双链dna酶、其编码核苷酸及该酶的制备方法与应用
【专利摘要】本发明公开了一种堪察加拟石蟹来源的双链DNA酶及其制备方法，包括表达质粒构建，表达菌株构建，蛋白表达和纯化方法以及双链DNA酶活性测定方法。编码该双链DNA酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明中公开的双链DNA酶可用于RT?PCR技术中，特异性地去除双链DNA模板，在生物技术领域具有重要的应用。
【专利说明】
双链DNA酶、其编码核苷酸及该酶的制备方法与应用
技术领域
[0001]本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种双链DNA酶、其编码核苷酸及该酶的制备 方法与应用。
【背景技术】
[0002] 逆转录PCR或者称为反转录PCR(reverse transcription-PCR，RT_PCR)，是聚合酶 链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再 以此为模板通过PCR进行DNA扩增。由一条RNA单链转录为互补DNA(cDNA)称作"逆转录"，由 依赖RNA的DNA聚合酶(逆转录酶)来完成。随后，DNA的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖 DNA的DNA聚合酶完成，随每个循环倍增，即通常的PCR。原先的RNA模板被RNA酶Η降解，留下 互补DNA。
[0003] RT-PCR的指数扩增是一种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的RNAdRT-PCR广泛 应用于遗传病的诊断，检测基因表达的方法，并且可以用于定量监测某种RNA的含量。real-time PCR(实时荧光PCR)技术也被用来做定量分析，它们比普通PCR进行定量分析时灵敏度 更高，定量更精确。RT-PCR检测的关键步骤是反转录后的cDNA模板中不应含有双链DNA污 染，因此需要有一种特异性酶解双链DNA的酶，此酶不降解单链cDNA。
【发明内容】
[0004] 为了解决RT-PCR检测cDNA模板中有可能污染的基因组DNA的问题，本发明提供了 一种具有特异性的双链DNA酶及其应用，具体通过以下技术方案实现：
[0005] 本发明提供了一种编码双链DNA酶的核苷酸，核苷酸的序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0006] 本发明还提供了一种表达双链DNA酶的重组质粒，该重组质粒包含如SEQ ID NO. 1 所示的核苷酸序列。
[0007] 进一步地，上述重组质粒的融合蛋白表达载体为pET28a-NusA-TEV。
[0008] 本发明还提供了一种重组表达转化体，其特征在于，该转化体包含如SEQ ID NO. 1 所示的核苷酸序列。
[0009] 本发明还提供了一种双链DNA酶，该双链DNA酶包含由如SEQ ID NO. 1所示的核苷 酸序列编码的氨基酸序列。
[0010]本发明还提供了上述双链DNA酶的制备方法，包括以下步骤：
[0011]步骤1、人工合成如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列，并在该核苷酸序列的5'端和 3'端分别设置限制性内切酶位点，将得到的核苷酸序列克隆至融合蛋白表达载体，测序，得 到包含如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列的质粒；
[0012] 步骤2、将步骤1中得到的所述质粒转化入表达菌株，进行蛋白表达，并使用rTEV酶 酶解该蛋白，按照1U rTEV酶加入3ug NusA-dsDNase蛋白比例，在lXrTEV Buffer(50mM Tris，pH8.0,0.5mM EDTA，lmM DTT)中3(TC酶解lh。
[0013] 使用肝素柱和镍柱纯化酶解得到的蛋白。
[0014] 进一步地，上述步骤1中，设置在所述5'端的限制性内切酶位点为EcoR I，设置在 所述3 '端的限制性内切酶位点为Xho I。
[0015] 进一步地，上述步骤2中，表达菌株为大肠杆菌表达菌株Rosseta(DE3)。
[0016]优选地，该双链DNase的制备方法包括以下步骤：
[0017] 步骤1、人工合成SEQ ID NO. 1序列，并在该序列的5'端和3'端分别设置限制性内 切酶位点EcoR I和Xho I，将得到的DNA序列克隆至蛋白表达载体pET28a-NusA-TEV，测序， 得到包含该SEQ ID N0.1 序列的质粒pET28a-NusA-TEV-dsDNase;
[0018] 步骤2、将步骤1中得到的质粒pET28a-NusA-TEV-dsDNase转化入大肠杆菌表达菌 株R〇SSeta(DE3)，进行蛋白表达，并使用rTEV酶酶解该蛋白，使用肝素柱和镍柱纯化蛋白。
[0019] 本发明还提供了一种特异性酶解双链DNA的试剂盒，该试剂盒包括上述双链DNA酶 和酶解反应缓冲液。
[0020] 最后，本发明还提供了上述试剂盒在PCR技术中的应用以下将结合附图对本发明 作进一步说明，以充分说明本发明的目的、技术特征和技术效果。
【附图说明】
[0021] 图1示出了本发明一个较佳实施例中制备的双链DNA酶的活性检测实验结果，其 中：
[0022] l-2ug pUC19质粒DNA加入5U双链DNA酶37°C酶解30min
[0023] 2_2ug pUC19质粒DNA
[0024] 3-0.5呢〇)(174单链0嫩加入51]双链0嫩酶37°(：酶解301^11
[0025] 4-〇.5ug〇X174 单链 DNA
[0026] 5-lug 293总RNA加入5U双链DNA酶37°C酶解30min
[0027] 6-lug 293总RNA。
【具体实施方式】
[0028] 以下通过具体的实施例对本发明的技术方案做进一步的描述。以下的实施例是对 本发明的进一步说明，而不是限制本发明的范围。
[0029] 1、双链DNA酶人工基因合成
[0030] 双链DNA酶具体的DNA序列如下（SEQ ID N0.1):
[0031] ATGGCCAACATGGAGTCCAAGCAAGGAATAATGGTTTTGGGATTCTTAATTGTCCTCCTCTTCGTGTCT GTCAATGGCCAGGACTGTGTGTGGGACAAGGACACGGACTTTCCCGAGGACCCGCCACTCATTTTCGATTCAAACTT GGAGCTCATCAGACCCGTCTTGGAAAATGGCAAAAGGATCGTCAGTGTCCCCAGTGGCAGCAGCTTAACCTTGGCCT GCTCTGGGTCTGAACTGATCAACCTGGGCATGGAGGCGGTGGAAGCCAAGTGTGCTGGGGGAGTCATGCTTGCCATA GAAGGAACGGAGTGGGAGATCTGGAGCCTGGGGTGCAGCAACCACGTGAAGGAGACCATCCGCCGCAACCTTGGAAC ATGTGGGGAAGCGGACCAGGGGGATAGGCACAGTATTGGCTTCGAGTACTACGGTGGCTCCATCTATTATGAACTGA TCAGCGTGTGTTTCGGGCCCGTGTCCGAAACAACCTTGCGCACCGAGCATGTCCTCCACGGCGCCAACATTGCCGCC AAGGACATCGAGACCTCCCGCCCCTCCTTCAAGACCTCCACCGGGTTCTTCAGCGTCTCCATGTCCACCGTCTACAG CCAGGCGTCACAGCTGCAGTTAATGACAGACATATTGGGAGATTCGGATCTAGCCAACAACATCATCGACCCCTCCC AACAGTTGTACTTCGCCAAAGGTCACATGTCTCCTGACGCAGACTTTGTGACGGTGGCAGAACAGGACGCCACCTAC TACTTCATCAACGCCCTACCGCAGTGGCAGGCCTTCAATAATGGCAACTGGAAGTACCTAGAATACGCGACCCGAGA CCTGGCCGAATCCCACGGTAGCGACCTGCGAGTGTATAGCGGAGGGTGGAGCCTGCTGCAGCTAGATGATATTAACG GCAACCCCGTGGACATCCTGCTGGGACTGTCTGAGGGCAAGGAGGTCGTGCCCGTTCCATCCCTCACTTGGAAGGTG GTTTACGAAGAGAGCAGCAGCAAAGCGGCCGCGATCGTCGGTATCAACAACCCTCACATCACCACCGCCCCCTCCCC CTTGTGTTCCGACCTGTGCTCCTCCTTGACCTGGATAGACTTCAACCTGGACGACCTGGCTCACGGGTACACCTACT GTTGTGCCGTAGATGACCTCCGGCAGGCCATACCCTATATCCCGGACCTGGGCAATGTCGGACTCCTCACTAAC
[0032] 将编码上述双链DNA酶的核苷酸序列通过人工基因合成的方法合成，并在此核苷 酸序列5 '端加上E c 〇 R I限制性内切酶位点G A A T T C，3 '端加上Xh ο I限制性内切酶位点 CTCGAG，通过EcoR I和Xho I双酶切、割胶回收、T4连接酶连接克隆至蛋白表达载体pET28a-NusA-TEV。双链DNA酶完整编码区为1221bp，共含有407个氨基酸，表达蛋白的理论分子量为 44539Da.
[0033] 2、双链DNA酶蛋白的表达与纯化
[0034]将测序正确的双链DNA酶质粒转化入大肠杆菌表达菌株R〇SSeta(DE3)，挑取单菌 落接种至50ml LB液体培养基，加入卡那霉素终浓度50ug/ml和氯霉素34ug/ml双抗性筛选， 37°C，200rpm培养过夜。第二天按照2:100比例转接至250ml LB液体培养基，加入卡那霉素 终浓度50ug/ml和氯霉素34ug/ml双抗性筛选，共转接4瓶，37°C，200rpm培养至菌液0D600检 测数值为〇. 8时加入诱导剂异丙基-β-D硫代半乳糖苷使其终浓度为0.1-0.5mM，诱导培养4h 后，4°C7000rpm离心收集菌体。将此菌体按照每克加入40ml的比例悬浮于20mM Tris. Cl， pH8.0，300mM NaCl，10 %Glycero 1裂解缓冲液，超声前加入终浓度ImM苯甲基磺酰氟，超声 波破碎仪进行菌体破碎。超声裂解条件为超声3秒间隔5秒，30 %超声功率，超声15min。当菌 液变得清亮时离心收集上清液，取样进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，并采用镍柱纯化双链 DNA酶蛋白，用rTEV酶酶解纯化的双链DNA酶蛋白，按照1U rTEV酶加入3ug NusA-dsDNase蛋 白比例，在lXrTEV Buffer(50mM Tris，pH8.0,0.5mM EDTA，lmM DTT)中30°C酶解lh。再用 肝素柱进行纯化，具体纯化操作步骤参照肝素柱和Ni NTA Beads 6FF说明书进行，获得纯 度约95 %的双链DNA酶蛋白。
[0035] 3、双链DNA酶活性测定
[0036] 将纯化后的双链DNA酶分别与双链DNA(pUC 19质粒DNA)、单链DNA( Φ X174单链 DNA)、RNA(293总RNA)在20mM Tris.Cl，pH8.0,5mM MgCl2反应体系中进行酶切反应，37°C温 育30min。结果显示双链DNA酶能够很好酶解双链DNA，对单链DNA和RNA没有酶解，如附图1所 不。
[0037]以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创 造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员 依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术 方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
【主权项】
1. 一种编码双链DNA酶的核苷酸，其特征在于，所述核苷酸的序列如SEQ ID NO. 1所示。2. -种表达双链DNA酶的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒包含如SEQ ID NO. 1所 示的核苷酸序列。3. 根据权利要求2所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒的融合蛋白表达载体为 pET28a-NusA-TEV。4. 一种重组表达转化体，其特征在于，所述重组表达转化体包含如SEQ ID NO. 1所示的 核苷酸序列。5. -种双链DNA酶，其特征在于，所述双链DNA酶包含由如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序 列编码的氨基酸序列。6. 根据权利要求5所述的双链DNA酶的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下 步骤： 步骤1、人工合成如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，并在所述核苷酸序列的5'端和3' 端分别设置限制性内切酶位点，将得到的核苷酸序列克隆至融合蛋白表达载体，测序，得到 包含如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列的质粒； 步骤2、将步骤1中得到的所述质粒转化入表达菌株，进行蛋白表达，并使用rTEV酶酶解 所述蛋白，所述rTEV酶酶解去除N端融合蛋白，释放出可溶性双链DNA酶，使用肝素柱和镍柱 纯化酶解得到的蛋白。7. 根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1中，设置在所述5'端的限制 性内切酶位点为EcoR I，设置在所述3'端的限制性内切酶位点为Xho I。8. 根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2中，所述表达菌株为大肠杆 菌表达菌株R〇sseta(DE3)。9. 一种特异性酶解双链DNA的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括根据权利要求5所 述的双链DNA酶和酶解反应缓冲液。10. 根据权利要求9所述的试剂盒在PCR技术中的应用。
【文档编号】C12N9/22GK106085986SQ201610411175
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月12日 公开号201610411175.0, CN 106085986 A, CN 106085986A, CN 201610411175, CN-A-106085986, CN106085986 A, CN106085986A, CN201610411175, CN201610411175.0
【发明人】曹平生
【申请人】翌圣生物科技（上海）有限公司