青霉素结合蛋白Bt?pbp2X及其应用
【专利摘要】本发明提供了一种新型的青霉素结合蛋白Bt?pbp2X及其编码基因，所述蛋白具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列，或SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸且具有同等活性的蛋白。本发明的蛋白质可以用于制备青霉素类抗生素检测试剂，应用于青霉素类抗生素残留的快速检测，其不需要复杂的仪器设备，样品前处理过程非常的简单，并且对于检测人员技术及知识水平有特定要求，非常适于现场快速检测。
【专利说明】
青霉素结合蛋白Bt-pbp2X及其应用
技术领域
[0001 ]本发明属于生物技术领域，涉及一种青霉素结合蛋白及其应用。
【背景技术】
[0002] 随着我国大众生活水平的不断提高，人们对食品安全的关注度越来越高，食品中 抗生素过量残留的问题已经引起人们的强烈反响。内酰胺类抗生素指其分子结构中含有 内酰胺环的一大类抗生素，包括青霉素及其衍生物、头孢菌素、单酰胺环类、碳青霉烯和 青霉烯类酶抑制剂等，以及新发展的头霉素类、硫霉素类、单环内酰胺类等其他非典型β_ 内酰胺类抗生素。它是现有在食品中添加的抗生素中使用最普及的一类。长期摄入内酰 胺类抗生素过量残留的食品将严重导致人们身体健康，抗生素过量残留能破坏胃肠道等菌 群的平衡，引起长期的腹泻、维生素缺乏及影响其他治疗药物的疗效;摄入内酰胺类抗生 素过量残留的食品会导致一部分人群的过敏反应，较轻者表现为荨麻疹、发热、关节肿痛及 蜂窝组织炎等病症，严重时可引起喉头水肿、呼吸困难、过敏性休克，甚至危及生命的危害； 长期摄入抗生素过量残留的食品会增强体内细菌对人体的耐药性，以至于出现预想的超级 细菌，当人体出现疾病时，可增加治疗难度甚至导致治疗失效。
[0003] 随着乳品中抗生素残留问题的日益严峻，我国对乳品质量的监管也日趋严格， 2007年我国通过了《生鲜乳品收购标准修正案》，其中明确将抗生素残留检验列为强制检测 项目并明确制定了各类抗生素在牛乳中的最高残留限量。
[0004] 目前，国内乳品行业广泛应用的牛乳中青霉素残留的检测方法主要依据国标 GB4789.27-94《鲜乳中抗生素残留量检测方法》进行，包括试管法和平板法。商检系统的行 业标准检测方法为杯碟法。尽管微生物法在基层单位使用广泛，但该法的精确度、准确度都 不够高，且检测过程烦琐，耗时较长，不易筛选到敏感菌株，易受其它抗菌药物的影响，根本 无法适应牛乳抗生素残留检测需要。
【发明内容】
[0005] 本发明的第一个目的在于提供一种青霉素类抗生素结合蛋白。
[0006] 本发明的第二个目的在于提供编码所述青霉素类抗生素结合蛋白的基因。
[0007] 本发明的第三个目的在于提供所述蛋白在检测青霉素类抗生素中的应用。
[0008] 本发明从苏云金芽孢杆菌中得到了一种新型的与青霉素具有高亲和力的蛋白质 Bt-pbp2X，该蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，序列全长699个氨基酸，表观分子量为 76101.4Da，等电点约为8.80,该蛋白质是一种细菌细胞壁合成过程中具有转肽和转糖催化 作用的双功能，该酶参与细菌细胞壁肽聚糖的生物合成，并在合成过程中发挥糖基转移酶 活性，该酶第30到582氨基酸类似于细胞分裂蛋白FtsI，第60到212氨基酸为二聚体结构域 pfam03717,第262到565氨基酸转肽酶结构域pfam00905。
[0009] 应当理解，此领域相关技术人员可以根据此发明公开的蛋白Bt-pbp2X的氨基酸序 列（SEQ ID No.2)，在不影响其生物活性的前提下，取代、缺失和/或增加一个或几个氨基 酸，得到所述蛋白的突变序列。例如在非活性区段，将第80位的Asn替换为Asp，将第190位的 Glu替换为Gly或Ala，将第240位的Gin替换为Thr，将第320位的Lys替换为His，将第56~105 位氨基酸缺失，将第1位Met增加6个His组氨酸纯化标签或增加 GST标签。因此，本发明的Bt-pbp2X蛋白还包括SEQ ID No.2所示氨基酸序列经取代、替换和/或增加一个或几个氨基酸， 具有与Bt-pbp2X同等活性的由Bt-pbp2X衍生得到的蛋白质。
[0010]进一步本发明提供编码上述青霉素结合蛋白Bt-pbp2X的基因。
[0011]优选地，所述核苷酸序列为：（1)序列表SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列，或（2)SEQ ID No. 1所示核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个核苷酸，编码Bt-pbp2X的核苷 酸序列。
[0012] 此外，应理解，考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域相关 技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。
[0013] 本发明的基因和蛋白质可以从苏云金芽孢杆菌中克隆或分离得到，或者通过DNA 或肽合成的方法得到。
[0014] 可将本发明基因与表达载体可操作地连接，得到能够表达本发明蛋白的重组表达 载体，进而可以通过本领域所熟知的转基因方法转入到其他菌种中，使其具有表达所述蛋 白的能力。
[0015] 在本发明的一个实施例中，将PCR扩增得到的Bt-pbp2X基因插入到表达载体 pET28a( + )上构建得到重组表达载体pET28a( + )-pbp2X，并最终转化大肠杆菌表达宿主 E.coli BL21(DE3)，使其能诱导表达获得Bt-pbp2X蛋白。
[0016] 进一步，此发明提供了一种专门用于检测食品中青霉素类抗生素残留的检测试 剂，其包括所述的Bt_pbp2X蛋白。所述的用于检测的食品可以是固态、半固态、液态等。固态 食品可以通过简单的研磨、粉碎等方式处理后溶于相应溶剂，使食品中青霉素得以释放，并 用于青霉素的检测。半固态食品直接向其中加入相应的溶剂使青霉素释放，并进行检测。液 态食品可以是饮料、牛奶等，一般可以直接进行检测。
[0017] 本发明提供的Bt-pbp2X蛋白质具有与β-内酰胺环类抗生素进行特异性结合的能 力，可将其应用用于食品中β-内酰胺环类抗生素残留的检测，用此技术研发的产品不需要 特殊的仪器设备，样品前处理过程简单方便，并且对检测人员的技术以及知识水平要求低， 方便用于食品以及家庭进行现场的快速检测。
【附图说明】
[0018] 图1是PCR扩增Bt-pbp2X基因的凝胶电泳图，其中Μ是DNAMaker，l、2为以苏云金芽 孢杆菌BMB171为模板PCR扩增得到的Bt-pbp2X基因。
[0019] 图2是重组质粒pET28a( + )-pbp2X图谱。
[0020]图3是pET28a( + )-Bt-pbp2X的验证，Μ为DNA Maker，l、2为pET28a( + )-Bt-pbp2X，经 EcoRV，Xhc^酶切结果，片段大小分别为3.9kb，3.4kb。
[0021 ]图4是Bt-pbp2X蛋白质的纯化结果，其中，Μ是蛋白分子量标准，1是诱导上清，2是 纯化蛋白。
[0022]图5是不同青霉素浓度与Bt_pbp2X蛋白质发生特异性相互作用后微热泳变化。 [0023]图6是使用Bt_pbp2X蛋白质测定青霉素含量标准曲线。
【具体实施方式】
[0024]实施例1 Bt_pbp2X蛋白的制备 [0025] 1、苏云金芽孢杆菌总DNA提取
[0026] (1)将苏云金芽孢杆菌菌株BMB171接种于5ml PA瓶中28°C过夜活化，次日按1%接 种量转接至50ml液体培养基中LB培养基中，28°C，200r/min培养至对数生长期，离心收集菌 体，STE洗一次。
[0027] (2)加5.75ml Solution I(25mM Tris-HCl(pH8.0)，10mM EDTA，50mM葡萄糖）和 250yL溶菌酶(200mg/mL)冰浴过夜，
[0028] (3)加 3ml 10%SDS 于 50-60°C 水浴 30min;随后加入 3.6ml5MNaCl，冰上 lOmin 后直 接加入苯酸:氯仿:异戊醇（25:24:1)去除蛋白质；1200〇1'/111；[11，离心15111；[11后取上清，加2倍 体积无水乙醇沉淀。70 %乙醇洗涤一次。
[0029] (4)干燥沉淀，用200yL ddH20或TE溶30min。并用琼脂糖凝胶电泳和分光光度计检 测总DNA的浓度和质量。
[0030] 2、引物设计与合成
[0031]根据苏云金芽孢杆菌BMB171中预测的基因序列，设计上下游引物，并在上游引物 引入酶切位点及其保护碱基，下游引物引入酶切位点及其保护碱基，引物由北京奥科生物 科技有限公司合成。
[0032] 上游引物CCGCATATGATGAAGTGGACAAAAAG (下划线为Ndel酶切位点，灰色背景为保 护碱基）
[0033] 下游引物CCGCTCGAGTTAGTCTCCTAAAGTTAA (下划线为Xhol酶切位点，灰色背景为保 护碱基）
[0034] 3、PCR扩增Bt-pbp2X基因，具体反应体系如下：
[0035] DNA 模板，0.5yL
[0036] 上游引物，1此
[0037] 下游引物，1此
[0038] 10倍Buffer，2.5yL
[0039] dNTP 混合物（2.5mmol/L)，2yL
[0040] pfu Tap酶，lyL
[0041] ddH20，17yL
[0042] 反应条件如下：95°C预变性5min; 95°C0.5min，55 °C0.5min，72°C2min，30个循环； 72°C延伸lOmin，产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，回收目的片段(图1)。
[0043] 4、Bt_pbp2X蛋白表达菌株的构建
[0044] 回收的PCR产物37°CNdeI和Xhol双酶切4小时，载体pET-28a也经过Ndel和Xhol双 酶切4小时，T4连接酶将外源基因与pET-28a连接成pET28a( + )-pbp2X重组载体（图2)，经 EcoRV，XhoI酶切验证为3.9kb，3.4kb符合预期（图3)，转入E. coli DH5a菌株;提取含有Bt-pbp2X基因的重组载体pET28a (+) -pbp2X转化大肠杆菌表达宿主E · co 1 i BL21 (DE3)。
[0045] 5、Bt_pbp2X 蛋白的诱导
[0046] 将含有重组质粒pET28a( + )-pbp2X的E.coli BL21(DE3)在平板上挑取单菌落，接 种含有卡拉霉素的LB液体培养基中，37 °C过夜活化培养，约14小时后，将菌液按1 /100比例 加入新鲜的卡拉霉素 LB液体培养基，200r/min培养至0D6q() = 0.8~1.0，加入IPTG诱导（IPTG 终浓度为〇. lmM)200r/min，16°C培养12小时，将培养瓶置于冰上5分钟；4°C，12000r/min离 心收集菌体，预冷的ddH 20重悬菌体沉淀，再次离心收集菌体，备用。
[0047] 6、Bt_pbp2X 蛋白的纯化
[0048] 用4°C的Soluble Binding BufTer(10mM咪挫，NaCl 0.5M，20mM Tris_HCl，pH = 7.9)重悬菌体，置于冰上超声波破碎至悬液变澄清;4°C，12000r/min离心60分钟，收集上清 液，经〇.45μπι微孔滤膜过滤后缓缓加入到Ni琼脂糖凝胶柱中，随后使用15倍柱体积的 Soluble Binding Buffer冲洗柱子，洗脱杂蛋；然后用Elution Buffer(500mM咪唑，0.5M NaCl，20mMTris-HCl，pH = 7.9)洗脱柱子，收集洗脱液。随后15KDa截流管去除咪唑，得到纯 化蛋白质Bt-pbp2X，SDS-PAGE鉴定提取蛋白为单一条带无明显杂蛋白（图4)。经测序鉴定为 本发明Bt_pbp2X。
[0049] 实施例2微量热泳动仪(MST，NanoTemper Technologies)测定Bt_pbp2X测定青霉 素相互作用
[0050] 微量热泳动仪(MST)是基于下述原理:将蛋白进行荧光标记，采用红外激光光源产 生一个温度场，小分子化合物与荧光标记的蛋白结合后导致蛋白电荷、构象等发生改变，则 荧光标记的蛋白在温度场中的热泳动快慢发生变化，这种变化反应在荧光值的变化上。将 小分子稀释为一定的梯度浓度，若小分子与焚光标记的蛋白有结合，贝U焚光标记蛋白的热 泳动变化也呈一定的规律性，由此可以拟合出二者的结合曲线，求得小分子和蛋白的解离 常数(Kd值)。
[0051 ] l、Bt-pbp2X蛋白的荧光标记
[0052] 依据试剂盒说明书，将纯化后的Bt-pbp2X蛋白浓度稀释16μΜ，使A柱进行buffer exchange，取100yL蛋白样品加入94yL Labe 1 ing buffer和6yLRED_NHS染料混勾，于室温黑 暗中孵育30min。孵育结束后，用B柱(分子筛)将游离的未结合染料和已经标记的蛋白样品 分离，最终获得约500yL标记的Η亚基蛋白样品用于相互作用分析。
[0053] 2、Bt_pbp2X蛋白与青霉素相互作用测定
[0054]测定已经标记的Bt_pbp2X蛋白样品荧光值，筛选不同的稀释浓度调节荧光值在 200-1500范围之间。经筛选确定，将蛋白样品用roS稀释20倍并加入终浓度为0.1 %的吐温-20以减小蛋白在毛细管内壁的附着。将青霉素溶于PBS缓冲溶液中配制成将小分子配体，即 青霉素溶解于PBS中配制成母液，再用PBS稀释不同的浓度梯度。浓度梯度为0.00375、 0·0075、0·015、0·03、0·0625、0·125、0·25、0·5、1·0、2·0、4·0、8·0、16·0、32·0、64·0、128·0μ Μ的标准溶液。稀释后的蛋白样品和小分子配体化合物于12000rpm，4°C下离心5min，随后分 别取上清，然后用PBS将小分子配体化合物进行梯度稀释，共16个浓度梯度。将蛋白样品上 清与16个不同浓度的小分子配体化合物1:1混合，填充16根毛细管，进行微量热泳动分析。
[0055] 3、相关性分析
[0056] 相关性分析使用统计软件SPSS进行，采用双变量皮尔逊相关性分析，双尾（two-tailed)检验，在0.05水平上检验其显著性。经测定Bt-pbp2X蛋白与青霉素亲和常数Kd = 10.36nmol/L(图 5)。
[0057] 实施例3 Bt_pbp2X蛋白检测青霉素标准曲线的绘制
[0058] 1、青霉素标准样品的制备
[0059]青霉素溶于PBS缓冲溶液配置成浓度为lyg/m L的标准使用溶液，向已知无抗牛奶 中加入此溶液调配含青霉素浓度一定的标准样品。随后，标准样品置于摇床15min充分混 匀。
[0060] 2、Bt-pbp2X 包被酶标板
[00611向酶标板微孔中加入l00yL青霉素结合蛋白Bt-pbp2X溶液(4yg/mL)，4°C放置过 夜，以使Bt-pbp2X蛋白固定于微孔表面。倾去孔内液体，每孔加入PBS缓冲溶液(300yL，洗涤 3遍，滤纸上拍干。
[0062] 3、酶标板的封闭
[0063] 每空加入150yL 2%BSA封闭液，37°C孵育3小时，使用roS缓冲溶液洗涤3次后，滤 纸上拍干。
[0064] 4、加入标准溶液样品
[0065] 将青霉素溶于roS缓冲溶液中配制成质量梯度为0、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、 16.0、32.0、64.0、128.0、256. Oyg/L的标准溶液。每孔中加入50yL不同梯度的标准溶液，再 加入50yL辣根过氧化物酶标记的青霉素(HRP-Amp)，37°C孵育30min，倾去孔内液体，用TOST 溶液洗涤4次后，滤纸上拍干。
[0066] 5、加入酶解底物显色
[0067] 加入100此新配置的四甲基联苯胺溶液(TMB)，避光37°C孵育lOmin。立即向每孔中 加入50yL 2M H2SO4终止液，蓝色变黄色。
[0068] 6、测定吸光值
[0069] 使用酶标仪lOmin内测测定微孔在450nm处的吸光A450。反应过程中，青霉素和 HRP-Amp竞争性结合Bt-pbp2X，若样品中含有青霉素越多，HRP-Amp结合在受体上的量越少， 最终导致酶解液的吸光度变小，即样品中的青霉素浓度与微孔中酶解液的吸光度值成反 比。
[0070] 7、标准曲线建立
[0071] 以标准样品浓度为横坐标，标准样品的％吸光度值为纵坐标，用SPSS软件，绘制标 准曲线。当青霉素浓度在0到256yg/的时候，吸光度与青霉素浓度有线性关系44 5〇 =-0·12781η(〇ΜΡ)+1·1067，Κ2 = 0·9757(图 6)。
[0072]实施例4利用Bt_pbp2X蛋白测定与牛奶中青霉素残留 [0073] 1、检测样品的前处理
[0074]脱脂奶样本直接上样检测，纯牛奶样本5000转/分，离心5分钟，脱脂后直接检测。 [0075] 2、牛奶中青霉素残留含量的测定
[0076]按照实施例2方法依次配置不同浓度的青霉素标准脱脂牛奶样品，酶标仪测定微 孔在450nm处的吸光度A45Q，以标准样品浓度为横坐标，标准样品的％吸光度值为纵坐标，用 Origin 8软件，绘制标准曲线。取不同浓度下牛奶样品，使用酶标仪测定微孔在450nm处的 吸光A45Q。重复3次，每次6个平行，带入标准曲线公式计算出牛奶中青霉素的含量。
[0077] 3、准确性(添加回收率)的测定
[0078]在不含有青霉素的脱脂牛奶中添加一定量的青霉素，添加终浓度为5、10、20ng/ mL，然后用实施例3方法检测样品中青霉素的含量，每个样品做6个平行样(n = 6)。测定结果 表明，此方法具有很好的精密度及回收率，牛奶中添加浓度为5ng/mL时，回收率平均达到 94.4%±6.32%;添加浓度为10ng/mL时，回收率平均达到93.8 % ± 5.72 % ;添加浓度为 20ng/mL时，回收率平均达到93.4 % ± 5.24 % ;在添加浓度为Ong/m L中，没有出现假阳性， 也没有假阴性(表1)。
[0079]表1:准确性(添加回收率)的测定 [0080]
【主权项】
1. 一种与青霉素类抗生素结合的蛋白质，其氨基酸序列是： 1. SEQ ID No.2所示的氨基酸序列；或 2. SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸且具有同 等活性的蛋白。2. 编码权利要求1所述蛋白的基因。3. 如权利要求2所述的基因，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。4. 含有权利要求2或3所述基因的表达载体。5. 由权利要求4所述表达载体转化的宿主细胞。6. 如权利要求5所述的宿主细胞，其为大肠杆菌。7. 含有权利要求所述蛋白的检测试剂。8. 权利要求1所述蛋白在检测青霉素残留中的应用。9. 一种检测青霉素类抗生素残留的方法，其是用权利要求1所述蛋白与样品中的青霉 素相结合，并检测结合的结果。10. 根据权利要求9所述的方法，其特征在于，将所述蛋白与标准品中的青霉素结合，并 建立标准曲线，根据标准曲线确定样品中青霉素的含量。
【文档编号】C12N9/10GK106085982SQ201610697616
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年8月18日 公开号201610697616.8, CN 106085982 A, CN 106085982A, CN 201610697616, CN-A-106085982, CN106085982 A, CN106085982A, CN201610697616, CN201610697616.8
【发明人】鞠守勇, 陈其国, 朱虹翼, 徐顺高, 王超
【申请人】武汉职业技术学院