一种用于pd研究的hsp70干扰稳定细胞系及其建立方法
【专利摘要】一种用于PD研究的HSP70干扰稳定细胞系及其建立方法本发明针对HSP70在PD疾病发生发展中的作用尚未完全清楚，需要多种研究方法进一步明确的情况，通过构建针对HSP70的RNA干扰慢病毒表达质粒载体，建立干扰质粒稳定转染的SH?SY5Y细胞系。本发明采用的技术方法:设计并合成多个针对hsp70基因的RNA干扰序列,并将其插入真核表达慢病毒载体，通过与包装质粒共转染293T细胞后进行荧光定量PCR检测目的基因表达水平，筛选出有效干扰质粒；通过慢病毒感染法将该有效干扰质粒稳定转染至SH?SY5Y细胞系，通过携带的GFP荧光筛选获得稳转细胞系，荧光定量PCR检测验证。该细胞系与亲本细胞系相比具有类似的生长曲线。
【专利说明】一种用于PD研究的HSP70干扰稳定细胞系及其建立方法
[0001 ]技术领域本发明属基因及细胞技术领域，本发明涉及一种HSP70 RNA干扰稳定 细胞系及其建立方法。
[0002]
【背景技术】帕金森病(Parkinson DisSH-SY5Yse，PD)是一种椎体外系进行性神 经退化性疾病，病理学主要表现为黑质多巴胺能神经元和纹状体多巴胺能神经纤维的数量 显著下降。大量动物实验证明氧化应激损伤对PD的发生起重要作用。免疫反应在PD发生中 的作用也受到关注，ro中的免疫反应是由沉积的α突触核蛋白激活星形胶质细胞来启动的， 分泌的大量细胞因子、化学因子激活小胶质细胞，活化的小胶质细胞会进一步释放大量神 经炎症介质、趋化因子，最终使得神经元损伤；同时活化的星形胶质细胞激活氧化应激作用 最终导致神经元死亡。突触核蛋白基因过表达或突变可引起α_突触核蛋白的错误折叠、 有毒蛋白寡聚体和多聚体的形成，使其结构和功能障碍，从而启动一系列级联反应致多巴 胺能系统损伤，最终导致帕金森病。研究认为神经保护剂可能是治疗ro的一个新的有效途 径，热休克蛋白70(hsp70)作为分子伴侣家族中的一员，是一种重要的应激蛋白，能与错误 折叠的蛋白相互作用，阻止聚集物的形成，并且还有助于错误折叠蛋白的降解，因此将其用 于PD的发病机制与疾病治疗方面的研究，已有研究表明HSP70能减轻帕金森病细胞模型中 突触核蛋白毒性的作用。RNA干扰技术可特异性剔除或关闭特定基因的表达，已被用于广 泛探索基因功能的研究领域。
[0003] SH-SY5Y细胞为人的神经母细胞瘤细胞，常用于PD发病机制的研究。目前PD发病 机制的研究中，HSP70的作用尚不完全清楚，尚没有采用HSP70 RNA干扰技术的研究方法。
[0004]
【发明内容】
本发明针对HSP70在PD疾病发生发展中的作用尚未完全清楚，需要多 种研究方法进一步明确的情况，通过构建针对HSP70的RNA干扰慢病毒表达质粒载体，建立 干扰质粒稳定转染的SH-SY5Y细胞系。本发明采用的技术方法:设计并合成多个针对hsp70 基因的RNA干扰序列，并将其插入真核表达慢病毒载体，通过与包装质粒共转染293T细胞后 进行荧光定量PCR检测目的基因表达水平，筛选出有效干扰质粒;通过慢病毒感染法将该有 效干扰质粒稳定转染至SH-SY5Y细胞系，通过携带的GFP荧光筛选获得稳转细胞系，荧光定 量PCR检测验证。
【附图说明】
[0005] 图1.为本发明实施例1中不同HSP70 RNA干扰序列下的细胞HSP70表达水平比较。 其中横坐标为不同样品（sample)，纵坐标为hsp70 mRNA相对表达水平(relative amout)。
[0006] 图2.为本发明实施例2中所采用的荧光定量PCR标准曲线。
[0007] 图3.为本发明实施例3中采用含HSP70 RNA干扰序列的慢病感染SH-SY5Y细胞荧光 检测图。
[0008] 图4:慢病毒干扰重组质粒的酶切电泳图。
[0009] 图5:SH-SY5Y-hsp70细胞系稳定性分析。其中第1代和第30代分别指第1代和第30 代SH-SY5Y-hsp70细胞系，明场是指明场下细胞照片，焚光场是指荧光场下细胞照片。
[0010] 图6:SH-SY5Y-hsp70细胞系与野生型SH-SY5Y细胞系生长曲线比较。其中横坐标为 细胞生长时间（培养时间），纵坐标为450nm单波长条件下测定的光度吸收值(波长450nm)〇
[0011] 图7:不同浓度DMS0对细胞活性的影响；其中横坐标为不同浓度DMS0(DMS0:浓 度），纵坐标为450nm单波长条件下测定的光度吸收值(波长450nm)〇
【具体实施方式】
[0012]药品与试剂:各种限制性核酸内切酶、T4 DNA连接酶购自NEB公司，胶回收试剂 盒、小量质粒抽提试剂盒购自MN公司；转染试剂M40为实验室自主制备;DMEM培养基，抗生 素，胰酶，D-PBS购自hyclone公司，胎牛血清购自GIBC0公司；CCK-8试剂盒购自Do j indo公 司；其他试剂均为进口和国产分析纯试剂。
[0013] 仪器:倒置荧光显微镜Ti，尼康公司。 本发明的高效表达细胞模型可稳定表达干扰序列和绿色荧光蛋白，因此可以在荧光显 微镜下直接观察。
[0014]实施案例1 HSP70干扰序列的设计和筛选 根据GenBank公布的HSP70基因 HSPA1A(序列号:NM_005345.5)设计4条干扰序列见表1: 表1.HSP70 RNA干扰序列
将4种干扰序列分别克隆至慢病毒质粒载体中，重组表达质粒酶切电泳图见图4。采用 瞬时转染的方法转染293T细胞。293T细胞采用含10%FBS的高糖DMEM培养基，置于37°C，5% C02培养箱内培养。转染前1天消化293T细胞，计数，将细胞接种至35mm培养皿内，每个培养 皿接种6 X 105个细胞;次日用不含FBS的DMEM培养基分别配制钙转试剂和RNA干扰质粒，每 84μ1培养基内加入16μ1钙转试剂，每100μΙ培养基内加入4yg质粒，分别混匀后将钙转溶液 和质粒溶液轻轻混匀，室温静置10分钟，逐滴加入培养皿内，在37 °C，5%C02培养箱内培养 24h，更换新鲜的含10% FBS的高糖DMEM培养基继续培养48h，收集细胞，提取细胞RNA。分别 取lyg RNA反转录cDNA，采用荧光定量PCR法检测HSP70的表达水平，以beta-actin作为内 参，荧光定量PCR所采用的引物探针序列见表2: 表2.hsp70和beta-actin弓物探针设计
采用2-ΔΔ?τ相对定量方法计算不同RNA干扰序列样品的HSp7〇表达水平。筛选出表达水 平最低的RNA干扰序列。检测结果(见图1)表明S3序列的HSP70表达水平最低，说明S3序列的 RNA干扰效果最好，选该序列作为建立稳定细胞系的干扰序列。
[0015]本发明中使用慢病毒表达载体prrl-CMV作为GFP的表达载体，制备方法使用现有 的公认技术，其中GFP的CDNA序列为SEQ ID N0.1所示。
[0016]实施案例2 HSP70干扰慢病毒的包装制备 在真核细胞转染和基因治疗领域，病毒载体正越来越受到重视。目前常用的病毒载体 包括腺病毒载体、腺相关病毒载体、疱疹病毒载体和逆转录病毒载体等，其中逆转录病毒中 的慢病毒载体因其表达的稳定性，包装容量大以及能够实现多基因共感染等优势被广泛使 用于科研中。慢病毒感染能够将目的基因整合入细胞的基因组，所以不用再培养基中加入 筛选压力就能稳定表达目的蛋白，大大简化了实验过程，降低了成本。因此本发明使用慢病 毒包装、感染的方法获得最终的稳定转染细胞系。
[0017] 目前使用的慢病毒包装体系是由HIV病毒的基因组改造而成的。使用最广泛的为 第三代慢病毒，是一种三质粒系统，能用于感染非分裂期的细胞。通过改造去除了不相关基 因序列，并使用异源的部分基因代替同源基因（如：envelope-coding质粒）来增加其安全 性，同时对启动子等序列进行修饰改造提高了病毒滴度和转染效率。最后通过改造得到了 自身失活型慢病毒载体(self-inactivation，SIN)有着较高的滴度，转染效率和安全性。 而病毒获得后除了能用于细胞的感染外，也能用于基因治疗。
[0018] 本发明中以人肾上皮细胞(293T)为受体细胞进行慢病毒的包装。
[0019] 使用的包装质粒为 pMD2. G，pMD-PRRE 和 pRSV-REV。
[0020] 试验过程如下： (1)细胞培养 用含抗生素和10%血清的完全DMEM培养基接种细胞于35mm细胞培养皿，细胞浓度为6 X 1〇5/孔。待细胞完全贴壁后，用转染试剂M40进行转染。
[0021] (2)转染过程 DNA和转染试剂混合物的配制 A溶液: 慢病毒干扰质粒 i.7yg 包装质粒混合物 1.8yg 无血清无抗生素 DMEM培养基补充至100μΙ，震荡混匀； Β溶液： 转染试剂 16μ1 无血清无抗生素 DMEM培养基补充至100μΙ，轻柔混匀； 将Α液与Β液轻柔混匀，室温静置10min，将混合液加入到细胞中。37 °C，5% C02培养箱内 培养，次日换为含血清含抗生素的DMEM培养基。
[0022] (3)慢病毒的收集和纯化 收集转染后第4天和第5天的细胞上清，将第四天和第五天收集的病毒液4000g，室温离 心10min;离心后的病毒液经0.45μηι滤膜过滤后转入超滤管内（ufc910024，MILLIP0RE)，常 温，4000g，离心15min;收集病毒浓缩液，分装，冻存于-80度。
[0023]采用荧光定量PCR绝对定量法检测所制备病毒的滴度，以构建的106~101()C〇pi eS 干扰质粒作为标准品建立标准曲线见图2,检测病毒的滴度为8.14X105vg/ml。
[0024] 实施例3含有HSP70干扰序列的SH-SY5Y稳定细胞系的建立 试验过程如下： (1)细胞培养 用含抗生素和10%血清的完全DMEM培养基接种细胞于35mm细胞培养皿，细胞浓度为6 X 1〇5/孔。待细胞完全贴壁后，用转染试剂M40进行转染。
[0025] (2)感染过程 慢病毒用完全DMEM培养基(含6μg/ml polybrene)稀释至合适倍数后，加入到弃去上清 的SH-SY5Y细胞表面;慢病毒感染24h后，换用含抗生素和10%血清的完全DMEM培养基继续培 养。
[0026] (3)细胞克隆化 取饲养细胞。实验小鼠脱白致死，75%酒精浸泡lOmin，无菌解剖，剪开腹部皮肤，不要损 伤腹膜，用注射器吸取6_8ml完全培养基，用镊子夹起腹膜，进针，注意不要戳到内脏和脂 肪，进针方位可以在腹部中间，避开腹部下方的脂肪。
[0027]反复吹打腹腔数次，期间用酒精棉球轻揉小鼠腹部，待吸出培养基变黄时将培养 基吸出，转移到离心管内备用。（一只成年小鼠的腹腔巨噬细胞可以满足6-8块96孔细胞培 养板的铺板需要）。
[0028]取感染后SH-SY5Y细胞，消化，计数，每20ml培养基(含相应浓度的饲养细胞)加入 150个细胞，分96孔板，200μ1/孔。
[0029] 细胞培养1天后观察是否有污染，培养3-5天后计数细胞亚克隆数目，并做记录。细 胞培养10天，选择单克隆细胞孔在荧光显微镜下进行观察，选择发绿色荧光的细胞克隆进 行消化和扩大培养。
[0030] 实施案例四阳性克隆细胞的筛选 由于外源基因随机整合到宿主细胞的染色体上，根据整合位点的随机性，可能存在宿 主细胞状态差、对信号分子反应弱和目的基因表达稳定性差等问题。因此将所有挑出的阳 性克隆细胞扩大培养后，进行细胞生长曲线对比试验和GFP表达稳定性分析。
[0031] 试验例一 GFP表达稳定性分析 在本实验中共筛选得到了 4个阳性克隆。对这4个阳性克隆进行连续传代培养，连续传 代培养试验方案:细胞汇合度达到80%时，弃去细胞上清，用D-PBS洗涤一遍，加入适量胰酶 进行消化，倒置显微镜下观察，待大部分细胞变为圆形时使用有血清有抗生素的完全DMEM 培养基终止消化，吹下细胞，l〇〇〇rpm离心10分钟，留1/4的细胞在原培养体系中继续培养， 待细胞汇合度达到80%时重复上述操作。
[0032]每传代5次，荧光显微镜下观察荧光细胞的比例和细胞的荧光强度，拍照记录。结 果如图5所示：SH-SY5Y-HSP70细胞系在第30代时其荧光率仍然保持100%，证明SH-SY5Y-HSP70细胞系具有良好的稳定性。
[0033]试验例二本发明细胞模型与野生型细胞生长曲线比较 从上部试验筛选获得的4株细胞中选择细胞生长状态最好的1株，对这株细胞与野生型 SH-SY5Y细胞进行扩大培养，待细胞数量达到一定规模时进行生长曲线分析。生长曲线分析 试验方案:细胞汇合度达到80%时进行细胞消化和计数，按照1.5 X 103/孔的细胞密度铺板 96孔细胞培养板，每组设立3个复孔，使用有血清有抗生素的完全DMEM培养基进行培养，每 孔200μ1，分别在24h，48h，72h，96h，120h和144h进行细胞活力分析，具体步骤为:弃去细胞 上清，加入含10% CCK-8试剂的无血清无抗生素 DMEM培养基100μΙ，37°C，5% C02培养箱内孵 育2h后，取出细胞，在酶标仪0D450条件下进行读数，对结果进行分析，结果如图6所示:SH-SY5Y-HSP70细胞系与野生型SH-SY5Y细胞系相比其生长速度较低，但生长曲线趋势一致，证 明SH-SY5Y-HSP70细胞系具有良好的生长活性。
[0034]试验例一和试验例二证明我们筛选获得的细胞模型GFP稳定性好，生长曲线与野 生型一致，是良好的稳转细胞系。
[0035] 荧光定量PCR方法参照实施例1，检测结果（见表3)表明SH-SY5Y-HSP70细胞系 HSP70表达水平只有对照组细胞的0.3%，说明细胞干扰成功。
[0036] 表3.RNA干扰细胞与对照细胞HSP70表达水平的比较
试验例五不同浓度DMS0对细胞活性的影响 ro治疗药物可能溶于DMS0。因此有必要检测不同浓度DMS0对药物筛选方法的影响。 [0037]细胞活性分析试验方案：细胞汇合度达到80%时进行细胞消化和计数，按照5 X 1〇3/孔的细胞密度铺板96孔细胞培养板，每组设立3个复孔，使用含1% FBS的DMEM培养基进 行培养，每孔200μ1，次日加入含不同浓度DMS0的1% FBS的DMEM，加药后72h时进行细胞活力 分析，具体步骤为:弃去细胞上清，加入含10% CCK-8试剂的无血清无抗生素 DMEM培养基100 μL，37°C，5% C02培养箱内孵育2h后，取出细胞，在酶标仪0D450条件下进行读数，对结果进 行分析，结果如图7所示:显示不同浓度的DMS0对细胞增殖没有显著影响。
【主权项】
1. 一种用于PD研究的HSP70干扰稳定细胞系SH-SY5Y，其特征在于采用 TGGAGGAGTTCAAGAGAAA 干扰序列构建。2. 权利要求1所述的干扰序列的HSP70表达抑制率可达到99%以上。3. 权利要求1所述的干扰序列后面连接GFP基因，可通过检测GFP荧光来检测慢病毒感 染效果。4. 权利要求2所述的HSP70表达水平是通过荧光定量PCR相对定量方法检测的。5. 根据权利要求1所述的用于PD研究的HSP70干扰稳定细胞系SH-SY5Y，其特征在于： 所述GFP基因序列为SEQ ID N0:1。6. 根据权利要求1所述的用于PD研究的HSP70干扰稳定细胞系SH-SY5Y，其特征在于： 设计并合成多个针对hsp70基因的RNA干扰序列，并将其插入真核表达慢病毒载体，通过与 包装质粒共转染293T细胞后进行荧光定量PCR检测目的基因表达水平，筛选出有效干扰质 粒;通过脂质体转染法将该有效干扰质粒稳定转染至SH-SY5Y细胞系，通过亚克隆操作和携 带的GFP荧光筛选获得稳转细胞系，荧光定量PCR检测验证。7. 根据权利要求1所述的用于研究的HSP70干扰稳定细胞系SH-SY5Y，其特征在于与 亲本细胞系相比具有类似的生长曲线。
【文档编号】C12N5/10GK106085963SQ201610259046
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年4月25日 公开号201610259046.4, CN 106085963 A, CN 106085963A, CN 201610259046, CN-A-106085963, CN106085963 A, CN106085963A, CN201610259046, CN201610259046.4
【发明人】蒋明, 尹衍新, 蒋韵, 毛玉婷
【申请人】同济大学苏州研究院