具有β?木糖苷酶和β?葡萄糖苷酶双重活性的糖基水解酶突变体及其应用
【专利摘要】本发明提供了一系列糖基水解酶LXYL?P1突变体蛋白，这些突变体蛋白具有β?木糖苷酶和/或β?葡萄糖苷酶活性，均能专一性地从7?木糖紫杉烷类化合物上水解去除木糖基，本发明涉及这些突变体的氨基酸序列以及编码这些氨基酸序列的核苷酸序列，以及这些突变体蛋白及其产生菌的应用。
【专利说明】
具有β-木糖苷酶和β-葡萄糖苷酶双重活性的糖基水解酶突变 体及其应用
技术领域
[0001 ]本发明属于生物工程领域，具体涉及一种双功能糖基水解酶(GH)的一系列突变 体。这些突变体的β-木糖苷酶和/或β-葡萄糖苷酶活性较之其野生型有所提高，并且均能专 一性地从7-木糖紫杉烷类化合物上水解去除木糖基，本发明涉及这些突变体的氨基酸序列 以及编码这些氨基酸序列的核苷酸序列，以及这些突变体蛋白及其产生菌的应用。 技术背景
[0002]糖基水解酶(glycoside hydrolases，GH;glycosidases，EC3 · 2 · 1 .X)可催化糖苷 化合物的水解反应，在食品、造纸、药品、饲料及生物能源等领域具有广泛的用途。根据其氨 基酸序列和结构特征进行分类，GH目前累计有100多个家族(http://www.cazy .org/)，而 GH3是上述100多个家族中最大的家族之一，已发现2400余个成员木糖苷酶（0-〇-xylosidases，EC3.2.1.37)作用于木糖苷化合物和木寡糖或木二糖的非还原末端，释放出 β-D-木糖和相应的配基^已发现的β-木糖苷酶属于糖基水解酶的3、30、39、43、52和54家族 [Brunzelle,J.S.et al. Structure of the two-subsite beta-D-xylosidase from Selenomonas ruminantium in complex with 3-bis[tris(hydroxymethyl)methylamino] propane.Arch Biochem Biophys.2008,474:157-166]，而真菌来源的β-木糖苷酶目前见于 GH3、43 和 54家方矣[Knob，A·et al.β-xylosidase from filamentous fungi : an overview.World J Microb Biot ·2010,26:389_407] 葡萄糖苷酶（β-D-Glucosidases， EC3.2.1.21)，则作用于纤维素、纤维二糖和葡萄糖苷化合物的非还原末端，释放出β-D-葡 萄糖和相应的配基。已发现的β-葡萄糖苷酶属于糖基水解酶的1、3、5、9、30、116家族 [Michlmayr,H.et al.β-Glucosidase activities of lactic acid bacteria : mechanisms, impact on fermented food and human health.FEMS Microbiol Lett. 2013，352(1): 1-10.]，而真菌来源的β-葡萄糖苷酶见于GH3家族[Tiwari，P.et al .β-Glucosidases from the fungus Trichoderma:an efficient cellulase machinery in biotechnological applications.BioMed Res Int.2013,2013:203735.doi:10.1155/ 2013/203735L有些糖基水解酶则同时具有β-木糖苷酶和β-葡萄糖苷酶的双重活性，例如， 克隆自香菇(Lentinula edodes)的两个糖基水解酶(代号LXYL-P1-1、LXYL-P1_2,两者的氨 基酸序列一致性为97%，后者活性较前者高)不仅具有β-木糖苷酶活性，能专一性地水解去 除7-木糖紫杉烷类化合物上的木糖基(故又称之为7-木糖紫杉烷糖基水解酶），还能水解β-葡萄糖苷，是一典型的双功能酶[Cheng，H.L.et al .Cloning and characterization of the glycoside hydrolases that remove xylosyl group from 7-0-xylosy1-10-deacetyltaxol and its analogues.Mol Cell Proteomics.2013，12(8):2236_2248]。其 中，活性较高的LXYL-P1-2氨基酸序列及其应用已申请发明专利:朱平，程海立，赵瑞玉，程 克棣，何慧霞，孟超，朱慧新.具有β-木糖苷酶和β-葡萄糖苷酶活性的新的糖基水解酶及其 应用.专利号ZL 201180031238.5;PCT国际公布号W0 2011/160484 Α1(美国专利公布号US 2013/0130330 Al)〇
[0003] 本发明的申请者针对LXYL-P1-1与LXYL-P1-2中理化性质差异较大的氨基酸残基 进行由LXYL-P1-1向LXYL-P1-2的定点及定点组合突变，发现针对特定氨基酸残基进行突变 后，所制备得到的一些突变体的木糖苷酶和/或葡萄糖苷酶活性较之LXYL-P1-1有显著 提高;针对LXYL-P1-2进行的定向进化研究，也获得了β-木糖苷酶和/或β-葡萄糖苷酶活性 显著高于LXYL-P1-2的突变体;进一步研究发现，将野生型LXYL-P1-1和LXYL-P1-2以及上述 所有突变体的第220位亮氨酸残基突变成甘氨酸残基(L220G突变），获得的所有L220G突变 体(或称L220G突变型）的β-木糖苷酶和/或β-葡萄糖苷酶活性显著高于突变前的对照（第 220位氨基酸残基为亮氨酸残基）。
【发明内容】
[0004] 本发明解决的技术问题是提供一类糖基水解酶LXYL-P1 (即本发明所述的糖基水 解酶LXYL-P1-1和LXYL-P1-2)系列突变体蛋白、编码该突变体蛋白的核苷酸序列、含有该核 苷酸序列的重组质粒、含有该核苷酸序列或重组质粒的重组细胞，以及以上所述的突变体 蛋白、其核苷酸序列、其重组质粒或重组细胞在水解去除糖苷化合物上木糖基和/或水解去 除葡萄糖基方面的应用。
[0005] 为解决本发明的技术问题，提供如下技术方案：
[0006] 本发明技术方案的第一方面是提供糖基水解酶LXYL-P1 (即本发明所述的糖基水 解酶LXYL-P1-1和LXYL-P1-2)系列突变体蛋白，所述突变体蛋白的氨基酸序列为SEQ ID Ν0 3~SEQ ID NO 13,以及上述氨基酸序列SEQ ID NO 3~SEQ ID NO 13和LXYL-P1-1的氨基 酸序列SEQ ID NO l、LXYL-Pl-2的氨基酸序列SEQ ID NO 2的L220G突变型。
[0007] 本发明技术方案的第二方面是提供编码第一方面所述突变体蛋白的核苷酸序列， 优选SEQ ID N0 16~SEQ ID N0 26所示的核苷酸序列，以及上述核苷酸序列SEQ ID N0 16 ~SEQ ID NO 26和Lxyl-pl-1的核苷酸序列SEQ ID NO 14、Lxyl-pl-2的核苷酸序列SEQ ID NO 15在C658T659C66°-G658G 659A66° 或 G658G659T66° 或 G658G659C66° 或 G658G659G66° 的密码子突变型。
[0008] 本发明技术方案的第三方面是提供含有第二方面所述核苷酸序列的重组质粒。
[0009] 本发明技术方案的第四方面是提供含有第二方面所述核苷酸序列或第三方面所 述重组质粒的重组细胞。
[0010] 构成该重组细胞的宿主细胞既可以是含有Lxyl-pl-Ι和Lxyl-pl-2野生型基因的 香燕（Lent inula edodes)细胞，也可以是异源宿主细胞。适宜的宿主生物包括细菌、放线 菌、丝状真菌、酵母菌、植物细胞、动物细胞，举例如下：大肠埃希氏菌属（Escherichia species)、芽胞杆菌属(Bacillus species)、链霉菌属（Streptomyces species)、酵母菌 属（Saccharomyce species)、毕赤酵母菌属（Pichia species)、裂殖酵母菌属 (Schizosaccharomyce species)、曲霉属（Aspergillus species)、木霉属（Trichoderma species)、青霉属（Penicillium species)、口蘑属（Tricholoma species)、香燕属 (Lentinula species)、伞菌属(Agaricus species)、双子叶植物(dicotyledon)、以及昆虫 细胞等。优选下列宿主：大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(B. subtilis)、变铅青链霉菌 (S. lividans)、酿酒酵母(Saccharomyce cerevisiae)、巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)、粟 酒裂殖酵母（Schizosaccharomyce pombe)、黑曲霉(A.niger)、米曲霉(A. oryzae)、构巢曲 霉（A.Nidulans)、里氏木霉（T · reesei )、绿色木霉（T · Viride)，产黄青霉（Penici 11 ium chrysogenum)、口蘑（Tricholoma mongolicum)、香燕（L. edodes)、双抱蘑燕（Agaricus bisporus)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、以及草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda) Sf9细胞。
[0011]本发明技术方案的第五方面是提供本发明第一方面所述突变体蛋白、第二方面所 述核苷酸序列、第三方面所述重组质粒、第四方面所述重组细胞在水解去除糖苷化合物上 木糖基和/或水解去除葡萄糖基方面的应用。
[0012]本发明还提供所述cDNA序列的应用，即将所述突变体蛋白的编码基因（cDNA)片段 与适当表达载体连接，构建重组质粒，后者被导入合适的宿主细胞，转化后的重组细胞，通 过其产生的重组酶(即所述的突变体蛋白）用于水解糖苷化合物底物方面的应用。
[0013] 优选的作为底物的糖苷化合物选自含有木糖基的化合物和/或含有葡萄糖基的化 合物。其中，优选的含有木糖基的糖苷化合物选自紫杉烷木糖苷类化合物;所述的紫杉烷木 糖苷类化合物，优选7-木糖紫杉烷，可以是天然形成的、或是非天然产生的，如化学或生物 合成的、或半合成的。
[0014] 本发明提供所述的重组酶或含有该酶的重组细胞，在水解去除木糖基方面的应 用，包括但不限于用于7-木糖紫杉烷的生物转化或生物催化，所述的7-木糖紫杉烷底物包 括但不限于:7_木糖紫杉醇、7-木糖-10-去乙酰紫杉醇、7-木糖三尖杉宁碱、7-木糖-10-去 乙酰三尖杉宁碱、7-木糖紫杉醇C、7-木糖-10-去乙酰紫杉醇C、7-木糖巴卡亭III和7-木糖-10-去乙酰巴卡亭III;这些底物单独、或彼此混合被催化，或与其他紫杉烷相混合被催化。 水解去除木糖基后得到的产物包括但不限于:紫杉醇、10-去乙酰紫杉醇、三尖杉宁碱、10-去乙酰三尖杉宁碱、紫杉醇C、l〇-去乙酰紫杉醇C、巴卡亭III和10-去乙酰巴卡亭III。
[0015] 本发明的糖基水解酶LXYL-P1系列突变体蛋白在应用方面的技术方案优选为:所 述的突变体蛋白在以7-木糖紫杉烷为原料制备7-羟基紫杉烷时的应用。
[0016] 其中，所述的7-木糖紫杉烷原料选自带有木糖基的紫杉烷类的混合物，进一步优 选的，紫杉烷类的混合物选自红豆杉属(Taxus)植物组织，这些红豆杉属植物包括:欧洲红 豆杉（T.baccata)、短叶红豆杉（T.brevifolia)、喜马拉雅红豆杉（T.wallichiana)、曼地亚 红豆杉（T.media)、中国红豆杉（T. chinensis)、南方红豆杉（T · chinensis var .mairei)、云 南红豆杉(T.yunnanensis)、以及东北红豆杉(T.cuspidate)，或者是这些植物的细胞培养 物，或者是能够产生7-木糖紫杉烷类化合物的微生物细胞培养物。这里所述的植物组织包 括植物的根、针叶、树皮以及整个苗木。
[0017]发明详述：
[0018]下面对本发明的技术方案做进一步的说明：
[0019]本发明提供的糖基水解酶LXYL-P1系列突变体蛋白，其野生型蛋白LXYL-P1 -1和 LXYL-P1-2 系由一种口蘑科（1'1'；[(3110101]1&代〇6&6)真菌香燕（1^111:;[11111&6(10(168]\195.33)产 生。所述突变体蛋白的编码基因（cDNA)被导入宿主细胞后，所形成的突变体蛋白，可位于细 胞内或分泌到细胞外，用于转化7-木糖紫杉烷为紫杉醇或其类似物。
[0020]本发明所述的cDNA序列，可以用来构建各种不同类型的重组表达质粒，后者可被 转移到真菌细胞、或者被转移到原核细胞(包括大肠杆菌、放线菌）、植物细胞和动物细胞等 宿主细胞，所述突变体基因的表达可以使这些宿主获得将7-木糖紫杉烷水解为7-羟基紫杉 烷的能力。重组的宿主还可以用于其他含糖化合物的生物转化。
[0021] 本发明提供了所述突变体蛋白的应用。
[0022] 本发明还提供了一种紫杉醇及其类似物的生物转化制备方法：以7-木糖紫杉烷为 原料，用上述重组细胞(如重组毕赤酵母)水解去除原料上的木糖基，得到紫杉醇或其类似 物。
[0023]本发明所述的溶解底物的溶剂，除非有明确说明，一般是指:水、甲醇、乙醇、乙酸 乙酯、丙酮、正己烷、氯仿、二氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMS0)。
[0024] 本发明提供的方法中制备的紫杉醇或其类似物(产物），以及所用的C-7-木糖紫杉 烷原料(底物），其结构特征如通式I所示。
[0025]
[0026]
[0027] 注:Ph为苯基，Bz为苯甲酰基，Ac为乙酰基
[0028] 有益技术效果
[0029] 本发明获得的糖基水解酶LXYL-P1系列突变体基因，当被导入上述宿主细胞后，能 够表达出β-木糖苷酶和/或β-葡萄糖苷酶活性比突变前更高的突变体蛋白；该突变体蛋白、 或含有该突变基因的重组细胞在水解去除糖苷化合物上木糖基和/或水解去除葡萄糖基方 面比突变前发挥更高的效率，可应用于对7-木糖紫杉烷底物的生物转化或生物催化，生成 相应的7-羟基紫杉烷，后者可被应用于紫杉醇或其类似物的半合成。
【附图说明】
[0030] 图1 LXYL-P1-1与LXYL-P1-2氨基酸序列差异比较·
[0031] 图2应用PCR技术构建几种LXYL-P1-1突变体.
[0032]图3 LXYL-P1-2定向进化及突变体的筛选·
[0033]图4 LXYL-P1系列突变体重组细胞催化7-木糖-10-去乙酰基紫杉醇提取物的HPLC 分析.
[0034] 图5 LXYL-P1系列突变体重组细胞催化7-木糖-10-去乙酰基巴卡亭III的HPLC分 析·
[0035] 图6应用全质粒PCR技术构建L220G突变型（以LXYL-P1-2-L220G为例）.
[0036]图7 L220G系列突变体的单位湿重细胞酶活性时间曲线.
【具体实施方式】
[0037] 本发明通过下列实施例予以进一步阐明，这些实施例是仅用于说明性的，而不是 以任何方式限制本发明权利要求的范围。
[0038] 实施例 1:LXYL-P1-1 突变体 LXYL-Plvsl ~Plvsl3 的构建
[0039] 如文献[Mol Cell Proteomics.2013,12(8) :2236-2248]所述，β-木糖苷酶基因 (Lxyl-pl)至少有2个高度同源的核苷酸序列及相应的表达产物LXYL-P1-1(或简称Ρ1-1)和 1^￥1^-?1-2(或简称？1-2)，其氨基酸序列的一致性为97.3%，后者水解木糖苷的活性是前者 的两倍以上。这两个蛋白的cDNA序列(Lxyl-pl-l，L Xyl-pl-2)均包含1个长度为2412bp的开 放阅读框架(0RF)，编码803个氨基酸。如图1所示，这两个蛋白共有21个氨基酸存在差异。
[0040] 通过对LXYL-P1-1和LXYL-P1-2的差异氨基酸进行亲疏水和极性差异的比较分析， 发现第3、69、72、91、192、310、318、322、327、334和368位共有11个位点的氨基酸残基性质差 异较大。其中第3、69、192、310、318、327和334位的氨基酸在1^￥1^-?1-1中为亲水的极性氨基 酸，而在LXYL-P1-2中为疏水的非极性氨基酸;而第72、91和368位则正好相反，在LXYL-P1-1 中为疏水的非极性氨基酸，在LXYL-P1-2中为亲水的极性氨基酸;第322位则是在LXYL-P1-1 为酸性氨基酸，而在LXYL-P1-2中为碱性氨基酸。
[0041 ]以LXYL-P1-1的cDNA为模板，应用PCR技术对上述11个氨基酸进行定点或定点组合 突变，突变方向主要由LXYL-P1 -1向LXYL-P1 -2的突变（I368E除外），所用上、下游引物见表 1;应用PCR技术构建几种LXYL-P1-1突变体的过程如图2所示。
[0042] 表1.由LXYL-P1-1向LXYL-P1-2定点或定点组合突变所用引物序列
[0043]
[0044] PCR反应体系组成： 总体积：50μΙ· ddH：0 28. μL^ DM SO ! .5 ,uL 5 x Fast pfu PCR buffer ? 0 u.L,
[0045] 2.5 mM dNTP mix 4 ,uL 10 μΜ Forward primer 2 μΕ 10 μΜ Reverse primer 2 μ!> Tempiate ΟΝΛ 2 pL Fiist pfu PCR polymenise 0*5 pL
[0046] PCR扩增条件：
[0047] 95°C，5min;
[0048] 94°C，30sec;60°C，30sec;72°C，lmin;30cycles;
[0049] 72〇Ca〇min；
[0050] 4°C,^
[00511 PCR产物以1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测。
[0052] 重叠 PCR反应体系组成： 总体积：50 μΙ> ddH：.0 32 μL. DM SO 1.5'uL
[0053] 5 x Fast pfu PC'R buffer 10 ,uL 2.5 mM dNTP mix 4 .uL Template DN A 2 tuL Fast pfu PCR polymerase 0.5 pL
[0054] PCR 扩增条件（1):
[0055] 95°C，5min;
[0056] 94°C，30sec;45°C，30sec;72°C，lmin30sec;5cycles;
[0057] 72°C，5min;
[0058] 4°C，
[0059] 向上述PCR反应中加入基因的上、下游引物以获得全长cDNA片段，PCR反应体系组 成： 总体积：54pL 上述PCR反应体系 5Q .uL
[0060] 10 μΜ Forward primer 2 μ￡· 10 μΜ Reverse primer 2 pL
[0061] PCR 扩增条件(2):
[0062] 95〇C,5min；
[0063] 94〇C ,30sec；60〇C ,30sec；72〇C ,lmin30sec；30cycles；
[0064] 72°C，5min;
[0065] 4°C,^；
[0066] 参考文献[Mol Cell Proteomics. 2013,12(8) :2236-2248]方法，将扩增得到的 cDNA序列分别连接到毕赤酵母胞内表达载体pPIC3.5K上，得到相应的重组质粒pPIC3.5K-LXYL-Plvsl~pPIC3.5K-LXYL-Plvsl3,经测序验证后，分别导入毕赤酵母GS115细胞，筛选 获得高拷贝的转化子GS115-3.5K-Plvsl (简称？1￥81)、65115-3.51(-?1￥82(简称？1￥82)、 GS115-3.5K-Plvs4(简称卩1丫84)、65115-3.51(-?1￥85(简称？1￥85)、65115-3.51(-?1￥86(简称 Plvs6)、GS115-3.5K-Plvs8(简称Plvs8)、GSl 15-3.5K-Plvs9(简称Plvs9)、GSl 15-3.5K-Plvsl〇a^*PlvslO)、GS115-3.5K-Plvslia^*Plvsll)、GS115-3.5K-Plvsl2a^$ Plvsl2)和、GS115-3.5K-Plvsl3(简称Plvsl3)，Plvsl~Plvsl3及其突变位点的氨基酸残基 如表2所示。
[0067] 转化子筛选与培养、外源蛋白诱导表达、β-木糖苷酶与β-葡萄糖苷酶活性测定参 照文献[Mol Cell Proteomics·2013，12(8):2236-2248和菌物学报·2013,32(5):846-854] 方法进行，观察到β-木糖苷酶和/或β-葡萄糖苷酶活性较之其野生型有所提高的突变体有： Plvsl、Plvs4、Plvs5、Plvs8、Plvs9、PlvslO、Plvsll、Plvsl2和Plvsl3。
[0068] 表2.LXYL-P1-1突变体及其突变位点
[0069]
[0070] 实施例2:LXYL-Pl-2定向进化突变体的获得
[0071]以LXYL-P1-2的cDNA为模板，应用易错PCR技术对LXYL-P1-2进行定向进化，所用方 法及条件如下： PCR反应体系：50μΕ 1 Ox buffer 5 ,uL 10 μΜ Forwnrd Primer 2 μL,
[0072] Η) μΜ Reverse Primer 2 μL. Template Γ)ΝΛ ! ng T;iq DMA polymerase 0.5 μL dATf)不丨丨 dCTf) 0.2 mM dGTP 和 dTTP 1 mM
[0073] MgC'l： 7 m VI MnCl；； 0.5 mM
[0074] 加 ddH20 补足 50yL
[0075] PCR扩增条件：
[0076] 94°C，5min;
[0077] 94〇C ,30sec；55〇C ,30sec；72〇C ,2min40sec；30cycles；
[0078] 72〇Ca〇min；
[0079] 4°C,^；
[0080] 参照文献[中国医药生物技术.2013,8(4):241-246]方法，利用In-Fusion技术将 易错PCR片段连接到载体(pPIC3.5K)上（易错PCR片段两端与线性化载体两端同源区段长度 均为lOObp)，转化毕赤酵母细胞构建突变文库。
[0081]高酶活性突变体初筛方法:挑取在甲醇诱导平板(BMMY平板)上的单菌落于96深孔 板中，每孔加入l〇〇yL PNP-Xyl测活液，50°C反应20min，每孔加入500yL饱和Na2B4〇7溶液终 止反应，3，000r/min离心1 Omin。利用排枪每孔取200yL上清至96孔板中，测定其0D4Q5吸光值 并与野生型GS115-3.5K-LXYL-P1-2的0D4 Q5吸光值相比较，筛选吸光值显著提高的突变体。 突变体经摇瓶培养复筛[培养方法及活性测定参照Mol Cell Proteomics. 2013,12(8): 2236-2248和菌物学报.2013,32(5):846-854方法进行]，从中得到2个活性显著提高的突变 体P1-2-EP1(突变位点：S91D)和Ρ1-2-ΕΡ2(突变位点：TSeSEhLXYL-PU定向进化和突变体 筛选过程如图3所示。
[0082 ]实施例3:定点(组合)突变和定向进化突变体重组蛋白的分离纯化 [0083] 定点（组合）突变和定向进化突变体重组蛋白的分离纯化参照文献[Mol Cell Proteomics · 2013，12(8): 2236-2248和中国医药生物技术· 2014,9(5):381-384]方法进行， 纯化后的蛋白已达到电泳纯和HPLC级色谱纯。
[0084] 实施例4:定点（组合)突变和定向进化突变体重组细胞酶活性、重组蛋白酶活性分 析
[0085] 参考文献[Mol Cell Proteomics.2013,12(8) :2236-2248和中国医药生物技术 ? 2014,9(5):381-384]方法，以生色底物卩-11；[1：1'0卩1161171-0-0-?710卩5^&11081(16(?即-?(71)和 p-nitrophenyl-P-D-glucopyranoside(PNP-Glc)分别测定突变体重组蛋白的β-木糖苷酶、 β-葡萄糖苷酶活性(U/mg = nmol/min/mg);突变体重组蛋白水解7-木糖-10-去乙酰紫杉醇 (XDT)的最大反应速度、米氏常数、催化常数或转换数分别以V max、Km、kcat表示，其中，1^*值 和kcat/K m比值(催化效率)与酶活性呈正相关;Km值反映出酶与底物的亲和力，Km值越低亲和 力越大。结果如表3~6所示。
[0086] 表3.LXYL-P1-1定点突变体蛋白β-木糖苷酶、β-葡萄糖苷酶活性
[0087]
[0088] LXYL-P1-1 为对照;Plvsl ~Plvsl3 为 LXYL-P1-1 定点突变体蛋白；n = 3，*P〈0.05vs 对照，#P〈〇.〇lvs对照·
[0089]表4.LXYL-P1-1定点突变体蛋白水解XDT的β-木糖苷酶动力学参数
[0090]
[0091] LXYL-P1-1 为对照;Plvsl ~Plvsl3 为 LXYL-P1-1 定点突变体蛋白；n = 3，*P〈0.05vs 对照，#P〈〇.〇lvs对照·
[0092] 表5.LXYL-P1-2定向进化突变体蛋白β-木糖苷酶、β-葡萄糖苷酶活性
[0093]
[0094] LXYL-P1-2 为对照；P1-2-EP1 和 P1-2-EP2 为 LXYL-P1-2 定向进化突变体蛋白；n = 3，*P〈0 · 05vs 对照，**P〈0 · 01 vs 对照.
[0095] 表6.LXYL-P1-2定向进化突变体蛋白水解XDT的β-木糖苷酶动力学参数
[0096]
[0097] LXYL-P1-2 为对照；Ρ1-2-ΕΡ1 和 Ρ1-2-ΕΡ2 为 LXYL-P1-2 定向进化突变体蛋白；η = 3，*Ρ〈0 · 05vs 对照，**Ρ〈0 · 01 vs 对照.
[0098] 实施例5:定点（组合）突变和定向进化突变体重组细胞水解7-木糖-10-去乙酰基 紫杉醇提取物
[0099] 将突变体 PlVsl、Plvs4、Plvs5、Plvs8、Plvs9、Plvsl0、Plvsll、Plvsl2、Plvsl3、卟 2-EPUP1-2-EP2重组细胞及其野生型LXYL-P1-1和LXYL-P1-2重组细胞按干重16mg/mL的比 例加入至PH4.0的0.1M醋酸缓冲液中，与2mg/mL 7-木糖-10-去乙酰基紫杉醇提取物[7-木 糖-10-去乙酰紫杉醇(XDT)62.1%，7-木糖-10-去乙酰基三尖杉宁碱(XDC)12.8%，7-木糖-10-去乙酰基紫杉醇C(XDTC) 17.0 % ]底物混匀，反应体积lmL，45 °C恒温水浴摇床振荡反应 24h，转化反应后的混合物以3倍体积乙酸乙酯萃取3遍，浓缩后以300yL甲醇溶解，取1 OOyL 样品以HPLC分析转化率与产量。结果:底物无残留，全部转化为相应的产物：10-去乙酰基紫 杉醇(DT)、10-去乙酰基三尖杉宁碱(DC)、10-去乙酰基紫杉醇C(DTC)。以Plvsl为例，结果如 图4所示。
[0100] 实施例6:定点突变、定点组合突变和定向进化突变体重组细胞水解7-木糖-10-去 乙酰基巴卡亭III
[0101] 将突变体 Plvsl、Plvs4、Plvs5、Plvs8、Plvs9、Plvsl0、Plvsll、Plvsl2、Plvsl3、卟 2-EPUP1-2-EP2重组细胞及其野生型LXYL-P1-1和LXYL-P1-2重组细胞按干重16mg/mL的比 例加入至PH4.0的0.1M醋酸缓冲液中，与2mg/mL 7-木糖-10-去乙酰基巴卡亭III(XDB)底物 混匀，反应体积lmL，45°C恒温水浴摇床振荡反应24h，转化反应后的混合物以3倍体积乙酸 乙酯萃取3遍，浓缩后以300yL甲醇溶解，取100yL样品以HPLC分析转化率与产量。结果:底物 无残留，全部转化为相应的产物：1〇_去乙酰基巴卡亭III(DB)。以Plvsl为例，结果如图5所 不。
[0102] 实施例7:Leu22()4Gly22()定点突变和L220G系列突变体重组细胞的酶活性分析
[0103] 现以 LXYL-Pl-l、LXYLPl-2、Plvs4、Pl-2-EP2 为例作如下说明。
[0104] 依据有关结构生物学信息，发现位于酶活性中心附近的第220位Leu残基可能影响 XDT等底物进入酶的活性腔，故通过定点突变将其替换为侧链更短的Gly残基(L220G突变）。 分别以LXYL-Pl-l、LXYL-Pl-2、Plvs4、Pl-2-EP2的cDNA为模板，应用PCR技术对第220位氨基 酸进行Leu 22Q-Gly22Q定点突变，突变体LXYL-P1-1-L220G和Plvs4-L220G所用上游引物P1-1-L220G-F为：5' AGAAAT^^TACATCGAATTCGACGGAGTTS';所用下游引物P1-1-L220G-R为：5' GAATTCGATGTAffg^ATTTCTCGATGTTTCS7。突变体LXYL-P1-2-L220G和P1-2-EP2-L220G所用上 游引物P1-2-L220G-F为：5' AGAAAlj^lTATATCGACATCGACGGAGTTS';所用下游引物P1-2-L220G-R为：5' GATGTCGATATAff^ATTTCTCGATGTTTCS'。分别以含有Lxyl-pl-1、Plvs4、Lxyl-pl-2、Pl-2-EP2的重组质粒DNA(pPIC3 · 5K-LXYL-P1-1、pPIC3 · 5K-LXYL-Plvs4、pPIC3 · 5K-1^^1^-?1-2、？？扣3.51(-1^￥1^?1-24?2)为模板，应用全质粒?〇?技术构建1^206突变体，密码 子突变方向为 :C658T659C66()4G658G 659A66()或G658G659T66°或G 658G659C66°或G658G659G 66°，即可得到 L220G突变。以LXYL-P1-2-L220G突变体为例，如图6所示。
[0105] PCR反应体系组成： 总体积：50 μΙ ddH20 29 pL DMSO 1.5 ,uL 5 x HF buffer 10'uL
[0106] 2.5 !hM dNTP mix 4 ,uL 10 μLν? Forward primer 2 μL^ 10 μΜ Reverse primer 2 pL Template DN/\ 1 tuL Fiist pfu PCR polymerase 0.5 tuL
[0107] PCR扩增条件：
[0108] 98〇C,30sec；
[0109] 98〇C ,10sec；60°C ,15sec；72〇C ,6min；30cycles；
[0110] 72〇Ca〇min；
[0111] 4°C,^
[0112] PCR产物以1.0 %的琼脂糖凝胶电泳检测。
[0113] PCR产物纯化回收；用Dpn I对PCR产物酶切，酶切体系为100yL:10XNEBuffer 10μ L，100XBSA lyL，Dpn I 4yL，PCR片段5yg，加 ddH20补齐至 100yL，37°C 酶切 lh;回收11.44kb 的酶切后目的载体；转化E . col i DMT感受态细胞，筛选阳性转化子，分别得到突变体 pPIC3·5K-LXYL-Pl-1-L220G、pPIC3·5K-LXYL-Plvs4-L220G、pPIC3·5K-LXYL-P1-2-L220G、 pPIC3 · 5K-LXYL-P1-2-EP2-L220G 重组质粒。
[0114] 参考文献[Mol Cell Proteomics. 2013,12(8) :2236-2248]方法，将所得重组质粒 pPIC3·5K-LXYL-Pl-1-L220G、pPIC3·5K-LXYL-Plvs4-L220G、pPIC3·5K-LXYL-P1-2-L220G、 pPIC3.5K-LXYL-P1-2-EP2-L220G，经测序验证后，分别导入毕赤酵母GS115细胞，筛选获得 高拷贝的转化子 63115-3.51(-?1-1-1^206(简称？1-1-1^2206)、65115-3.51(-?1￥84-1^206(简 称Plvs4-L220G)、GS115-3 · 5K-P1-2-L220G(简称P1-2-L220G)、GS115-3 · 5K-P1-2-EP2-L220G(简称P1-2-EP2-L220G)。
[0115] 转化子筛选与培养、外源蛋白诱导表达、β-木糖苷酶与β-葡萄糖苷酶活性测定参 照文献[Mol Cell Proteomics·2013，12(8):2236-2248和菌物学报·2013,32(5):846-854] 方法进行，观察到突变体GS115-3 · 5K-P1-1-L220G(简称P1-1-L220G)、GS115-3 · 5K-Plvs4-L220G(简称Plvs4-L220G)、GS115-3 · 5K-P1-2-L220G(简称P1-2-L220G)、GS115-3 · 5K-P1-2-EP2-L220G(简称P1-2-EP2-L220G)的单位湿重细胞β-木糖苷酶活性(生色底物PNP-Xyl)和 β-葡萄糖苷酶活性(生色底物PNP-Glc)较之其突变前的对照GS115-3.5K-P1-1 (简称1^￥1^ ?1-1)、65115-3.51(-?1￥84(简称？1￥84)、65115-3.51(-?1-2(简称^^1^-?1-2)、65115-3.51(-P1-2-EP2 (简称PI -2-EP2)均有所提高。结果如图7所示。
[0116] 将突变体？1-1-1^2206、？1￥84-1^2206、？1-2-1^2206、？1-24?2-1^2206重组细胞及其 突变前的对照63115-3.51(-?1-1(简称^^1^-?1-1)、65115-3.51(-?1￥84(简称？1￥84)、65115-3 · 5Κ-Ρ1-2(简称LXYL-P1-2)、GS115-3 · 5K-P1-2-EP2(简称P1-2-EP2)按限量的干重8mg/mL 的比例加入至PH4.0的0· 1M醋酸缓冲液中，与10mg/mL 7-木糖-10-去乙酰基紫杉醇(XDT)底 物混匀，反应体积lmL，45 °C恒温水浴摇床振荡反应24h，取100yL转化反应后的混合物，以 900yL甲醇溶解，取100yL样品以HPLC分析转化率。结果如表7所示，上述L220G突变体水解 XDT的转化率均较各自突变前的对照有明显提高。
[0117] 参考文献[Mol Cell Proteomics.2013,12(8) :2236-2248和中国医药生物技术 .2014,9(5) :381-384]方法，分离纯化上述突变体重组蛋白，以生色底物PNP-Xyl和PNP-Glc 分别测定L220G系列突变体重组蛋白的β-木糖苷酶、β-葡萄糖苷酶活性(U/mg = nmol/min/ mg) ;L220G系列突变体重组蛋白水解7-木糖-10-去乙酰紫杉醇(XDT)的最大反应速率以Vmax 表示，米氏常数以Km表示，转换数以krat表示。表8显示，各个突变体β-木糖苷酶和/或β-葡萄 糖苷酶的比活力均超过各自的对照。表9表明，L220G系列突变体水解XDT的k cat/Km比值基本 接近或超过其突变前对照，而它们的kcat均比各自对照有非常显著的提高。将L220G突变引 入到表2、表5所示的其他LXYL-P1系列突变体中，亦能够提高这些突变体β-木糖苷酶和/或 β-葡萄糖苷酶活性。
[0118] 表7. L220G系列突变体重组细胞的XDT转化率
[0119]
[0120] η = 3，*Ρ〈0 · 05vs 对照，**Ρ〈0 · Olvs 对照·
[0121 ]表8. L220G系列突变体蛋白β-木糖苷酶和β-葡萄糖苷酶活性
[0122]
[0123] Pl-1-L220G、Pl-2-L220G、Plvs4-L220G 和 P1-2-EP2-L220G 为 L220G 系列突变体； 1^^1^-?1-1、1^^1^-?1-2、？1￥84、？1-24?2为各自突变前对照；11 = 3，仲〈0.05￥8对照，**?〈 O.Olvs 对照.
[0124] 表9. L220G系列突变体蛋白水解XDT的β-木糖苷酶动力学参数
[0125]
[0126] Pl-1-L220G、Pl-2-L220G、Plvs4-L220G 和 P1-2-EP2-L220G 为 L220G 系列突变体； 1^^1^-?1-1、1^^1^-?1-2、？1￥84、？1-24?2为各自突变前对照；11 = 3，仲〈0.05￥8对照，**?〈 O.Olvs 对照。
【主权项】
1. 一种糖基水解酶LXYL-P1的突变体蛋白，其特征在于，所述突变体蛋白具有SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 4、SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9、 SEQ ID NO 10、SEQ ID NO 11、SEQ ID NO 12、SEQ ID NO 13所示的氨基酸序列；以及上述 氨基酸序列或LXYL-P1-1的氨基酸序列SEQ ID NO l、LXYL-Pl-2的氨基酸序列SEQ ID NO 2 的L220G突变型。2. 根据权利要求1的糖基水解酶LXYL-P1的突变体蛋白，其特征在于，在糖基水解酶 LXYL-P1的突变体蛋白上可进行常规修饰;或者在糖基水解酶LXYL-P1上还连接有用于检测 或纯化的标签。3. 根据权利要求2的糖基水解酶LXYL-P1的突变体蛋白，其特征在于，所述的常规修饰 包括乙酰化、酰胺化、环化、糖基化、磷酸化、烷基化、生物素化、荧光基团修饰、聚乙二醇PEG 修饰、固定化修饰；所述的标签包括6XHis、GST、EGFP、MBP、Nus、HA、IgG、FLAG、c-Myc、 Profinity eXact〇4. 一种编码权利要求1所述突变体蛋白的核苷酸序列。5. 根据权利要求4所述的核苷酸序列，其特征在于，所述的核苷酸序列为SEQ ID NO 16 ~SEQ ID NO 26所示的核苷酸序列；以及SEQ ID NO 14~SEQ ID NO 26所示的核苷酸序列 另/-j-^658^659^660_^06580659^660-^^-^658^659^660_^06580659^660-^^-^658^659^660_^q658q659^660-^^- C658T659C_-G658G 659G_的密码子突变得到的核苷酸序列。6. -种含有权利要求4-5任一所述核苷酸序列的重组质粒。7. -种含有权利要求4-5任一所述核苷酸序列或权利要求6所述重组质粒的重组细胞。8. 根据权利要求7的重组细胞，其特征在于，构成所述重组细胞的原宿主细胞可以是产 生包括SEQ ID NO 1~SEQ ID NO 2所示序列的同源产生菌，或者是异源宿主细胞。9. 根据权利要求8的重组细胞，其特征在于，所述的宿主细胞的宿主生物选自细菌、放 线菌、酵母菌、丝状真菌、植物细胞或动物细胞。10. 根据权利要求9的重组细胞，其特征在于， 所述的细菌选自大肠埃希氏菌属（Escherichia species)、芽胞杆菌属（Bacillus species)； 所述的放线菌选自链霉菌属（Streptomyces species); 所述的酵母菌选自毕赤酵母菌属(Pichia species)、酿酒酵母菌属（Saccharomyces species)和裂殖酵母菌属（Schizosaccharomyce species); 所述的丝状真菌选自曲霉属（Aspergillus species)、木霉属（Tri choderma species)、青霉属（Penicillium species)、口蘑属（Tricholoma species)、香燕属 (Lentinula species)、伞菌属（Agaricus species)； 所述的植物细胞选自双子叶植物(dicotyledon); 所述的动物细胞选自昆虫细胞。11. 根据权利要求10所述的重组细胞，其特征在于， 所述的大肠埃希氏菌属(Escherichia species)选自大肠杆菌(E.coli); 所述的芽孢杆菌属(Bacillus species)选自枯草芽孢杆菌(B. subtil is); 所述的链霉菌属（Streptomyces species)选自变铅青链霉菌（S. lividans); 所述的酵母菌属（Saccharomyce species)选自酿酒酵母（Saccharomyce cerevisiae)； 所述的毕赤酵母菌属(Pichia species)选自巴斯德毕赤酵母(P.pastoris); 所述的裂殖酵母菌属（Schizosaccharomyce species)选自粟酒裂殖酵母 (Schizosaccharomyce pombe)； 所述的曲霉属(Aspergillus species)选自黑曲霉(A.niger)、米曲霉(A. oryzae)、构 巢曲霉(A.Nidulans); 所述的木霉属（Tri choderma species)选自里氏木霉（T.reesei)、绿色木霉 (T.Viride)； 所述的青霉属(Penicillium species)选自产黄青霉(Penicillium chrysogenum); 所述的 口蘑属（Tricholoma species)选自口蘑（Tricholoma mongolicum); 所述的香燕属（Lentinula species)选自香^(L.edodes); 所述的伞菌属(Agaricus species)选自双孢蘑燕(Agaricus bisporus); 所述双子叶植物（dicotyledon)选自拟南芥(Arabidopsis thaliana); 所述的昆虫细胞选自草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda)Sf9细胞。12. 权利要求1-3任一所述的突变体蛋白或权利要求4-5任一项所述的核苷酸序列或权 利要求6所述的重组质粒或权利要求7-11任一所述的重组细胞在水解去除糖苷化合物上木 糖基和/或水解去除葡萄糖基方面的应用。13. 根据权利要求12的应用，其特征在于，所述的糖苷化合物包括β-木糖苷和/或β-葡 萄糖苷。14. 根据权利要求12-13任一项的应用，其特征在于，所述的β-木糖苷包括但不限于7-木糖紫杉烷，所述的7-木糖紫杉烷包括但不限于：7_木糖紫杉醇、7-木糖-10-去乙酰紫杉 醇、7-木糖三尖杉宁碱、7-木糖-10-去乙酰三尖杉宁碱、7-木糖紫杉醇C、7-木糖-10-去乙酰 紫杉醇C、7-木糖巴卡亭III和7-木糖-10-去乙酰巴卡亭III;水解去除木糖基后得到的产物 包括但不限于：紫杉醇、10-去乙酰紫杉醇、三尖杉宁碱、10-去乙酰三尖杉宁碱、紫杉醇C、 10-去乙酰紫杉醇C、巴卡亭III和10-去乙酰巴卡亭IIL·
【文档编号】C12N15/75GK106085987SQ201610141218
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年3月14日 公开号201610141218.8, CN 106085987 A, CN 106085987A, CN 201610141218, CN-A-106085987, CN106085987 A, CN106085987A, CN201610141218, CN201610141218.8
【发明人】朱平, 梁潇, 王芬, 李慧仙, 陈天娇
【申请人】中国医学科学院药物研究所