一种同时分离外周血t、b淋巴细胞的方法
【专利摘要】本发明公开了一种同时分离外周血T、B淋巴细胞的方法。该方法是改良的尼龙毛柱分离法，能实现一次性同时分离获得T淋巴细胞核B淋巴细胞两种细胞，细胞的产量高，交叉污染少，对细胞的生物活性无任何影响，便于开展下一步的实验研究。
【专利说明】
一种同时分离外周血T、B淋巴细胞的方法
技术领域
[0001]本发明属于细胞培养技术领域，涉及一种同时获取外周血T、B淋巴细胞的高效分离、培养方法。
【背景技术】
[0002]从外周血分离淋巴细胞是现代分子生物学和免疫学研究的重要技术手段。近年来，细胞分离技术有了很大的发展，现阶段最主要的淋巴细胞分离技术主要有以下四种:尼龙毛柱法、免疫磁珠法、梯度离心法、流式分选法。流式细胞分离术相对的分选代价较高，需要大型的流式分选仪器，操作费事，同时，流式细胞仪的分类筛选过程有时可能会影响细胞的活性和增殖能力。免疫磁珠法虽然获得的细胞纯度较高，但是细胞的获得率很低，而且淋巴细胞容易被免疫磁珠阳性分选抗体激活下游信号通路，影响后续研究。梯度离心法虽然获得的细胞数量较多，但是细胞的纯度较差。传统的尼龙毛柱法淋巴细胞获得的产量比较低，不能区分T、B淋巴细胞之间的相互影响。而且，分离外周血中的淋巴细胞，通常的分离技术细胞分离效率较低，活性容易受到磁珠抗体和流失抗体的影响，且不能有效分离区别T淋巴细胞、B淋巴细胞，容易造成T、B两种淋巴细胞之间的相互影响和交叉污染。
【发明内容】
[0003]本发明旨在针对现有淋巴细胞分离技术的不足，提供一种同时分离外周血T、B淋巴细胞的方法，即，改良的尼龙毛柱分离法，实现一次性同时分离获得T淋巴细胞核B淋巴细胞两种细胞，细胞的产量高，交叉污染少，对细胞的生物活性无任何影响，便于开展下一步的实验研究。
[0004]为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为:
[0005]所述同时分离外周血T、B淋巴细胞的方法包括如下步骤:
[0006](I)将尼龙毛撕碎后用水煮沸、然后冷却，重复煮沸和冷却多次，再用酸浸泡经煮沸冷却反复处理后的尼龙毛，烘干酸浸泡后的尼龙毛后，再次将尼龙毛撕碎至单纤维状态，将撕碎的尼龙毛装入5毫升的注射器针筒中，制成尼龙毛柱管，每支注射器针筒中装入
0.3—0.7克，优选为0.5克撕碎的尼龙毛;将至少3支10毫升注射器用酸浸泡后水洗，烘干灭菌后作为尼龙毛柱外套管备用;优选地，所述酸浸泡是用0.2mol/L的HCL浸泡；
[0007](2)在体外制备混合淋巴细胞悬液，备用(此步骤为本领域常规方法)；
[0008](3)用37°C预热的1640完全培养基注入尼龙毛柱管的尼龙毛柱中，确保全部尼龙毛完全湿润；吸取预热至37°C的混合淋巴细胞悬液加入尼龙毛柱，再向尼龙毛柱中加入数滴37°C的1640完全培养基后将尼龙毛柱管置于37°C培养箱孵育；
[0009](4)将尼龙毛柱管置于尼龙毛柱外套管中，尼龙毛柱外套管下端连接输液器管，输液器管末端连接离心管;输液器管上设有流量开关和流量调节夹;优选地，所述尼龙毛柱外套管与输液器管之间设有空气调节阀；
[0010](5)用移液器吸取5毫升37°C的1640完全培养基，缓慢注入尼龙毛柱管，通过调节流量开关和流量调节夹控制进入离心管的滤过液滴速为I滴/分钟;待5毫升1640完全培养基全部滤过后，将离心管收集的滤过液离心，再用37°C的1640完全培养基重悬细胞，得到T淋巴细胞；
[0011](6)将经步骤(5)处理后的尼龙毛柱管放入新的尼龙毛柱外套管中，用移液器吸取1毫升37 V的1640完全培养基，缓慢注入尼龙毛柱管，通过调节流量开关和流量调节夹控制进入离心管的滤过液滴速为I滴/分钟;待10毫升1640完全培养基全部滤过后，将离心管收集的滤过液离心，弃掉上清，得到T、B淋巴细胞混合物；
[0012](7)将经步骤(6)处理后的尼龙毛柱管放入新的尼龙毛柱外套管中，用移液器吸取5毫升4 V的1640完全培养基，注入尼龙毛柱管，通过调节流量开关和流量调节夹控制进入离心管的滤过液滴速为100滴/分钟;待5毫升1640完全培养基全部滤过后，将离心管收集的滤过液离心，弃掉上清，再用37°C的1640完全培养基重悬细胞，得到B淋巴细胞。
[0013]采用本发明方法每毫升可以收获T淋巴细胞5*106，B淋巴细胞2*106，后续细胞培养及激活实验显示细胞增殖速度快，活性高。
[0014]下面对本发明作进一步说明:
[0015]本发明的步骤具体包括:
[0016]一、处理尼龙毛，安装尼龙毛柱管
[0017]I包2克尼龙毛取出来后尽量拆碎。然后使用去离子水煮沸尼龙毛20分钟，再放置20分钟冷却，共重复6次，再用0.2mol/l HCL浸泡24小时，目的是经过反复的煮沸和泡酸使尼龙毛尽量蓬松伸展，达到最好的延展效果，能更好的吸附B淋巴细胞。然后把煮沸过的尼龙毛放入烤箱烤干，约4小时。待尼龙毛完全干燥后再次将其仔细撕至单纤维状态，越细越好。再将这些尼龙毛小心仔细的填入了 5毫升的一次性注射器针筒里(这里是用的塑料的一次性注射器针筒，不包含里面的推柱)，大约0.5克尼龙毛能装I只柱子，体积约4毫升，注意松紧适中，将装好的尼龙毛柱管进行高压灭菌。
[0018]二、准备尼龙毛柱外套管
[0019]3支10毫升注射器，用0.2mol/l HCL浸泡24小时，然后用大量蒸馏水冲洗，放置在
[0020]无菌饭盒内，再用75%酒精冲洗，自然烘干，高压灭菌。
[0021]三、体外制备混合淋巴细胞悬液
[0022]取外周血10ml，分装于离心管后用等量PBS液稀释，然后缓慢加于等体积的淋巴细胞分离液上，使之形成层次分明的界面。2200转离心20分钟，可见层次分明的界面。吸出离心管中间的一层乳白色的液体，加入0.85 %的氯化铵以破碎红细胞并室温静置2分钟，然后用PBS终止反应。室温1800转离心10分钟，去除上清。继续用I3BS稀释液先后洗涤2次，每次1600转离心15分钟;除上清后用含10%胎牛血清的RPM1-1640培养液将沉淀调至Iml并轻轻吹打混匀，置37°C，5%C02温箱孵育I小时；
[0023]四、尼龙毛柱预热孵育
[0024]用37度预热的1640完全培养基5ML，注入尼龙毛柱管内，确保全部尼龙毛完全湿润。用注射器吸取Iml预热至37度混合淋巴细胞悬液垂直加入毛柱，再加入数滴37度的1640完全培养基，将尼龙毛柱管置于37度培养箱孵育I小时。
[0025]五、组装尼龙毛柱套管
[0026]在超净台内，将尼龙毛柱管置于尼龙毛柱外套管中(1Ml注射器针筒)中，将注射器置于80厘米高的置物架上并固定，下端链接空气调节阀，空气调节阀下端连接50厘米配有流量开关的输液器管，在输液器管上再安装两个额外的流量调节夹。输液器管的末端与50ML离心管连接。
[0027]六、过柱
[0028]用移液器吸取5ML37度预热的1640完全培养基，手动控制缓缓注入毛柱，通过调节输液管上的流量开关和流量调节夹，基本上保证以I滴/分钟的速度收集滤过液。待5M1培养基完全过滤后，收集洗脱液，离心后用37度预热的1640完全培养基重悬细胞，即可得到T淋巴细胞。
[0029]然后将毛柱放入新的尼龙毛柱外套管内，用1ml预热的37度1640完全培养基手动控制缓缓注入毛柱，通过调节输液管上的流量开关和流量调节夹，基本上以I滴/分钟的速度洗涤过滤，收集洗脱液，离心弃上清。可得到，T，B两种细胞混合的淋巴细胞。
[0030]再将毛柱放入新的尼龙毛柱外套管内，注射器吸取5ml4度的1640完全培养基，快速(100滴/分钟)注入毛柱，完全放开流量开关，以最快速度冲洗过滤，，收集洗脱液，离心弃上清，即可得到B淋巴细胞
[0031]七、细胞含量及活性检测
[0032]对分离的细胞进行细胞计数，这种改良的尼龙毛柱法每毫升外周血可以收获T淋巴细胞5*106个，B淋巴细胞2*106个。
[0033]过柱后的淋巴细胞群中，流式检测结果显示T细胞纯度可达91.59%，B细胞纯度达89.36%，明显高于传统的尼龙毛柱法。
[0034]与现有技术相比，本发明的有益效果为:
[0035]1.尼龙毛的处理方面:传统的方法是直接将尼龙毛用手撕开然清洗后直接消毒使用。而我们改良的方法是将尼龙毛进行泡酸和反复煮沸冷却相结合，确保尼龙毛尽量蓬松伸展，达到最蓬松的状态，能更好的吸附B细胞。
[0036]2.对尼龙毛柱进行了改良设计:传统的尼龙毛柱是将尼龙毛直接放在注射器管内，而我们的尼龙毛柱是首先将尼龙毛放在5毫升的注射器管中，再将这个5ML的注射器管放入10毫升的注射器管中，形成一个尼龙毛柱的套管，用多个尼龙毛柱外套管和一个尼龙毛柱管实现了尼龙毛柱的反复过滤和分离收集，有效避免用一个输液管收集时存在的T，B淋巴细胞之间的相互影响和交叉污染。
[0037]3.过柱的顺序和流量控制:传统的尼龙毛柱过柱是让培养基自然通过尼龙毛然后收集分离液，而我们通过输液管开关和流量控制器的结合使用将过滤的速度控制在I滴/分钟，保证了淋巴细胞悬液与尼龙毛柱的充分结合后进行过滤，这样的过滤速度几乎将B淋巴细胞完全结合粘附在尼龙毛上，收集到更纯净的T淋巴细胞。同时在收集B淋巴细胞时候又用最大的流速确保B淋巴细胞可以通过自动的液体流速被冲洗滤过。
[0038]4.过柱时的温度控制:传统的尼龙毛柱过柱没有严格的控制滤过液的温度，而我们改良的过柱法在滤过T淋巴细胞的时候用37度预热的1640完全培养基，而滤过B淋巴细胞的时候用4度预冷的1640完全培养基，B淋巴细胞对温度的变化非常敏感，低温明显抑制B淋巴细胞与尼龙毛的粘附，这样可以通过温度的控制有效分离T淋巴细胞核B淋巴细胞。
【附图说明】
[0039]图1:用⑶4和⑶19分别标记分离的T淋巴细胞和B淋巴细胞，流式检测T淋巴细胞纯度可达91.59%，B细胞纯度达89.36% ；
[0040]图2:T淋巴细胞体外培养后的增殖能力观察，用CFSE荧光染料分别标记分离的T淋巴细胞和B淋巴细胞，结果显示分离的T淋巴细胞和B淋巴细胞体外培养3天后细胞增殖明显，分别有28.6 %和13.1 %的细胞进行增殖分裂。
【具体实施方式】
[0041 ] 一、处理尼龙毛，安装尼龙毛柱管
[0042]I包2克尼龙毛取出来后尽量拆碎。然后使用去离子水煮沸这尼龙毛20分钟，再放置20分钟冷却，共重复6次，再用0.2mol/l HCL浸泡24小时，目的是经过反复的煮沸和泡酸使尼龙毛尽量蓬松伸展，达到最好的延展效果，能更好的吸附B淋巴细胞。然后把煮沸过的尼龙毛放入烤箱烤干，约4小时。待尼龙毛完全干燥后再次将其仔细撕至单纤维状态，越细越好。再这些尼龙毛小心仔细的填入了 5毫升的一次性注射器针筒里(这里是用的注射器针筒，不包含里面的推柱)，大约0.5克尼龙毛能装I只柱子，体积约4毫升，注意松紧适中，将装好的尼龙毛柱管进行高压灭菌。
[0043]二、准备尼龙毛柱外套管
[0044]3支10毫升注射器，用0.2mol/l HCL浸泡24小时，然后用大量蒸馏水冲洗，放置在无菌饭盒内，再用75%酒精冲洗，自然烘干，高压灭菌。
[0045]三、体外制备混合淋巴细胞悬液
[0046]取外周血10ml，分装于离心管后用等量PBS液稀释，然后缓慢加于等体积的淋巴细胞分离液上，使之形成层次分明的界面。2200转离心20分钟，可见层次分明的界面。吸出离心管中间的一层乳白色的液体，加入0.85 %的氯化铵以破碎红细胞并室温静置2分钟，然后用PBS终止反应。室温1800转离心10分钟，去除上清。继续用I3BS稀释液先后洗涤2次，每次1600转离心15分钟;除上清后用含10%胎牛血清的RPM1-1640培养液将沉淀调至Iml并轻轻吹打混匀，置37°C，5%C02温箱孵育I小时；
[0047]四、尼龙毛柱预热孵育
[0048]用37度预热的1640完全培养基5ML，注入尼龙毛柱管内，确保全部尼龙毛完全湿润。用注射器吸取Iml预热至37度混合淋巴细胞悬液垂直加入毛柱，再加入数滴37度的1640完全培养基，将尼龙毛柱管置于37度培养箱孵育I小时。
[0049]五、组装尼龙毛柱套管
[0050]在超净台内，将尼龙毛柱管置于尼龙毛柱外套管中(1Ml注射器针筒)中，将注射器置于80厘米高的置物架上并固定，下端链接空气调节阀，空气调节阀下端连接50厘米配有流量开关的输液器管，在输液器管上再安装两个额外的流量调节夹。输液器管的末端与50ML离心管连接。
[0051 ] 六、过柱
[0052]用移液器吸取5ML 37度预热的1640完全培养基，手动控制缓缓注入毛柱，通过调节输液管上的流量开关和流量调节夹，基本上保证以I滴/分钟的速度收集滤过液。待5M1培养基完全过滤后，收集洗脱液，离心后用37度预热的1640完全培养基重悬细胞，即可得到T淋巴细胞。
[0053]然后将毛柱放入新的尼龙毛柱外套管内，用1ml预热的37度1640完全培养基手动控制缓缓注入毛柱，通过调节输液管上的流量开关和流量调节夹，基本上保证以I滴/分钟的速度洗涤过滤，收集洗脱液，离心弃上清。可得到，T，B两种细胞混合的淋巴细胞。
[0054]再将毛柱放入新的尼龙毛柱套管内，注射器吸取5ml预冷4度的1640完全培养基，快速(100滴/分钟)注入毛柱，完全放开流量开关，以最快速度冲洗过滤，，收集洗脱液，离心弃上清，即可得到B淋巴细胞
[0055]七、细胞含量及活性检测(结果见图1和图2)
[0056]对分离的细胞进行细胞计数，这种改良的尼龙毛柱法每毫升外周血可以收获T淋巴细胞5*106个，B淋巴细胞2*106个。
[0057]过柱后的淋巴细胞群中，流式检测结果显示T细胞纯度可达91.59%，B细胞纯度达89.36%，明显高于传统的尼龙毛柱法。
[0058]分离后T淋巴细胞及B淋巴细胞的增殖活性很高，对各种体外刺激反应明显，满足体外进一步实验观察的需求。
【主权项】
1.一种同时分离外周血T、B淋巴细胞的方法，所述方法包括如下步骤: (1)将尼龙毛撕碎后用水煮沸、然后冷却，重复煮沸和冷却多次，再用酸浸泡经煮沸冷却反复处理后的尼龙毛，烘干酸浸泡后的尼龙毛后，再次将尼龙毛撕碎至单纤维状态，将撕碎的尼龙毛装入5毫升的注射器针筒中，制成尼龙毛柱管，每支注射器针筒中装入0.3-0.7克撕碎的尼龙毛;将至少3支10毫升注射器用酸浸泡后水洗，烘干灭菌后作为尼龙毛柱外套管备用； (2)在体外制备混合淋巴细胞悬液，备用； (3)用37°C预热的1640完全培养基注入尼龙毛柱管的尼龙毛中，确保将全部尼龙毛完全湿润；吸取预热至37°C的混合淋巴细胞悬液加入尼龙毛柱，再向尼龙毛柱中加入数滴37°(:的1640完全培养基后将尼龙毛柱管置于37°C培养箱孵育； (4)将尼龙毛柱管置于尼龙毛柱外套管中，尼龙毛柱外套管下端连接输液器管，输液器管末端连接离心管;输液器管上设有流量开关和流量调节夹； (5)用移液器吸取5毫升37°C的1640完全培养基，缓慢注入尼龙毛柱管，通过调节流量开关和流量调节夹控制进入离心管的滤过液滴速为I滴/分钟;待5毫升1640完全培养基全部滤过后，将离心管收集的滤过液离心，再用37°C的1640完全培养基重悬细胞，得到T淋巴细胞； (6)将经步骤(5)处理后的尼龙毛柱管放入新的尼龙毛柱外套管中，用移液器吸取10毫升37 V的1640完全培养基，缓慢注入尼龙毛柱管，通过调节流量开关和流量调节夹控制进入离心管的滤过液滴速为I滴/分钟;待10毫升1640完全培养基全部滤过后，将离心管收集的滤过液离心，弃掉上清，得到T、B淋巴细胞混合物； (7)将经步骤(6)处理后的尼龙毛柱管放入新的尼龙毛柱外套管中，用移液器吸取5毫升4 V的1640完全培养基，注入尼龙毛柱管，通过调节流量开关和流量调节夹控制进入离心管的滤过液滴速为100滴/分钟;待5毫升1640完全培养基全部滤过后，将离心管收集的滤过液离心，弃掉上清，再用37°C的1640完全培养基重悬细胞，得到B淋巴细胞。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(I)所述酸浸泡是用0.2mol/L的HCL浸泡。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述尼龙毛柱外套管与输液器管之间设有空气调节阀。
【文档编号】C12N5/0781GK106085955SQ201610402343
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月8日
【发明人】刘持, 向阳, 秦晓群, 刘惠君, 瞿湘萍, 张珣
【申请人】中南大学