述的温敏型敲入载体，其特征在于，所述胞外蛋白酶基因为apr、 mpr、bpr2、vpr、epri^bprl〇8. 权利要求6或7所述的温敏型敲入载体的制备方法，所述温敏型敲入载体基因组中插 入荧光蛋白基因，其特征在于，包括以下步骤： (1) 人工合成或PCR扩增获得温敏型复制子片段，通过无缝克隆方式插入到pWEBK15质 粒，替换pWEBK 15质粒中的复制子序列，得到pKan 1941s质粒； (2) 人工合成或PCR扩增获得荧光蛋白基因，通过无缝克隆方式插入到pKanl94ts质粒， 得到pKGFP194ts质粒； (3) 将上游连接地衣芽胞杆菌基因组中胞外蛋白酶基因的上游序列、下游连接地衣芽 胞杆菌基因组中该胞外蛋白酶基因的下游序列的纳豆激酶蛋白基因，通过无缝克隆的方式 插入到pKGFP194ts质粒中。9. 权利要求1~5任一所述的食品级纳豆激酶表达菌的制备方法，其特征在于，包括以 下步骤： (1) 使用权利要求6或7所述的温敏型敲入载体，通过无缝克隆的方式导入到地衣芽胞 杆菌； (2) 步骤（1)导入载体后的地衣芽胞杆菌在42~44°C的高温环境下培养，通过PCR的方 法验证同源单交换和同源双交换的菌株，成功实现无痕敲入的菌株即是纳豆激酶基因单拷 贝整合到地衣芽胞杆菌基因组中的重组菌，该重组菌即为食品级纳豆激酶单拷贝表达菌； 当需要纳豆激酶基因双拷贝的食品级纳豆激酶表达菌时，在步骤(2)获得的食品级纳 豆激酶单拷贝表达菌作为宿主进行第二轮导入温敏型敲入载体，获得食品级纳豆激酶两拷 贝表达菌；当需要纳豆激酶基因三拷贝的食品级纳豆激酶表达菌时，则以食品级纳豆激酶 两拷贝表达菌作为宿主进行第三轮导入；以此类推，获得所需纳豆激酶拷贝数的食品级纳 豆激酶多拷贝表达菌;要求每一轮导入的温敏型敲入载体之间，其含有的胞外蛋白酶基因 的上下游序列应该不同； 当所述食品级纳豆激酶表达菌中基因组负调控因子基因 hrcA失活时，还包括步骤(3): 敲除负调控因子基因 hrcA，具体是将含有hrcA基因的上下游序列的质粒pKGFP194-hrcAFR 导入到步骤（2)最终获得的食品级纳豆激酶单拷贝表达菌或食品级纳豆激酶多拷贝表达 菌； 所述质粒pKGFP194-hrcAFR的构建方法为:将hrcA基因的上下游序列，通过无缝克隆的 方式插入到pKGFP194ts质粒中； pKGFP194ts质粒的制备方法为:人工合成或PCR扩增获得温敏型复制子片段，通过无缝 克隆方式插入到PWEBK15质粒，替换pWEBK15质粒中的复制子序列，得到pKanl94ts质粒;人 工合成或PCR扩增获得荧光蛋白基因，通过无缝克隆方式将荧光蛋白基因插入到pKanl94ts 质粒，得到pKGFP194ts质粒。10. -种液体发酵培养基，用于培养纳豆激酶表达菌，其特征在于，成分包括：麦芽糖 30g/L、大豆蛋白胨 14g/L、酵母浸出粉3g/L、KH2P〇4 2g/L、K2HP〇4 5g/L、MgS〇4 0.5g/L和 CaCl2 0.2g/L。11. 权利要求1~3任一所述的食品级纳豆激酶表达菌分泌的纳豆激酶在制备保健品或 制备治疗脑梗塞药物中的应用。
【文档编号】A23L29/00GK106085934SQ201610410811
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月12日 公开号201610410811.8, CN 106085934 A, CN 106085934A, CN 201610410811, CN-A-106085934, CN106085934 A, CN106085934A, CN201610410811, CN201610410811.8
【发明人】汪小锋, 汪卫, 叶聪, 张濛, 刘艳红, 马飞
【申请人】武汉康复得生物科技股份有限公司