一种高温活性和热稳定性提高的蛋白酶及其制备方法和应用

文档序号:10715728阅读:1076来源:国知局
一种高温活性和热稳定性提高的蛋白酶及其制备方法和应用
【专利摘要】本发明公开了一种高温活性和热稳定性提高的蛋白酶及其编码基因,以来源于极端嗜热古生菌Pyrococcus furiosus的蛋白酶Pfsp为母本,采用分子生物学技术对Pfsp的氨基酸序列进行改造,获得了一种具有广泛工业应用前景的蛋白酶Pfsp?m。Pfsp?m的最适反应温度由对照的90℃提高到105℃;于90℃绝对酶活由对照的1396.24U/mg提高至6823.32U/mg,提高了4.89倍;于90℃绝对角蛋白酶酶活由对照的1116.99U/mg提高至6140.99U/mg,提高了5.50倍;于90℃半衰期由对照的6h延长至28h,提高了4.67倍。
【专利说明】
一种高温活性和热稳定性提高的蛋白酶及其制备方法和应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一种高温活性和热稳定性提高的蛋白酶及其制备方法和应用,属于基 因工程和酶工程领域。
【背景技术】
[0002] 角蛋白是一类不溶性的硬质蛋白,广泛存在于生物体的组织中,是羽毛、毛发、羊 毛、指甲、犄角等的主要组成成分。角蛋白作为养殖业和皮革制造业的副产物,是一笔可观 的再生利用蛋白质资源。传统的角蛋白处理工艺主要是高温加热酸碱水解法,这不仅会对 环境造成污染,而且还会破坏部分氨基酸,从而影响角蛋白的利用率。因此,发展生物降解 法(微生物法和酶法)对废弃角蛋白质进行回收和利用是角蛋白工业应用的迫切需要。
[0003] 由于在高温条件下降解角蛋白不仅可以提高反应速度,使底物更容易被降解,还 能够减少杂菌的生长。因此,寻找新的可以降解角蛋白的嗜热微生物和嗜热蛋白酶、提高可 以降解角蛋白的蛋白酶的活性和热稳定性有利于角蛋白的工业化应用。

【发明内容】

[0004] 为解决现有技术中存在的问题,本发明提供了一种高温活性和热稳定性提高的蛋 白酶,其氨基酸序列如SEQ ID N0:1所示。
[0005] 本发明还提供一种编码上述的蛋白酶的基因;所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示。
[0006] 本发明还提供一种能表达生产上述蛋白酶的载体。
[0007] 本发明还提供一种能表达生产上述蛋白酶的基因工程菌。
[0008] 本发明还提供一种上述蛋白酶的制备方法,以氨基酸序列如SEQ ID N0:3所示的 蛋白酶Pfsp为出发序列,将第113位谷氨酸替换为谷氨酰胺、第189位丙氨酸替换为天冬酰 胺、第456位天冬氨酸替换为天冬酰胺、第458位天冬氨酸替换为天冬酰胺、第470位天冬氨 酸替换为天冬酰胺。
[0009] 上述的制备方法,具体步骤如下:
[0010] 1)根据Pyrococcus furiosus的蛋白酶Pfsp的基因序列,其基因序列如SEQ ID N0:4所示,采用化学全合成的方法合成优化的基因后,将其克隆到质粒pET-26b( + )中,构建 重组质粒;
[0011] 2)利用SWISS-MODEL软件对蛋白酶Pfsp进行模拟,获得蛋白酶Pfsp的三级结构;
[0012] 3)通过BLASTP搜索比对,找出与蛋白酶Pfsp在氨基酸序列上高度相似的蛋白质; 采用ClustalW2程序对这些蛋白质进行序列比对;通过对蛋白酶Pfsp的氨基酸序列和空间 结构进行分析,确定要突变的氨基酸位点,分别为第113位谷氨酸、第189位丙氨酸、第456位 天冬氨酸、第458位天冬氨酸和第470位天冬氨酸;
[00?3 ] 4)设计突变引物,对蛋白酶Pf sp的氨基酸序列进行定点突变,将所述位点的氨基 酸进行替换,获得含有蛋白酶突变体基因序列的重组载体;
[0014] 5)将含有蛋白酶突变体基因序列的重组载体转化大肠杆菌BL21-C〇d 〇nPlus (DE3)-RIL,诱导表达,获得蛋白酶突变体Pfsp-m。
[0015] 上述蛋白酶突变体Pfsp-m在洗涤剂工业、饲料、肥料、纺织、制革工业、医药领域的 应用。
[00?6]本发明通过对蛋白酶Pf sp的氨基酸序列和模拟的三维结构进行分析,选择待突变 的氨基酸位点,采用定点突变技术得到了一个高温活性和热稳定性提高的蛋白酶突变体 Pfsp-m〇
[0017] 与现有技术相比,本发明的优点如下:本发明提供的蛋白酶突变体Pfsp-m的高温 活性和热稳定性显著提高;蛋白酶突变体Pfsp-m的最适反应温度由对照(突变前)的90°C提 高到105°C ;于90°C绝对酶活由对照(突变前)的1396.24U/mg提高至6823.32U/mg,提高了 4.89倍;于90 °C半衰期由对照(突变前)的6h延长至28h,提高了 4.67倍。与蛋白酶Pf sp相比, 蛋白酶突变体Pfsp-m对于表面活性剂、变性剂以及金属离子螯合剂的耐受性明显提高。蛋 白酶Pfsp和突变体Pfsp-m均能够降解角蛋白;突变体Pfsp-m于90 °C绝对角蛋白酶酶活由对 照(Pf sp)的1116.99U/mg提高至6140.99U/mg,提高了 5.50倍。本发明的优化改良蛋白酶突 变体Pfsp-m在饲料、肥料、纺织、洗涤剂、制革、医药等领域具有广泛的应用前景。
【附图说明】
[0018] 图1蛋白酶Pfsp和蛋白酶突变体Pfsp-m纯化样品的SDS-PAGE检测图;
[0019]图2蛋白酶Pfsp和蛋白酶突变体Pfsp-m的最适反应温度;
[0020]图3蛋白酶Pfsp和蛋白酶突变体Pfsp-m在90 °C的热稳定性;
[0021 ]图4蛋白酶Pfsp和蛋白酶突变体Pfsp-m的角蛋白酶酶活。
【具体实施方式】
[0022]下面结合具体实施例对本发明一种高温活性和热稳定性提高的蛋白酶及其制备 方法和应用作进一步的详细说明。
[0023]实验条件:
[0024] 1、菌株与载体
[0025]大肠杆菌DH5a (购自 TaKaRa),大肠杆菌BL21-CodonPlus(DE3)_RIL(购自 Stratagene),大肠杆菌表达载体pET_26b( + )(购自Novagen公司)。
[0026] 2、酶类及其他生化试剂
[0027] KOD DNA聚合酶及KOD-Plus-neo DNA聚合酶购自Toyobo公司,DNA限制性内切酶、 T4DNA连接酶、DNA Marker、低分子量蛋白质Marker购自Fermentase公司,DNA胶回收试剂 盒、质粒抽提试剂盒E.Z.N.A.购自Omega Bio-tek公司,酪蛋白、杆菌肽(bacitracin)购自 Sigma公司,可溶性角蛋白(来源于羊毛)购自百灵威科技,福林酚试剂、Bradford法蛋白浓 度测定试剂盒购自上海生工生物工程股份有限公司,其它化学试剂均为国产或进口分析 纯。
[0028] 3、培养基
[0029]大肠杆菌的培养采用LB培养基(1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、l%NaCl,pH 7.0)。 筛选培养基采用含50yg/mL卡那霉素的LB培养基。
[0030] 本发明中所用到的分子克隆技术和蛋白质检测技术均为本领域中的常规技术。在 以下实施例中未作详细介绍的技术,均按照如下实验手册中的相关部分来进行。Green Μ R,Sambrook J.Molecular cloning:a laboratory manual[M].New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,2012〇
[0031] 实施例1蛋白酶Pfsp基因合成、表达载体构建及突变体构建
[0032] (1)突变位点分析与方法
[0033] 利用SWISS-MODEL软件对蛋白酶Pfsp进行模拟,获得蛋白酶Pfsp的三级结构;通过 BLASTP搜索比对,找出与蛋白酶Pfsp在氨基酸序列上高度相似的蛋白质;采用ClustalW2程 序对这些蛋白质进行序列比对;通过对蛋白酶Pfsp的氨基酸序列和空间结构进行分析,确 定要突变的氨基酸位点,分别为第113位谷氨酸、第189位丙氨酸、第456位天冬氨酸、第458 位天冬氨酸和第470位天冬氨酸;蛋白酶Pfsp的氨基酸序列如SEQ ID N0:3所示。
[0034] (2)基因优化合成
[0035] 采用化学全合成的方法合成改造设计好的基因序列。
[0036] (3)表达载体的构建
[0037]根据合成基因的序列设计PCR引物,上游引物P1含有Nde I内切酶酶切位点,下游 引物P 2含有X h ο I内切酶酶切位点;引物序列如下:上游引物?1:5'_ GGAATTC CATATG GCTCCAGAGAAGAAAGTTGAAd;下游引物Ρ2:5'-CCGCTCGAGTCAGCCATAATAAACTTTAGCC-3 ',其中下划线部分为限制性内切酶的切割位点。 [0038]以合成基因为模板,以PI、Ρ2为引物,进行PCR扩增;PCR扩增条件为:98°C5min; 98 °C 20sec,60°C20sec,74°C lmin,30个循环;74°C,10min;扩增产物经Nde I和Xho I双酶切, 连接至载体pET-26b (+),构建重组载体pET-26b (+) -Pf sp。
[0039] (4)突变体的构建
[0040] 米用TransGen公司的Fast Mutagenesis System对蛋白酶Pfsp基因进行定点突 变,包含突变位点的重叠引物(表1)按照该产品说明书的要求进行设计,PCR等相关操作按 照该产品说明书进行。
[0041 ] 具体操作如下:
[0042] 以pET-26b( + )-Pfsp为模板,采用引物P3和P4,进行PCR扩增得到包含载体序列和 基因序列的线性片段;PCR扩增条件为:94°C5min;94°C30sec,55°C20sec,68°C4min,35个循 环;68°C,10min;扩增产物经Dpn I酶处理后,转化大肠杆菌DH5a,卡那霉素抗性平板筛选转 化子,经测序鉴定是否为突变基因 PfspE113Q;在此基础上,以pET-26b( + )-PfspE113Q为模 板,采用引物P5和P6,进行PCR扩增,重复以上实验步骤,获得重组载体pET-26b ( + )-PfspEl 13Q/A189N;在此基础上,以 pET-26b( + )-Pf spEl 13Q/A189N 为模板,采用引物 P7 和 P8, 进行PCR扩增,重复以上实验步骤,获得重组载体pET-26b( + )-PfspE113Q/A189N/D456N/ D458N;在此基础上,以 pET-26b( + )-PfspE113Q/A189N/D456N/D458N 为模板,采用引物 P9 和 P10,进行PCR扩增,重复以上实验步骤,最终获得重组载体pET-26b( + )-PfspE113Q/A189N/ D456N/D458N/D470N,即 pET-26b(+)-Pfsp-m。
[0043] 表1突变引物
[0044]
[0045] 注:下划线部分为突变位点。
[0046]实施例2蛋白酶Pf sp和蛋白酶突变体Pf sp-m在大肠杆菌中的表达和纯化
[0047] 上述两种表达载体pET_26b( + )_Pf sp及pET_26b( + )_Pf sp-m通过热击转化大肠杆 菌BL21-CodonPlus(DE3)-RIL,分别获得含有原基因和突变体基因的重组菌株。
[0048] 取含有重组质粒的大肠杆菌BL21-CodonPlus(DE3)-RIL菌株和含有pET-26b( + )的 大肠杆菌BL21-CodonPlus(DE3)-RIL菌株(作为对照),分别接种于含有50yg/mL卡那霉素的 5mL LB液体培养基中,37°C快速振荡培养过夜。将过夜培养物以1 %接种量转接至含有50μ g/mL卡那霉素的50mL LB液体培养基中,37°C快速振荡培养至菌液ODsoo?达到0.4左右。加入 IPTG至其终浓度为0.25mM,继续于16°C培养20h,12000r/min离心5min收集菌体沉淀。
[0049] 采用50mMHEPES,pH7.5缓冲液重悬并洗涤菌体沉淀,再加入适量50mMHEPES,pH 7.5缓冲液重悬菌体沉淀,置于冰上用超声波破碎细胞。超声波细胞破碎仪的参数设置如 下:超声波功率为25 %,超声波破碎时间为3sec,间歇6sec。超声波处理菌体细胞至菌体悬 液变为均一的溶液,采用SDS-PAGE检测重组蛋白质的表达情况。
[0050] 将目的蛋白质所位于的细胞可溶成分于80°C保温2h,12000r/min离心30min,去除 沉淀,收集上清。然后采用杆菌肽亲和层析柱对上清中目的蛋白质进行纯化,用20% (v/v) 异丙醇洗脱缓冲液洗脱,即得到纯化后的重组蛋白酶Pfsp和Pfsp-m。利用SDS-PAGE检测重 组蛋白酶的纯度,并采用Bradford法测定重组蛋白酶的浓度。SDS-PAGE检测结果表明,蛋白 酶Pfsp及其突变体Pfsp-m均在大肠杆菌中成功表达,并且经杆菌肽亲和层析可以获得纯度 达90%以上的重组蛋白酶。
[00511实施例3蛋白酶Pfsp和蛋白酶突变体Pfsp-m的部分性质分析 [0052] (1)蛋白酶酶活测定方法
[0053]以酪蛋白为底物测定蛋白酶酶活。按照如下表格中所示的反应体系进行反应。
[0054]
[0055] 待反应完成后,从90°C水浴锅中取出样品,立即置于冰水混合物中使其迅速冷却, 随后加入40%TCA终止反应。室温放置15min后,12000r/min离心10min,吸取200yL上清转移 到新的1.5mL Eppendorf管中,后依次加入lmL福林酚试剂和200yL 0.5M Na2C03后40°C显色 20min,测定样品的A66〇nm。根据酪氨酸标准曲线定义上述反应体系中每分钟释放lyg酪氨酸 所需要的酶量为一个酶活单位(U)。
[0056] (2)蛋白酶Pf sp和蛋白酶突变体Pf sp-m的最适反应温度
[0057]以酪蛋白为底物,分别于20°C~115°C下测定蛋白酶Pfsp和突变体Pfsp-m的绝对 酶活,并以绝对酶活对温度作图,获得温度对这两种重组蛋白酶的酶活影响的曲线,确定其 最适反应温度。其结果表明,Pfsp的最适反应温度为90°C,在此温度下的绝对酶活力为 1396.24U/mg;突变体Pfsp-m的最适反应温度为105 °C,在此温度下的绝对酶活力为 7547.35U/mg。并且突变体Pfsp-m于90°C绝对酶活由对照(Pfsp)的1396.24U/mg提高至 6823.32U/mg,提高了4.89倍。由此可见,突变体Pfsp-m的最适反应温度和高温活性得到了 明显的提尚。
[0058] (3)蛋白酶Pf sp和蛋白酶突变体Pf sp-m的热稳定性
[0059]将酶液于90°C保温,分时间梯度取出部分样品测定酶活力,计算相对酶活。将未处 理的酶液的酶活定义为100%,并以相对酶活的百分比对时间作图,评价酶的热稳定性。测 定结果如图3所示,突变体Pfsp-m于90 °C半衰期由对照(突变前)的6h延长至28h,提高了 4.67倍。以上稳定性试验结果表明,蛋白酶突变体Pfsp-m具有更强的热稳定性。
[0000] (4)化学试剂对蛋白酶Pf sp和蛋白酶突变体Pf sp-m酶活性的影响
[0061] 向酶液中补加不同浓度的化学试剂,以酪蛋白为底物测定蛋白酶酶活。将未处理 的酶液的酶活定义为100%,计算相对酶活。测定结果如表二所示,与Pfsp相比,突变体 Pfsp-m耐受表面活性剂、变性剂以及金属离子螯合剂的能力明显提高;此外,还原剂对Pfsp 和突变体Pfsp-m的酶活基本无影响。
[0062] 表二化学试剂对蛋白酶活性的影响
[0063]
[0064]
[0065]实施例4蛋白酶Pfsp和蛋白酶突变体Pfsp-m的角蛋白酶酶活分析
[0066] 角蛋白酶酶活测定参照"蛋白酶酶活测定方法",将底物替换为1%可溶性角蛋白, 分别于60 °C~100 °C下测定蛋白酶Pfsp和突变体Pfsp-m的绝对酶活,并以绝对酶活对温度 作图。其结果表明,蛋白酶Pfsp和突变体Pfsp-m均能够降解角蛋白;与Pfsp相比,突变体 Pfsp-m的角蛋白酶酶活明显提高,突变体Pfsp-m于90 °C绝对角蛋白酶酶活由对照(突变前) 的 111 6.99U/mg提高至6140.99U/mg,提高了 5.50倍。
[0067] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,任何熟悉本技术 领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,可轻易想到的变化或替换,都应涵盖在本发 明的保护范围的内。因此,本发明的保护范围应该以权利要求所界定的保护范围为准。
【主权项】
1. 一种高温活性和热稳定性提高的蛋白酶,其特征在于,其氨基酸序列如SEQ ID NO: 1 所示。2. -种编码权利要求1所述的蛋白酶的基因。3. 根据权利要求2所述的基因,其特征在于,所述基因的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所 不。4. 一种能表达生产权利要求1所述的蛋白酶的载体。5. -种能表达生产权利要求1所述的蛋白酶的基因工程菌。6. 根据权利要求1所述的蛋白酶的制备方法,其特征在于,以氨基酸序列如SEQ ID NO: 3所示的蛋白酶Pfsp为出发序列,将第113位谷氨酸替换为谷氨酰胺、第189位丙氨酸替换为 天冬酰胺、第456位天冬氨酸替换为天冬酰胺、第458位天冬氨酸替换为天冬酰胺、第470位 天冬氨酸替换为天冬酰胺。7. 根据权利要求6所述的制备方法,其特征在于,具体步骤如下: 1) 根据Pyrococcus furiosus的蛋白酶Pfsp的基因序列,其基因序列如SEQ ID N0:4所 示,采用化学全合成的方法合成优化的基因后,将其克隆到质粒pET-26b(+)中,构建重组质 粒; 2) 利用SWISS-M0DEL软件对蛋白酶Pf sp进行模拟,获得蛋白酶Pf sp的三级结构; 3) 通过BLASTP搜索比对,找出与蛋白酶Pfsp在氨基酸序列上高度相似的蛋白质;采用 ClustalW2程序对这些蛋白质进行序列比对;通过对蛋白酶Pfsp的氨基酸序列和空间结构 进行分析,确定要突变的氨基酸位点,分别为第113位谷氨酸、第189位丙氨酸、第456位天冬 氨酸、第458位天冬氨酸和第470位天冬氨酸; 4) 设计突变引物,对蛋白酶Pf sp的氨基酸序列进行定点突变,将所述位点的氨基酸进 行替换,获得含有蛋白酶突变体基因序列的重组载体; 5) 将含有蛋白酶突变体基因序列的重组载体转化大肠杆菌BL21-C〇d〇nPlus(DE3)-RIL,诱导表达,获得蛋白酶突变体Pf sp-m,即高温活性和热稳定性提高的蛋白酶。8. 根据权利要求1所述的蛋白酶在洗涤剂工业、饲料、肥料、纺织、制革工业、医药领域 的应用。
【文档编号】A61K38/48GK106085990SQ201610410742
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月12日 公开号201610410742.0, CN 106085990 A, CN 106085990A, CN 201610410742, CN-A-106085990, CN106085990 A, CN106085990A, CN201610410742, CN201610410742.0
【发明人】曾静, 袁林, 郭建军, 郭浩, 王林庚
【申请人】江西省科学院微生物研究所, 江西鑫维生物技术有限公司
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