表达鸡细小病毒vp2蛋白的重组新城疫耐热疫苗株及制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种表达鸡细小病毒VP2蛋白的重组新城疫耐热疫苗株及制备方法，所述的耐热疫苗株分类命名为rTS?VP2/CPV，于2016年4月19日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:V201627。该疫苗株在感染动物或细胞后，可高效表达鸡细小病毒的VP2蛋白。该毒株可用于制备鸡新城疫、细小病毒二联耐热活疫苗。CCTCC NO: V20162720160419
【专利说明】
表达鸡细小病毒VP2蛋白的重组新城疫耐热疫苗株及制备 方法
技术领域
[0001 ]本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种表达鸡细小病毒VP2蛋白的重组新城 疫耐热疫苗株及制备方法。
【背景技术】
[0002] 细小病毒对家禽，特别是鸭、鹅等水禽危害较大。鹅细小病毒感染，俗称鹅流感、小 鹅瘟，是一种侵害幼鹅和番鸭的高度接触传染性疾病，表现为急性、亚急性和慢性型，急性 型可引起10日龄内的雏鹅100%死亡。在大规模饲养鹅和番鸭的国家，该病具有重要的经济 意义。种鹅免疫接种可打打降低本病的影响。灭活疫苗或致弱活疫苗可诱导产生良好的免 疫反应，目前已有鹅细小病毒和番鸭细小病毒二价疫苗。但是未见有鸡细小病毒疫苗的研 究报道。
[0003] 随着分子生物学技术的不断进步，新型基因工程疫苗的研发不断取得突破，其中 基于新城疫病毒载体的新型多联活疫苗是研发热点之一，许多病原的免疫原性基因已经在 新城疫载体内成功表达，并取得了较好的免疫保护效果，如传染性法氏囊病毒的VP2蛋白、 H5亚型禽流感病毒的HA蛋白、狂犬病毒的G糖蛋白、严重急性呼吸综合征病毒的CoV蛋白、人 类免疫缺陷病毒的Gag蛋白等。此类疫苗具有可诱导全身性免疫(体液免疫、细胞免疫和粘 膜免疫）、高鸡胚生长特性、生产成本低廉、免疫方式简便(饮水、气雾、点眼/滴鼻等方式）、 安全(毒株间发生重组及毒力返强可能性极小)等优点。但现有的新城疫病毒载体疫苗均是 以非耐热型新城疫病毒为骨架构建的。
[0004] 现有已经上市的有鹅、番鸭细小病毒的灭活疫苗或活疫苗，但未见有鸡细小病毒 的疫苗研究报道。
[0005] 因此，如何提供一种具有耐热、稳定性强、冷藏条件要求低的表达鸡细小病毒VP2 蛋白的重组新城疫耐热疫苗株及制备方法是本领域技术人员亟待解决的技术问题。
【发明内容】
[0006] 针对现有技术中的不足，本发明进行了深入研究，提供了一种表达鸡细小病毒VP2 蛋白的重组新城疫耐热疫苗株及制备方法。
[0007] 本发明一方面涉及一种表达鸡细小病毒VP2蛋白的重组新城疫耐热疫苗株，其特 征在于所述的耐热疫苗株分类命名为rTS-VP2/CPV，于2016年4月19日保藏于武汉大学中国 典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC N0:V201627。
[0008] 本发明另一方面还涉及表达鸡细小病毒VP2蛋白的重组新城疫耐热疫苗株的制备 方法，其特征在于包括如下步骤：
[0009] 1.1鸡细小病毒VP2基因的PCR扩增
[0010] P C R扩增鸡细小病毒的V P 2基因，扩增引物为：上游引物V -CAGCTATATTAAGGATTAAGAAAAAATACGGGTAGAAAGCTTGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGCTGATGAAAATGA ACCAG-3'，下游引物5' -ATCGGGGCACTCCGATTCTACCCGTATTTTTTCTTAATTATTATTAGTTGGTTCTGG GAGCC-3'，对PCR产物进行琼脂糖凝胶回收纯化后，测定DNA浓度，待进行克隆连接；
[0011] 1.2新城疫病毒耐热载体片段的PCR扩增
[0012] 以超长片段PCR的方法获得新城疫病毒载体序列，扩增引物为：上游引物5Y-TCGGAGTGCCCCGATTGTGCCAAGATGGAC-3'，下游引物5' -TCCTTAATATAGCTGAATTGATTGCAGCTGC-3'，扩增模板为新城疫病毒耐热株质粒PTS09-C，对PCR产物进行回收纯化，测定其浓度，待 克隆连接；
[0013] 1.3重组质粒pTS-VP2/CPV的克隆连接
[0014]采用In-fusion克隆连接技术，将纯化好的VP2基因片段和耐热载体片段进行克隆 连接(连接序列为GCCATGGGTAACTTT和ATGGTGAGCAAGGGC)，连接产物转化DH5a感受态细胞， 转化后的细胞在LB平皿上培养16小时后挑单菌落进行液体培养，对菌液进行VP2基因的PCR 鉴定，鉴定为阳性的菌液进彳丁质粒提取；
[0015] 1 · 4重组病毒rTS-VP2/CPV的拯救恢复
[0016] 采用脂质体转染法，将已构建的重组质粒PTS-VP2/CPV与三个分别表达NP、P和L蛋 白的辅助质粒共转染BHK-21细胞，转染后72小时，反复冻融收获细胞液，接种9-11日龄SPF 鸡胚。接种后5天，收获鸡胚尿囊液，分离得到表达鸡细小病毒VP2蛋白的重组新城疫耐热疫 苗株。
[0017] 本发明还涉及上述表达鸡细小病毒VP2蛋白的重组新城疫耐热疫苗株在制备重组 病毒中的应用。
[0018] 本发明还涉及上述表达鸡细小病毒VP2蛋白的重组新城疫耐热疫苗株在制备鸡细 小病毒、新城疫二联耐热活疫苗中的应用。
[0019] 本申请公开了一种表达鸡细小病毒VP2蛋白的重组新城疫耐热疫苗株，该疫苗株 具有显著的耐热特性，可极大降低对冷链系统的依赖，节省保存运输成本和提高疫苗热稳 定性。该毒株在感染动物或细胞后，可高效表达鸡细小病毒VP2蛋白。该毒株可用于制备鸡 细小病毒、新城疫二联耐热活疫苗。
【附图说明】
[0020] 图1为本发明表达鸡细小病毒VP2蛋白的重组耐热新城疫病毒全长质粒的构建示 意图。其中rTS09-C为亲本株的基因组结构，rTS-VP2/CPV为在rTS09-C基因组中插入了 VP2 蛋白后的结构，详细标注了插入序列的整体序列组成。
【具体实施方式】
[0021] 下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施 例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示 的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明 的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均在本发明的保护范围内。
[0022] 实施例1
[0023] 第一步、重组全长质粒pTS-VP2/CPV的构建与鉴定
[0024] 1.1鸡细小病毒VP2基因的PCR扩增
[0025] P C R扩增鸡细小病毒的V P 2基因，扩增引物为：上游引物V -CAGCTATATTAAGGATTAAGAAAAAATACGGGTAGAAAGCTTGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGCTGATGAAAATGA ACCAG-3'，下游引物5' -ATCGGGGCACTCCGATTCTACCCGTATTTTTTCTTAATTATTATTAGTTGGTTCTGG GAGCC-31下划线部分为用于In-fusion克隆连接的互补序列）。琼脂糖凝胶电泳检测目的 条带约1.7kb，与预期的1711bp相符(VP2基因长度为1620bp，分别在VP2基因前端和后端引 入了基因起始序列和基因终止序列，同时在VP2基因前端引入了Kozak序列）。对PCR产物进 行琼脂糖凝胶回收纯化后，测定DNA浓度，待进行克隆连接。
[0026] 1.2新城疫病毒耐热载体片段的PCR扩增
[0027]以超长片段PCR的方法获得新城疫病毒载体序列，扩增引物为：上游引物5Y-TCGGAGTGCCCCGATTGTGCCAAGATGGAC-3'，下游引物5' -TCCTTAATATAGCTGAATTGATTGCAGCTGC-31下划线部分为用于In-fusion克隆连接的互补序列）。扩增模板为新城疫病毒耐热株质 粒PTS09-C。琼脂糖凝胶电泳检测目的条带约18kb，与预期的17.8kb大小相符。对PCR产物进 行回收纯化，测定其浓度，待克隆连接。
[0028] 1 · 3重组质粒pTS-VP2/CPV的克隆连接
[0029]按照图1所示的方式，采用In-fusion克隆连接技术，将纯化好的VP2基因片段和耐 热载体片段进行克隆连接。连接产物转化DH5a感受态细胞，转化后的细胞在LB平皿上培养 16小时后挑单菌落进行液体培养。对菌液进行VP2基因的PCR鉴定。鉴定为阳性的菌液进行 质粒提取，待酶切和测序鉴定。
[0030] 1 · 4重组质粒PTS-VP2/CPV的酶切与测序鉴定
[0031]分别以BamHI和Mlul内切酶对全长重组质粒进行酶切鉴定，均得到了与预期相符 的酶切图谱。将酶切鉴定正确的重组质粒PTS-VP2/CPV送至测序公司进行序列测定，结果表 明鸡细小病毒的VP2基因插入到了新城疫病毒耐热载体的P和Μ基因之间，且所有序列与预 期完全一致，重组质粒PTS-VP2/CPV构建成功。
[0032] 第二步、重组病毒rTS-VP2/CPV拯救恢复与鉴定 [0033] 2 · 1重组病毒rTS-VP2/CPV的拯救恢复
[0034]采用脂质体转染法，将已构建的重组质粒pTS-VP2/CPV与三个分别表达NP、P和L蛋 白的辅助质粒共转染BHK-21细胞(已预感染表达T7RNA聚合酶的痘苗病毒）。转染后72小时， 反复冻融收获细胞液，接种9-11日龄SPF鸡胚。接种后5天，收获鸡胚尿囊液，待进行新城疫 病毒检测。
[0035] 2.2重组病毒的血凝效价和荧光定量PCR检测
[0036] 以血凝试验和荧光定量PCR的方法，对收获鸡胚尿囊液进行检测，结果均为新城疫 阳性。初步表明重组病毒rTS-VP2/CPV拯救成功。
[0037] 2.3重组病毒VP2基因的PCR扩增与测序
[0038] 应用鸡细小病毒的VP2基因的特异性扩增引物，对重组病毒rTS-VP2/CPV的VP2基 因进行RT-PCR扩增，对PCR扩增产物进行序列测定分析，得到1711bp长的VP2基因序列（SEQ ID No. 1)，从5'到3'端，依次包含了P基因的部分非编码区序列(UTR)、P基因的基因终止序 列(GE)、中间序列（IG)、VP2基因的基因起始序列(GS)、Kozak序列、VP2基因序列、VP2基因的 双重终止密码子、VP2基因的GE序列、IG序列、Μ基因的GS序列和Μ基因的UTR序列。与预期序 列100%-致。
[0039] 第三步、鸡细小病毒VP2蛋白在重组病毒rTS-VP2/CPV中的表达验证
[0040] 3.1间接免疫荧光法检测截VP2蛋白的表达
[0041 ] 将重组病毒rTS-VP2/CPV和rTS09-C(对照)分别以0.01M0I感染BHK-21细胞，24h后 进行间接免疫荧光检测，一抗为NDV阳性鸡血清或鸡细小病毒阳性血清。检测结果表明，重 组病毒rTS-VP2/CPV感染的细胞内，使用NDV阳性鸡血清或鸡细小病毒阳性血清作为一抗时 均能检测到绿色荧光，而rTS09-C株感染的细胞只在NDV阳性血清作用下检测到荧光。
[0042] 3.2Western Blot法检测VP2蛋白的表达
[0043] 将重组病毒rTS-VP2/CPV和rTS09-C(对照)分别以0.01M0I感染BHK-21细胞，24h后 收集细胞裂解液，以鸡细小病毒阳性血清为一抗进行Western Blot检测。检测结果表明，在 60KDa附近出现一条明显的目的条带，与预期的60.78KDa大小相近。表明VP2蛋白在重组病 毒感染的细胞内正确表达。
[0044] 第四步、重组病毒rTS-VP2/CPV的生物学特性鉴定
[0045] 4.1重组病毒的增殖特性测定
[0046] 为比较重组病毒rTS-VP2/CPV株与亲本rTS09-C株的生长增殖情况，将两株病毒分 别以100TCID5q接种BHK-21细胞，接种后24h、48h、72h、96h取上清500μ1，测定病毒TCID 5q，绘 制病毒的生长曲线。结果表明，重组病毒rTS-VP2/CPV株和亲本rTS09-C株在BHK-21细胞的 生长曲线相似，增殖滴度相近，约为10 7· WciDso/ml。
[0047] 4.2重组病毒的致病性测定
[0048] 测定重组病毒对鸡胚的最小致死剂量的平均致死时间（MDT/MLD)，结果显示不同 稀释度（ΠΓ1至ΠΓ9)的病毒接种鸡胚后的120h内均不会对鸡胚致死，重组病毒rTS-VP2/CPV 的MDT/MLD大于120h，表明重组病毒保持了亲本株的低毒特性，外源基因的插入并未改变重 组病毒的致病性。
[0049] 4.3重组病毒的耐热特性测定
[0050] 测定重组病毒在56 °C环境下的HA耐热特性，同时设置非耐热株LaSota株和耐热株 rTS09-C株为对照。如表1所示，非耐热株LaSota在56°C耐热处理9min后，HA效价降为0,亲本 株rTS09-C和重组病毒rTS-VP2/CPV在56°C耐热处理150min后仍具有血凝活性。表明重组病 毒rTS-VP2/CPV的耐热特性与亲本株一致，均为耐热株。（该病毒株已经保藏，保藏在武汉大 学中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO: V201627)。
[0051 ]表1.重组病毒的HA耐热特性测定结果
[0052]
[0053] a表示病毒具有血凝活性，|3表示病毒没有血凝活性
[0054] 以上所述实施例只是本发明的较佳实例，而没有限制本发明的实施范围。因此，凡 是根据本
【发明内容】
的实质所作出的等效修改，都应属于在本发明的保护范围内。
【主权项】
1. 表达鸡细小病毒VP2蛋白的重组新城疫耐热疫苗株，其特征在于所述的耐热疫苗株 分类命名为rTS-VP2/CPV，于2016年4月19日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保 藏号为CCTCC N0:V201627。2. 表达鸡细小病毒VP2蛋白的重组新城疫耐热疫苗株的制备方法，其特征在于包括如 下步骤： 1.1鸡细小病毒VP2基因的PCR扩增 P C R扩增鸡细小病毒的V P 2基因，扩增引物为：上游引物5 7 -CAGCTATATTAAGGATTAAGAAAAAATACGGGTAGAAAGCTTGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGCTGATGAAAATGA ACCAG-3'，下游引物5' -ATCGGGGCACTCCGATTCTACCCGTATTTTTTCTTAATTATTATTAGTTGGTTCTGG GAGCC-3'，对PCR产物进行琼脂糖凝胶回收纯化后，测定DNA浓度，待进行克隆连接； 1.2新城疫病毒耐热载体片段的PCR扩增 以超长片段PCR的方法获得新城疫病毒载体序列，扩增引物为：上游引物5'-TCGGAGTGCCCCGATTGTGCCAAGATGGAC-3'，下游引物5' -TCCTTAATATAGCTGAATTGATTGCAGCTGC-3'，扩增模板为新城疫病毒耐热株质粒PTS09-C，对PCR产物进行回收纯化，测定其浓度，待 克隆连接； 1.3重组质粒pTS-VP2/CPV的克隆连接 采用In-fusion克隆连接技术，将纯化好的VP2基因片段和耐热载体片段进行克隆连 接，连接序列为GCCATGGGTAACTTT和ATGGTGAGCAAGGGC，连接产物转化DH5a感受态细胞，转化 后的细胞在LB平皿上培养16小时后挑单菌落进行液体培养，对菌液进行VP2基因的PCR鉴 定，鉴定为阳性的菌液进彳丁质粒提取； 1.4重组病毒rTS-VP2/CPV的拯救恢复 采用脂质体转染法，将已构建的重组质粒PTS-VP2/CPV与三个分别表达NP、P和L蛋白的 辅助质粒共转染BHK-21细胞，转染后72小时，反复冻融收获细胞液，接种9-11日龄SPF鸡胚。 接种后5天，收获鸡胚尿囊液，分离得到表达鸡细小病毒VP2蛋白的重组新城疫耐热疫苗株。3. 权利要求1所述的表达鸡细小病毒VP2蛋白的重组新城疫耐热疫苗株在制备重组病 毒中的应用。4. 权利要求1所述的表达鸡细小病毒VP2蛋白的重组新城疫耐热疫苗株在制备鸡细小 病毒、新城疫二联耐热活疫苗中的应用。
【文档编号】A61P31/14GK106085971SQ201610428715
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月15日
【发明人】邵华斌, 温国元, 罗青平, 罗玲, 王红琳, 张腾飞, 汪宏才, 张蓉蓉, 卢琴, 艾地云
【申请人】湖北省农业科学院畜牧兽医研究所