一种水貂伪狂犬灭活疫苗及其制备方法和用图
【专利摘要】本发明公开了一种水貂伪狂犬灭活疫苗及其制备方法和用途。本发明的一种水貂伪狂犬灭活疫苗中含有的灭活后的保藏号为CGMCC No.12340的伪狂犬病毒株PRV?DL14/08株，本发明还公开了所述水貂伪狂犬疫苗的制备方法。实验证明本发明制备的水貂伪狂犬灭活疫苗具有良好的安全性，免疫水貂后可并产生理想的免疫保护效果，因此可作为防控水貂等鼬科动物伪狂犬的候选疫苗株。CGMCC No. 1234020160531
【专利说明】
一种水貂伪狂犬灭活疫苗及其制备方法和用途
技术领域
[0001] 本发明涉及一种伪狂犬灭活疫苗及其制备方法和用途，特别涉及一种由伪狂犬病 毒株PRV-DL14/08株制备的用于水貂伪狂犬防控的灭活疫苗及制备方法，本发明属于生物
技术领域。
【背景技术】
[0002] 伪狂犬病(Pseudorabies，PR)，是由伪狂犬病毒(Pseudorabies Virus，PRV)引起 的经济动物和家畜的一种急性传染病。其特征是发热、奇痒、内脏出血、脑脊髓炎等。猪的伪 狂犬已有报道，近年来水貂临床病例也持续增加。该病早在1813年流行于美国的牛群中， 1902年匈牙利学者奥叶兹基(Aujeszky)第一次较为详细的描述了该病，故命名为奥叶兹基 病（又称Aujeszky氏病，Aujeszky ' s disease，AD)，1910年，Schmiedhofer通过过滤试验证 实本病原为病毒且首先分尚出病毒。
[0003] 刘永纯1984年报道了第一例猫感染伪狂犬以后，1956年周圣文又首次报道了哺乳 仔猪感染伪狂犬的病例。伪狂犬在我国一直未得到彻底净化，而且在2011年以来，该病已经 波及我国30多个省市和地区（包括香港和台湾地区）。目前，在我国的华北、东北地区以及河 南、河北、山东、湖北、湖南、江西、江苏等地PR呈爆发流行。
[0004] 随着我国经济动物及毛皮动物养殖规模的逐年扩大，近年来水貂、狐、貉等毛皮动 物通过食源的渠道感染伪狂犬病毒的情况也日益凸显，特别是PR造成的死亡率几乎高达 100%，对养殖业危害巨大，因此，切实做好PR防控工作已迫在眉睫。疫苗是防控病毒性传染 病的有效手段，因而研发一种拥有我国自主知识产权、保护性良好的新型高效疫苗具有重 要意义。
[0005] 目前，我国的疫苗用毒株就有 Bartha, Bartha-K61, Bucharest, BUK，HB-98,和 SA215等，但我国近两年猪伪狂犬的爆发呈上升趋势，达到了前所未有的规模，且有的感病 猪群曾接种过商品化疫苗。这表明我们所使用的疫苗株有的已经不能完全保护住伪狂犬野 毒株的感染。而且目前还没有针对水貂的伪狂犬疫苗研制成功，鉴于此本发明开展了相关 疫苗的研究工作。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题是提供一种水貂伪狂犬灭活疫苗及其制备方法。使用 该疫苗免疫水貂后可产生理想的保护效果，且具有良好的安全性。
[0007] 为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
[0008] 伪狂犬病毒株的分离与鉴定:2014年，病料采集自辽宁省某经济动物养殖场发病 水貂脑、肝脏，病料经过研磨后，接种已长成单层的猪肾上皮细胞(PK15细胞），对组织培养 物用伪狂犬病毒(PRV)特异性引物进行PCR扩展鉴定gE和gD基因，扩增gE基因引物分别为 gE-F和gE-R，扩增gD基因引物分别为gD-F和gD-R，如表1所示。并进行兔体致病性试验，证明 分离的病毒为伪狂犬病毒株，命名为PRV-DL14/08,分类命名为伪狂犬病病毒，保藏在中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其微生物保藏号是:CGMCC No. 12340;保藏时 间：2016年05月31日；保藏地址是:北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究 所。
[0009] 进一步的，本发明还提出了以上所述伪狂犬病毒株在制备防治伪狂犬疫苗中的用 途。
[0010] 在本发明中，优选的，所述的伪狂犬病疫苗为水貂伪狂犬灭活疫苗。
[0011]更进一步的，本发明还提出了一种水貂伪狂犬病灭活疫苗及其制备防治水貂伪狂 犬病药物中的用途，所述疫苗中含有灭活后的伪狂犬病毒株PRV-DL14/08株。
[0012] 在本发明中，优选的，所述伪狂犬疫苗中含有的伪狂犬病毒株PRV-DL14/08株多 106TCID 5q/头份。
[0013] 再进一步的，本发明提出了一种制备以上所述的水貂伪狂犬灭活疫苗的方法，包 括以下步骤：
[0014] 将所述的伪狂犬病毒PRV-DL14/08株增殖后进行病毒滴度测定，依所含免疫剂量， 加入灭活剂及佐剂后制备而成，所述伪狂犬疫苗中含有的伪狂犬病毒株PRV-DL14/08株多 10 6TCID5q/头份。
[0015]在本发明中，优选的，所述的伪狂犬病毒株PRV-DL14/08株的增殖包括以下步骤： [0016] 在已长成单层PK15细胞中，按体积百分比1%的比例接种伪狂犬病毒株PRV-DL14/ 08株，置于37°C，5 %⑶2培养箱中，培养72h，反复冻融3次后收获，至-80°C保存，应不超过1 年。
[0017] 在本发明中，优选的，所述的灭活剂为甲醛溶液，所述的佐剂为铝胶。
[0018] 在本发明中，优选的，所述的水貂伪狂犬灭活疫苗是通过以下步骤制备得到的：
[0019] 在已长成单层PK15细胞中，按体积百分比1%的比例接种伪狂犬病毒株PRV-DL14/ 08株，置于37°C，5%C0 2培养箱中，培养72h，反复冻融3次后收获病毒上清液，按2份体积的 病毒上清液加5份体积的pH7.2-7.4 2 % (w/w)氢氧化铝磷酸盐缓冲液的比例加入氢氧化铝 磷酸盐缓冲液，然后用20% (w/w)氢氧化钠将pH值调至7.2-7.4，按总体积的0.15%加入甲 醛溶液，振摇30分钟，然后放2-8°C灭活7日，期间每日上、下午各振摇1次，每次15-20分钟， 加入25% (w/w)铝胶，每隔12小时震动30min，制备得到所述的水貂伪狂犬灭活疫苗。
[0020] 安全性和免疫原性实验结果表明，本发明制备得到的水貂伪狂犬毒灭活疫苗对水 貂具有良好的安全性，免疫水貂后可产生理想的保护效果，可作为防控水貂伪狂犬的候选 疫苗株。
【附图说明】
[0021] 图1为PRV-DL14/08株gE和gD基因扩增结果图。
[0022] 其中，Μ为DL2000DNA Marker，l为gE基因片段扩增产物，2为gD基因片段扩增产物。
【具体实施方式】
[0023]下面结合具体实施例来进一步描述发明，本发明的优点和特点交回随着描述而更 为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该 理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改 或者替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0024] 实施例1本发明PRV-DL14/08株的分离鉴定 [0025]材料与方法 [0026] 1、病料和细胞
[0027]病料采集自大连某经济动物养殖场发病死亡水貂脑、肝脏组织，PK15细胞有中国 农科院特产研究所提供。
[0028] 2、病毒增殖
[0029] 发病死亡水貂及肝脏组织，用组织匀浆研磨后，用无血清DMEM培养液1:5稀释成悬 液，加入青/链霉素至l〇〇〇〇U/mL，反复冻融3次，经12000rmp离心15min取上清，接种已长成 单层的PK细胞，于37 °C，5 % C02，培养箱培养72小时，反复冻融3次，离心取上清，-80 °C保存 备用。
[0030] 3、分子生物学试剂
[0031] DNA提取试剂盒购自Qiagen公司;PCR扩增所用的EX Taq DNA聚合酶购自宝生物公 司;胶回收试剂盒购自AXYGEN公司。
[0032] 4、引物设计
[0033]利用Oligo 6.0软件设计合成扩增PRV中gE和gD基因的特异性引物，扩增gE引物分 别为gE-F和gE-R，扩增gD基因引物分别为gD-F和gD-R，如表1所示：
[0034] 表 1
[0035]
[0036] 5、gE和gD基因的PCR扩增程序：
[0037] 94Γ 预变性 5min
[0038] 94Γ 变性 30 秒
[0039] 55Γ 退火 30 秒
[0040] 72 °C 延伸 30 秒
[0041 ] 循环过程30次 [0042] 72Γ延伸10分钟
[0043] PCR产物用AXYGEN胶回收试剂盒回收片段。
[0044] 6、连接与转化
[0045]将胶回收的PCR产物于pMD18-T载体连接后，转化DH5a大肠杆菌感受态细胞，然后 取出100yL菌液涂于含有氨苄青霉素 (50yg/mL)的LB平板上，37°C培养18h。挑取白色单独菌 落，接种于5mL含有氨苄青霉素(50yg/mL)的液体LB培养基中，37 °C培养18h。
[0046] 7、兔体致病性试验
[0047] 取8只3月龄家兔（由长春亿斯公司提供)份2组，攻毒组4只，每只兔颈部皮下注射 lmL含PRV细胞培养上清(2 X 106TCID5Q/只），对照组4只接种PBS，病毒接种后，每日观察家兔 发病情况。
[0048]试验结果
[0049] 1、PCR 结果
[0050] gD和gE基因片段大小分别约为634bp和493bp，与预期大小相符，电泳结果见图1所 不。
[0051 ] 2兔体致病性试验结果
[0052] 攻毒48h后，攻毒组家兔舔咬后肢直至掉毛、破损和出血，继而出现体温升高、四肢 麻痹，抽搐、角弓反张乃至瘫痪，最后4只兔子全部因器官衰竭死亡;对照组未见可见临床症 状。具体结果见表2。
[0053] 表2伪狂犬病毒强毒PRV-DL14/08株对兔子的致病性
[0054]
L0055J 通过以上实验证明分离的病毒为伪狂犬病毒株，命名为PRV-DL14/08株，分类命名 为伪狂犬病病毒，并将其保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其微生 物保藏号是:CGMCC No. 12340;保藏时间：2016年05月31日；保藏地址是:北京市朝阳区北辰 西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
[0056]实施例2本发明水貂动物PR灭活疫苗的制备及其免疫效力评价 [0057] 1材料与方法
[0058] 1.1病毒增殖及滴定：
[0059] 在已长成单层的H(15细胞中，以1%(v/v)比例接种PRV-DL14/08种毒（CGMCC No . 12340)，置于于37 °C，5 %⑶2培养基中，培养72h，反复冻融3次后收获，12000rpm离心 15min，取上清，滴定后置-80°C保存，应不超过12个月。
[0060] 1.2水貂动物PR灭活疫苗的制备：
[0061 ]将细胞培养制得的上清按2份体积细胞毒液加5份体积2% (w/w)氢氧化铝磷酸盐 缓冲液(PH7.2-7.4)的比例混匀，用20 % (w/V)氢氧化钠将pH值调至7.2-7.4，按总量的 0.15 % (v/v)加入甲醛溶液，振摇30分钟。然后放2-8°C灭活7日，期间每日上、下午各振摇1 次，每次15-20分钟，然后加入25% (w/w)铝胶，每隔12小时震动30min，制备得到水貂动物PR 灭活疫苗，其中含有的伪狂犬病毒PRV-DL14/08株为106TCID5Q/ml。
[0062] 1.3水貂免疫效力评价
[0063] 1.3.1免疫与攻毒
[0064] 将16只10周龄PRV抗体检测阴性水貂（中国农业科学院特产研究所动物实验中心） 随机分成4组，4只/组。第一组（4只）按照表3注射1.2节制备得到的水貂伪狂犬灭活疫苗 lml/只，第二组和第三组对照疫苗分别采用HB-98灭活疫苗和伪狂犬活疫苗Bartha-K61为 疫苗免疫组，肌肉注射单剂量佐剂疫苗，免疫1次;第四组(4只）为对照组皮下注射lmL PBS。 (结果见表3)。第一次免疫后21天，通过肌肉注射lml(106TCID5Q/只）PRV-DL14/08,攻毒后每 日测定水貂体温，观察临床症状和死亡情况。
[0065]表3免疫原性实验动物分组
[0066]
[0067] 1.3.2临床症状
[0068] 攻毒后l-10d，每日定时观察各组水貂的临床症状。
[0069] 1.3.3病毒排毒检测
[0070] 攻毒后ld-10d，每天采集各种水貂的鼻拭子，通过PCR方法检测水貂的排毒情况。
[0071] 1.3.4抗体检测
[0072] 各组水貂在免疫前0d，及免疫后1W(1周）、2W、3W、4W采血，分离血清，检测中和抗体 水平。
[0073] 2实验结果
[0074] 2.1疫苗免疫后水貂抗体水平
[0075] 疫苗免疫组在免疫后较高中和抗体，且随免疫时间逐步升高。对照组水貂未产生 抗体，见表4所示。
[0076] 表4水貂伪狂犬灭活疫苗免疫水貂后不同时间的抗体情况
[0077]
[0079] 2.2攻毒后水貂的临床症状
[0080] 整个攻毒阶段，灭活疫苗免疫水貂未出现表现可视临床症状。对照水貂在攻毒后 第2d开始表现精神沉郁，食欲下降、流涎、啃咬注射部位等症状，第3d出现水貂死亡，攻毒第 4d对照组全部死亡。见表5所示结果，水貂伪狂犬灭活疫苗免疫水貂后可有效阻断病毒感染 (出现临床症状），保护率可到达100%，而对照组水貂攻毒后4日后全部死亡。因此说明，本 发明的水貂伪狂犬灭活疫苗具有很好的保护力。另外相对于对照组商品化灭活疫苗和活疫 苗，注射本发明的水貂伪狂犬病毒灭活疫苗的水貂体温上升时间更短，食欲正常，并且没有 临床症状，显示出更好的免疫保护效果。
[0081 ]表5水貂伪狂犬灭活疫苗免疫水貂后的攻毒情况
[0082]
[0083] 2.3攻毒后的排毒情况
[0084]疫苗免疫所有水貂未检测到病毒排出；阴性对照组在攻毒后第2d开始出现排毒， 持续到攻毒后第4d至所有水貂死亡。
【主权项】
1. 一种伪狂犬病毒株，其特征在于，所述的伪狂犬病毒株命名为PRV-DL14/08，其保藏 号为CGMCC No. 12340，保藏日期为2016年5月31日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中心。2. 权利要求1所述的伪狂犬病毒株在制备防治伪狂犬疫苗中的用途。3. 根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的伪狂犬疫苗为水貂伪狂犬灭活疫 苗。4. 一种水貂伪狂犬灭活疫苗，其特征在于，含有灭活后的权利要求1所述的伪狂犬病毒 株 PRV-DL14/08 株。5. 根据权利要求4所述的水貂伪狂犬灭活疫苗，其特征在于，所述伪狂犬灭活疫苗中含 有的灭活后的伪狂犬病毒株PRV-DL14/08株彡10 6TCID5Q/头份。6. -种制备权利要求4或5所述的水貂伪狂犬灭活疫苗的方法，其特征在于，包括以下 步骤： 将权利要求1所述的伪狂犬病毒株PRV-DL14/08株增殖后进行病毒滴度测定，依所含免 疫剂量，加入灭活剂及佐剂后制备而成，所述伪狂犬疫苗中含有伪狂犬病毒株PRV-DL14/08 株彡106TCID 5q/头份。7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的伪狂犬病毒株PRV-DL14/08株的增 殖包括以下步骤： 在已长成单层PK15细胞中，按体积百分比1%的比例接种伪狂犬病毒株PRV-DL14/08 株，置于37°C，5%C02培养箱中，培养72h，反复冻融3次后收获，至-80°C保存，应不超过1年。8. 根据权利要求6所述的方法，其特种在于，所述的灭活剂为甲醛溶液，所述的佐剂为 铝胶。9. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，具体包括以下步骤： 在已长成单层PK15细胞中，按体积百分比1%的比例接种伪狂犬病毒株PRV-DL14/08 株，置于37°C，5%C02培养箱中，培养72h，反复冻融3次后收获病毒上清液14/08,按2份体积 的病毒上清液加5份体积的pH7.2-7.4 2% (w/w)氢氧化铝磷酸盐缓冲液的比例加入氢氧化 铝磷酸盐缓冲液，然后用20% (w/w)氢氧化钠将pH值调至7.2-7.4,按总体积的0.15%加入 甲醛溶液，振摇30分钟，然后放2-8°C灭活7日，期间每日上、下午各振摇1次，每次15-20分 钟，加入25% (w/w)铝胶，每隔12小时震动30min，制备得到所述的水貂伪狂犬灭活疫苗。
【文档编号】A61P31/22GK106085968SQ201610532700
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年7月7日
【发明人】闫喜军, 刘昊, 李欣彤, 胡博, 鲁荣光
【申请人】中国农业科学院特产研究所