与番茄紫黑色果实基因atv紧密连锁的分子标记及其应用
【专利摘要】本发明属于番茄分子遗传育种技术领域，具体涉及与番茄紫黑色果实基因位点紧密连锁的分子标记及其应用。所述分子标记为HP1917、HP3217和ATV?In，本发明可以替代传统的通过选择紫黑色果实植株以确保育种材料含有番茄紫黑色果实(atv)突变位点的方法。通过分子标记在幼苗阶段检测育种材料是否含有番茄紫黑色果实(atv)突变等位基因，可以缩短育种周期、提高育种效率。
【专利说明】
与番茄紫黑色果实基因 ATV紧密连锁的分子标记及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于番茄分子遗传育种技术领域，具体涉及与番茄紫黑色果实基因位点紧 密连锁的分子标记及其应用。
【背景技术】
[0002] 花青素是植物体内天然产生的一类抗氧化物质，具有抵抗炎症、癌症、病原菌;预 防心血管疾病、肥胖、糖尿病;改善睡眠；增强皮肤免疫力、美容养颜;延缓衰老;提高视力； 等多种生物学活性。植物体内的花青素由于种类、浓度及其所在的环境不同，而呈现不同的 颜色，从而有利于昆虫授粉、种子传播、抵御紫外线伤害。目前还发现花青素还可以延长番 茄果实的货架期。
[0003] 番茄是中国乃至世界上最重要的蔬菜之一，但是目前绝大部分栽培番茄果实几乎 不含花青素。目前绝大部分紫色、棕色或黑色番茄果实的颜色，是由于成熟果实中番茄红素 与残留的叶绿素综合呈现的结果。在自然界中，一些野生种番茄的果实能够积累花青素而 呈紫黑色。将这些野生种番茄分别与普通栽培番茄杂交、后代分离鉴定，发现了多个参与果 实表皮花青素积累的基因位点，如:Aft(Anthocyanin fruit)位点，来之智利番前(Solanum chi lense )，是一个显性位点，位于第10号染色体，推测它可能是番前AN2或ANTI的等位基 因；Abg(Aubergine)位点，来自类番前(S. lycopersicoides)，也是一个显性位点，位于第10 号染色体，推测4&8与4代可能是等位基因；3切(41：1'〇￥；[0130;[11111)位点，来自契斯曼尼番前 (S.cheesmaniae)，是一个隐性位点，位于第7号染色体。atv分别与Aft和Abg存在互作关系， 同时含有两个位点的番茄果实花青素含量显著高于只含一个位点的番茄果实。
[0004] 由于atv是一个隐性突变位点，当该位点处于杂合状态时，其果实颜色与正常植株 (野生型）果实相似，无法区别于正常纯合植株。因此，将atv导入到优良番茄亲本中，或者选 育含有atv的优良番茄育种材料，如果采用传统的通过表型选育的方法，周期长、效率低。分 子标记辅助选择育种，是指利用DNA分子标记对育种材料进行选择，可以缩短育种周期、提 高育种效率。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一套与番茄紫黑色果实性状高度相关的分子标记，及其鉴定 方法，可以作为番茄紫黑色果实性状的分子标记辅助选择工具。
[0006] 为了实现本发明目的，首先通过精细定位将番茄紫黑色果实突变位点(atv)定位 到约9.6kb范围内。
[0007] 该9.6kb片段只含有一个预测的基因 Solyc07g052490,它编码一个Myb转录因子， 因此将该基因命名为MybATV。该基因在矮牵牛和拟南芥中的同源基因可以抑制花青素的生 物合成。
[0008] atv突变位点中MybATV基因的第二外显子中存在一个4bp插入（Insertion，命名为 ATV-In)，蛋白翻译因为移码而提前终止。故证实atv突变位点所编码的MybATV蛋白失去了 抑制花青素生物合成的能力。
[0009] 该插入 ATV-In 的物理位置为:SL2 · 50ch07:61003572。
[0010] 本发明还提供了一套与番茄紫黑色果实性状高度相关的分子标记，所述分子标记 为 HP1917、HP3217 和 ATV-IIUHP1917 位于 MybATV 基因上游约 21kb 处;HP3217 位于 MybATV 基因 下游约9.4kb处;ATV-In位于Myb基因内部。
[0011] 其中，各个分子标记的特异性引物序列及其扩增目的片段长度如下：
[0012] ① HP1917
[0013] 正向引物：5-TCACAAGTAAAGGAGCATCC-3
[0014] 反向引物：5-CTCTTCTTATAGTCACGTAAGTTAG-3
[0015] 含atv位点的Indigo Rose扩增片段长度为117bp，普通栽培番茄(野生型）扩增片 段长度为138bp。
[0016] ②HP3217
[0017] 正向引物：5-ACATTGGTGGCATTGAATATGAG-3
[0018] 反向引物：5-ACAAGTATCACCCTATCCGTCTC-3
[0019]含atv位点的Indigo Rose扩增片段长度为236bp，普通栽培番茄(野生型）扩增片 段长度为200bp。
[0020] ③ATV-In
[0021] 正向引物：5-GAGGTTTCTTCGTTGGTAGTC-3
[0022] 反向引物：5-CTAAATAAAAGTTATTGAGTTCACG-3
[0023]含atv位点的Indigo Rose扩增片段长度为89bp，普通栽培番茄(野生型）扩增片 段长度为85bp。
[0024]本发明还提供一种鉴定番茄紫黑色果实性状的方法，包括以下步骤：
[0025] 1)提取待测番茄的基因组DNA。采用常规的CTAB法提取基因组DNA。
[0026] 2)PCR扩增。以待检测的番茄基因组DNA为模板，利用用于检测InDel标记的特异性 引物进行PCR扩增。① PCR体系（15μ1): 50-100ngAU DNA模板ΙμL，10 X PCR反应缓冲液(含Mg 离子）1.5以1，2.5111]\1(1抑1^1.5以1，1(^]\1引物对各0.3以1，2.51]/^1了39〇财聚合酶0.241， ddH20 10.2μ1。②PCR扩增程序为：94°C预变性5min;94°C变性30s，52°C退火30s，72°C延伸 30s，35 个循环；72°C 延伸 5min。
[0027] 3)PCR扩增产物电泳检测。分子标记HP1917和HP3217的PCR扩增产物采用琼脂糖凝 胶电泳检测，琼脂糖凝胶浓度为3%。分子标记ATV-In的PCR扩增产物采用聚丙烯酰氨凝胶 电泳检测，聚丙烯酰氨凝胶浓度为8%。含有番茄紫黑色果实(atv)纯合突变位点的植株，分 子标记HP1917可以检测到一条117bp的条带、分子标记HP3217可以检测到一条236bp的条 带、分子标记ATV-In可以检测到一条89bp的条带;aa位点为正常纯合(野生型）的植株，分子 标记HP1917可以检测到一条138bp的条带、分子标记HP3217可以检测到一条200bp的条带、 分子标记ATV-In可以检测到一条85bp的条带;aa位点为杂合状态的植株可以同时检测到相 应2条条带。
[0028] 本发明可以替代传统的通过选择紫黑色果实植株以确保育种材料含有番茄紫黑 色果实(atv)突变位点的方法。通过分子标记在幼苗阶段检测育种材料是否含有番茄紫黑 色果实(atv)突变等位基因，可以缩短育种周期、提高育种效率。
【附图说明】
[0029] 图1为番茄紫黑色果实基因 ATV对果实颜色和花青素含量影响的示意图。F3指?3群 体中三种基因型的果实。基因型中，-/-，代表野生型；+/+，代表纯合突变体;+/-，代表杂合 体。花青素含量指的是成熟果实外果皮1〇〇克鲜重中含多少毫克花青素。
[0030] 图2为番茄紫黑色果实ATV基因的精细定位示意图。a ATV基因的初步定位;b ATV 基因的精细定位;c ATV基因定位区域中MybATV基因的3种转录本，它们的第二个外显子中 均含有一个4bp的插入，该插入被命名为ATV-In。白色框代表外显子。
[0031] 图3为分子标记HP1917、HP3217和ATV-In检测Indigo Rose (含atv突变位点）， Heinzl706(野生型）及其杂交后代的电泳图。Μ为50bp DNAmarker，l为Heinzl706(野生型）， 2为Indigo Rose(含atv突变位点），3为FI (Indigo Rose X Heinz 1706)，4-11 为F2群体中的 正常纯合单株，12-19为F2群体中atv突变位点的杂合单株，20-27为F2群体中atv突变纯合 单株。分子标记HP1917(上图）、HP3217(中图）为3%琼脂糖凝胶电泳图片，ATV-In(下图）为 8%聚丙烯酰胺凝胶电泳图片。
【具体实施方式】
[0032] 下面通过【具体实施方式】来进一步阐明说明本发明，但不用来限制本发明的范围。 若未特别指出，实施方式均按照常规实验条件，或按照制造厂商说明书建议的条件。
[0033]实施例1番茄紫黑色果实基因位点的InDel ATV-In的确定
[0034] 番前品种Indigo Rose 的种子购买于 Johnny's Selected Seeds 公司。Indigo Rose含有两个参与果实果皮花青素积累的遗传位点Aft和atv，果实成熟时呈紫黑色。番茄 品种Heinzl706果实成熟时呈红色。两者杂交获得?:』:单株自交繁殖成? 2代分离群体，F2单 株自交繁殖成F3代分1?群体。种植2代分1?群体190株，常规水肥管理。播种F3代分1?群体 1900株，用标记对幼苗进行分子检测后，挑选交换单株定植，常规水肥管理。
[0035] 果实颜色鉴走
[0036] 当番茄果实达到红熟期时，观测果实颜色。根据果实表皮紫色斑点的有无和多少， 将果实颜色分为三类:无紫色斑点、有紫色斑点(但未连成片)和成片紫色（图1)。
[0037]果皮花青素检测
[0038] 当番茄果实达到红熟期时，取新鲜外果皮(peel)2克，液氮中研磨成粉末状，加 l〇ml提取液(无水甲醇/盐酸）萃取过夜，5000g离心10min，取上清用0.45μηι滤膜过滤，滤液 用分光光度计检测，波长分别为535nm和650nm〇
[0039] 基因组DNA提取
[0040] 分单株取子叶或幼嫩叶片，采用常规的CTAB法提取基因组DNA。
[0041 ]设计分子标记引物，进行PCR扩增与电泳检测
[0042] PCR体系（15μ1): 50-100ngAU DNA模板ΙμL，10 X PCR反应缓冲液(含Mg离子）1 · 5μ l，2.5mM dNTPs 1·5μ1，10μΜ引物对各0·3μ1，2·5υ/μ1 Taq DNA聚合酶0·2μ1，(ΜΗ20 10·2μ 1。（2汗0財广增程序为:94°(：预变性51^11;94°(：变性3〇8,52°(：退火3〇8,72°(：延伸3〇8,35个循 环;72°C延伸δπ?η。。)采用3%琼脂糖凝胶进行电泳检测。
[0043] 亲本分子标记多态性筛选
[0044] 所设计引物分别扩增Indigo R〇se、HeinZ1706及其F1的基因组DNA，琼脂糖凝胶电 泳检测14个具有多态性的InDel分子标记。
[0045] ATV基因的初步定位
[0046]利用与番茄Aft位点紧密连锁的AN2基因启动子序列差异，开发了一个InDel分子 标记即1953。利用该分子标记对?2群体190株植株进行分子检测，发现分子标记]3：)1953检测 为杂合和纯合(与紫黑色果实亲本Indigo Rose-致)的植株共121株，其果实表皮都呈现紫 色。其中果实表皮有紫色斑点的植株97株，果实表皮有成片紫色的植株24株，卡平方检测表 明符合3:1分离。说明除了 Aft，还存在另外一个隐性位点控制番茄果实紫黑色。针对控制番 茄花青素积累的基因，利用第7号染色体上的分子标记对这121株进行了分子检测，结合果 实表皮颜色观察数据，将ATV基因初步定位在分子标记HP2675和HP1919之间，约401kb的范 围内。
[0047] ATV基因的基因效应分析
[0048]从F2群体中挑选3株，其Aft位点为纯合状态(Aft(+/+))、atv位点为杂合状态(atv (+/_))，进行自交扩繁获得3个F3代群体。每个F3代群体挑选6株atv位点纯合如Heinzl706 的植株(atv(_/_))、5株杂合单株(atv(+/_))和6株atv位点纯合如Indigo Rose的植株(atv (+/+))，进行表型分析。果实成熟时，atv(-/_)植株果实表皮呈现紫色斑点;atv(+/_)果实 表皮也呈现紫色斑点，但是斑点密度比atv(-/_)稍高些;atv(+/+)果实表皮呈现成片的紫 黑色（图1)。分别检测新鲜外果皮(peel)的花青素含量，atv(-/_)果实外果皮(peel)每100g 鲜重含花青素26. lmg;atv(+/_)果实外果皮(peel)每100g鲜重含花青素35.8mg;atv(+/+) 果实外果皮(peel)每100g鲜重含花青素243.7mg(图1)。上述结果表明atv是一个隐性突变 位点，在Aft(+/+)遗传背景下，当atv为纯合突变状态时，果实表皮花青素含量约提高了约9 倍。
[0049] ATV基因的精细定位
[0050] 利用分子标记HP1919和HP2675对F3群体1900株进行筛选，共得到14株交换单株。 在该区域筛选进一步开发InDel、CAPS和dCAPS分子标记，进行分子检测，同时结合果实表 皮颜色和花青素测定，最终将ATV基因定位分子标记JP13和JP17之间，约9.6kb，该区域编码 1个基因 Solyc07g052490(图2)，它们突变失去活力后，植株呈现花青素累积、紫色更深的症 状。番茄atv突变体与此类似，果实表皮因积累花青素而呈紫色。因此，Solyc07g052490是 ATV基因，将该基因命名为MybATV。
[0051 ] ATV基因位点处InDel ATV-In的确定
[0052] 根据番茄参考基因组Heinz 1706中MybATV基因序列设计引物，对含有atv的番茄 材料Indigo Rose进行PCR扩增、测序。测序结果与番茄参考基因组Heinzl706比对，发现了 多个SNP和InDel，其中一个4bp插入位于基因编码区第二外显子中，能造成移码突变。对番 茄Heinzl706果实表皮进行MybATV基因的转录本PCR扩增、测序，发现了 3种转录本，它们的 第1、2外显子完全相同。番茄Indigo Rose也发现了这三种转录本，但是，第2外显子存在一 个4bp插入，导致移码，蛋白翻译提前终止（图2 )。该4bp插入被命名为ATV-In (ATV Insertion)〇
[0053] 实施例2InDel分子标记ATV-In的开发与验证
[0054] InDel分子标记ATV-In的引物设计
[0055] 根据ATV-In的侧翼序列，设计了2条引物。正向引物为
[0056] 5'-GAGGTTTCTTCGTTGGTAGTC-3'，反向引物为
[0057] 5 '-CTAAATAAAAGTTATTGAGTTCACG-3 '。
[0058] InDel分子标记ATV-In的多态性检测
[0059] PCR 扩增
[0060] 以Indigo Ros、Heinz 1706及其基因组DNA为模板，利用用于检测InDel标记 ATV-In的2条特异性引物进行PCR扩增。① PCR体系（15yl):50-100ngAU DNA模板1μ1，10Χ ?〇?反应缓冲液(含]\^离子）1.5以1，2.51111(1町？8 1.5以1，1(^]\1引物对各0.3以1，2.51]/^1丁&9 DNA 聚合酶 0.2μ1，ddH20 10.2μ1。② PCR 扩增程序为：94 °C 预变性 5min; 94 °C 变性 30s，55 °C 退 火30s，72°C延伸40s，35个循环；72°C延伸5min。
[0061] PCR扩增产物的聚丙烯酰氨凝胶电泳检测
[0062]聚丙稀酰氨凝胶浓度为8%。含atv位点的Indigo Rose可以检测到一条89bp的条 带;atv位点为正常纯合(野生型）的Heinz 1706植株可以检测到一条85bp的条带;atv位点 为杂合状态的Fi单株可以同时检测到上述2条条带（图3)。
[0063] InDel分子标记ATV-In的F2群体验证
[0064] 利用InDel分子标记ATV-In对F3群体植株进行分子检测。发现成熟果实呈现成片 紫黑色的植株都只扩增出一条89bp的条带，表明InDel分子标记ATV-In与ATV的突变等位基 因共分离。而成熟果实呈现紫黑色斑点的植株中，约1/3的植株只扩增出一条85bp的条带， 其余的植株可以同时检测到上述2条条带（图3)。
[0065] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但是 对于本领域技术人员而言，在本发明基础上，对之作一些修改或改进是显而易见的。因此， 在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1. 与番茄紫黑色果实性状高度相关的分子标记，其特征在于，所述分子标记为HP1917、 HP3217和ATV-In，其中，各个分子标记的特异性引物序列如下： ΦΗΡ1917 正向引物：5-TCACAAGTAAAGGAGCATCC-3 反向引物：5-CTCTTCTTATAGTCACGTAAGTTAG-3; ◎HP3217 正向引物：5-ACATTGGTGGCATTGAATATGAG-3 反向引物：5-ACAAGTATCACCCTATCCGTCTC-3 ③ATV-In 正向引物：5-GAGGTTTCTTCGTTGGTAGTC-3 反向引物：5-CTAAATAAAAGTTATTGAGTTCACG-3。2. 权利要求1所述的与番茄紫黑色果实性状高度相关的分子标记用于选择番茄紫黑色 果实植株的应用。
【文档编号】C12N15/11GK106086007SQ201610405970
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月10日
【发明人】黄泽军, 杜永臣, 邱正坤, 曹雪, 王孝宣, 高建昌, 国艳梅
【申请人】中国农业科学院蔬菜花卉研究所