一种线性双链腺相关病毒基因组的体外制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种线性双链腺相关病毒基因组，其包括腺相关病毒左端反向末端重复序列L?ITR、核酸聚合酶启动子序列、目的基因序列、多聚腺苷酸信号序列、腺相关病毒右端反向末端重复序列R?ITR，并且不含病毒复制蛋白基因Rep、病毒结构性蛋白基因Cap、细菌质粒DNA序列、细菌DNA甲基化修饰。该线性双链腺相关病毒基因组突破了腺相关病毒单链基因组在基因表达时必需转化为双链DNA基因组这一限速步骤的限制，没有触发先天免疫应答的毒副作用。本发明还公开了一种体外制备上述线性双链腺相关病毒基因组的方法。
【专利说明】
一种线性双链腺相关病毒基因组的体外制备方法
技术领域
[0001 ]本发明属于分子生物学领域，具体地说，涉及一种线性双链腺相关病毒基因组、其 体外制备方法、及其在制备基因治疗药物中的用途。
【背景技术】
[0002] 基因治疗已被广泛用于治疗遗传病、恶性肿瘤、心血管疾病、感染性疾病等。截止 2016年2月，世界上已有2356个基因治疗药物进入临床试验中（Gene therapy Clinical trials worldwide.Feb.2016)。基因治疗载体有细菌质粒表达载体和病毒表达载体。原核 DNA比如细菌质粒载体中含有细菌复制序列、抗性基因、细菌DNA甲基化的CpG序列。这些在 基因治疗过程中可能引发严重的安全性问题。细菌质粒载体中通常还含有内毒素，其可以 减少基因转移效率，并且触发先天免疫应答的毒副作用。因此，质粒在基因治疗临床研究中 已很少应用。
[0003] 用于基因治疗的病毒载体主要有慢病毒载体和重组腺相关病毒载体。腺相关病毒 (Adeno-associated virus，AAV)是一种微小的（25毫微米)复制缺陷型病毒，属微小病毒科 (parvovirus)，为无包膜的单链线状DNA病毒。腺相关病毒载体可以感染复制期细胞和静止 期细胞，具有长效的转基因表达优越性，并且没有观察到病毒引起的病理毒理反应。因此， 在基因治疗研究领域，它获得了广泛的重视，是最常用的病毒载体。AAV基因组是一种线性 单链DNA分子，其编码区的左右两端是两个起顺式作用的核苷酸反向末端重复（ITR)序列， 长度为约145个核苷酸，在DNA复制起始期间作为引物发挥功能。AAV基因编码区由非结构性 复制基因（Rep)和结构性衣壳基因（Cap)两个主要开放阅读框组成，位于左右两个反向末端 重复序列(L-ITR和R-ITR)之间。AAV基因组包含约4.7千碱基(kb)。
[0004] 常规的单链线状AAV作为基因递送载体也有缺点：1.病毒包装能力有限，仅为约 4·4kb异源性DNA(Grieger JC,Samulski RJ.Advances in Biochemical Engineering/ Biotechnology，2005); 2.AAV介导的基因表达较慢，因为在异源基因表达之前单链AAV基因 组必须转化为双链DNA基因组。已有尝试通过构建双链DNA载体（self-complementary AAV)来解决这个限速步骤，但是这限制了整合入AAV载体的转基因表达盒的长度，其只有原 来表达盒长度的一半（DM McCarty，et al ·，Gene Therapy，2003 ;McCarty，Molecular Therapy .vo 1.16no. lOoct. 2008); 3.细胞培养和分离纯化过程复杂。目前重组腺相关病毒 载体的生产是由三重质粒(腺相关病毒表达载体、腺相关病毒特异血清型载体和腺病毒帮 助载体)联合转染人胚肾上皮细胞(HEK293)，需要大量细胞培养皿或细胞培养工厂，随后是 复杂的纯化程序。这些工艺程序在一定程度上限制了 AAV载体在基因治疗中的广泛应用。
[0005] 美国国立卫生研究院（National Institutes of Health，NIH)发明了一种在昆虫 细胞(sf 9细胞）中生产不含衣壳的AAV载体。首先建立sf 9腺相关病毒表达细胞株，然后使用 表达腺相关病毒类型2的Rep78和Rep52蛋白的重组杆状病毒去感染大量表达sf9腺相关病 毒的细胞群体，持续培养，然后，从sf 9细胞培养群体中分离纯化AAV基因组。此方法生产的 单链腺相关病毒基因组可以避免产生AAV病毒蛋白，但仍然需要大量的分离纯化工作，并且 需要清洁重组杆状病毒的污染(Lina Li，et al.，PLOS 0ne，2013)。
[0006] 另一种制备AAV微载体的方法是酶切质粒载体基因表达盒，回收双链DNA，沸水浴 5min，使其变性，迅速冷却2min，得到AAV-ITR微载体。这种方法，仍然是从细菌质粒来制备 AAV ITR微载体产物(基于AAV-ITR的基因表达微载体。李泰明等，药物生物技术，2013)。
【发明内容】
[0007] 为了克服现有的腺相关病毒基因组表达目的基因时的上述缺陷，克服现有的腺相 关病毒载体生产技术中的不足，得到可高效稳定表达外源基因、产品安全无毒副作用的表 达载体，本发明利用基因工程技术构建了一种线性双链腺相关病毒基因组，并且设计出一 种无需细胞培养体系、易于纯化和量化的体外生产重组腺相关病毒载体的方法。
[0008] 因此，本发明的第一个目的在于提供一种用于表达外源基因的线性双链腺相关病 毒基因组。
[0009] 本发明的第二个目的在于提供一种体外制备上述线性双链腺相关病毒基因组的 方法。
[0010] 本发明的第三个目的在于提供上述线性双链腺相关病毒基因组在制备基因治疗 药物中的用途。
[0011]为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0012] -种线性双链腺相关病毒基因组，其为线性双链DNA分子，包括腺相关病毒左端反 向末端重复序列L-ITR、核酸聚合酶启动子序列、目的基因序列、多聚腺苷酸转录终止信号 序列（比如5个腺苷酸A的序列）、腺相关病毒右端反向末端重复序列R-ITR，并且不含病毒复 制蛋白基因 Rep、病毒结构性蛋白基因 Cap、原核DNA序列比如细菌质粒DNA序列、原核DNA(比 如细菌质粒DNA)甲基化修饰，其中所述的左端和右端是指5 端和3 端。
[0013] 优选地，上述的线性双链腺相关病毒基因组中，所述目的基因序列是选自下组中 的一种：治疗性基因、疾病宿主细胞中缺失基因、具有治疗效用的抗体基因、双特异性抗体 基因、基因编辑有关的核酸内切酶基因、可转录为编码RNA的DNA序列、可转录为反义RNA的 DNA序列、可转录为介导基因转录后沉默的shRNA(short hairpin RNA，即短发夹RNA)的DNA 序列。
[0014] 优选地，上述的线性双链腺相关病毒基因组中，所述的腺相关病毒反向末端重复 序列来源于腺相关病毒1型（AAV1)、2型（AAV2)、5型（AAV5)、6型（AAV6)、8型（AAV8)、9型 (AAV9)或10型(AAV10)，或来源于重组腺相关病毒、人工优化的腺相关病毒。其中所述"来源 于"是指其为与腺相关病毒基因组中反向末端重复互补的DNA序列。
[0015] 优选地，上述的线性双链腺相关病毒基因组中，所述的核酸聚合酶启动子为DNA聚 合酶Π 启动子或RNA聚合酶III启动子，选自下组:CAG、CMV、Efl-a、hU6。
[0016] -种制备上述线性双链腺相关病毒基因组的方法，包括如下步骤：
[0017] a)设计并制备线性双链腺相关病毒基因组的环状模板，包括：
[0018] a-Ι)设计并合成线性双链腺相关病毒基因组，并在其两端添加限制性内切酶位 点，克隆至质粒DNA载体，得到重组质粒载体；
[0019] a-2)用对应于步骤a-Ι)中所述限制性内切酶位点的限制性内切酶消化步骤a-1) 得到的重组质粒载体，分离含线性双链腺相关病毒基因组的DNA片段，并用DNA连接酶将该 DNA片段自身头尾相连接进行环化，得到线性双链DNA分子环状模板；
[0020] a-3)对步骤a-2)得到的线性双链DNA分子环状模板进行纯化；
[0021] b)以步骤a-3)得到的线性双链DNA分子环状模板为模板，进行体外滚环扩增，包 括：
[0022] b-Ι)设计并合成与所述腺相关病毒反向末端重复序列互补的特异DNA扩增引物； [0023] b-2)以步骤a-3)得到的线性双链DNA分子环状模板为模板，以脱氧核糖核苷三磷 酸dNTP为原料，使用具有链置换性的DNA聚合酶进行扩增，得扩增产物；
[0024] c)对步骤b-2)得到的扩增产物进行变性、复性，再用步骤a-2)中所述的限制性内 切酶进行酶切，得到线性双链DNA分子；
[0025] d)分离纯化步骤c)得到的线性双链DNA分子，得到线性双链腺相关病毒基因组。
[0026]在一种优选的实施方式中，上述步骤a-2)和步骤c)中所述的限制性内切酶为平端 末端限制性内切酶例如PVUII、或粘性末端限制性内切酶例如Pac I。
[0027]在一种优选的实施方式中，上述步骤b-2)中所述的具有链置换性的DNA聚合酶是 phi29DNA聚合酶。
[0028] 在一种优选的实施方式中，上述步骤c)中所述的变性、复性、酶切的具体操作包 括:步骤b-2)得到的扩增产物在80°C至95°C温度下变性3分钟，然后，每0.1°C/秒降温复性， 降温直到22°C，再用限制性核酸内切酶进行酶切。
[0029] 在一种优选的实施方式中，上述步骤b-Ι)中所述的引物包括分别用于腺相关病毒 左端反向末端重复序列L-ITR和腺相关病毒右端反向末端重复序列R-ITR的两对引物，一对 是SEQ ID No:l所示的正向引物L-ITR-F1和SEQ ID如：2所示的反向引物1?-几1?-1?1，另一对 是SEQ ID No:3所示的正向引物L-ITR-F2和SEQ ID No:4所示的反向引物R-ITR-R2。
[0030] 在滚环扩增中，L-ITR-F1引物与它的环状模板互补链结合，在DNA聚合酶比如 phi29DNA聚合酶的作用下，催化dNTP合成单链的DNA分子。当反应到达起始点时，原来的DNA 链被新合成的DNA链取代，这个过程被称为链置换过程。同理，R-ITR-R1引物与它的环状模 板互补链结合，在phi29DNA聚合酶的作用下延伸，合成互补链的单链DNA分子。终产物的DNA 分子是由多重拷贝的DNA模板链组成的。
[0031] 上述的线性双链腺相关病毒基因组可用于制备药物，所述药物用于基因治疗，尤 其是抗病毒或抗肿瘤的药物。
[0032] 本发明提供的线性双链腺相关病毒基因组能够实现外源基因比如治疗性核酸在 宿主细胞内的高效、稳定、安全的表达。本发明提供的体外滚环扩增法的生产过程简单易控 制，产物纯度高、易于纯化，从而克服了现有腺相关病毒载体生产技术中的不足。
【附图说明】
[0033]图1是本发明的线性双链腺相关病毒基因组的DNA分子结构示意图。图中从左至右 依序是L-ITR、CMV(-种核酸聚合酶启动子，用于启动真核基因表达）、增强型绿色荧光蛋白 eGFP基因（示例性的目的基因）、多聚腺苷酸信号(poly A)序列、R-ITR。
[0034]图2是本发明构建的环状DNA模板示意图。
[0035]图3是本发明用于体外制备线性双链腺相关病毒基因组的滚环扩增的流程示意 图。
[0036]图4是本发明构建的环状DNA模板的电泳图。
[0037]图5是本发明的滚环扩增PCR产物的电泳图，显示的是多联体线性双链互补DNA分 子。
[0038]图6是用限制性内切酶对滚环扩增产物进行酶切后得到的线性双链DNA分子的电 泳图，显示的是单个单元的线性双链DNA分子。
[0039]图7是用限制性内切酶对滚环扩增产物进行酶切后得到的线性双链DNA分子的另 一个电泳图，显示的是多联体线性双链互补DNA分子与单个单元的线性双链DNA分子的对 比。
[0040] 图8是显示线性双链腺相关病毒基因组ITR-EGFP-ITR表达的照片。其中，图A是转 染24小时后的照片；图B是转染48小时后的照片；图C是转染72小时后的照片。照片中文字 "Rolling PCR-ITR-eGFP"是滚环扩增产物；"pAAV-eGFP"是质粒表达载体。
【具体实施方式】
[0041] 以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说 明本发明而非用于限定本发明的范围。
[0042] 在本发明中，有时为了描述简便，会将某种蛋白质名称与其编码基因（DNA)名称 混用，本领域技术人员应能理解它们在不同描述场合表示不同的物质。例如，对于增强型绿 色焚光蛋白eGFP(enhanced green fluorescent protein)这种生物学中常用的标记物，用 于描述在宿主中显示有表达时，指的是蛋白质;在作为一种示例性的序列描述DNA分子结构 时，指的是eGFP基因。以此类推。
[0043] 在本发明中，术语"线性双链"、"双链线性"、"线状双链"和"双链线状"表示相同的 含义。类似地，术语"线性单链"、"单链线性"、"线状单链"和"单链线状"表示相同的含义。
[0044] 在本发明中，术语ITR(inverted terminal repeat)指的是反向终端重复序列，即 在同一多核苷酸链内的相反方向上存在的重复的核苷酸序列。
[0045] 本发明的线性双链DNA分子两端为腺相关病毒反向末端重复序列ITR;基因组表达 盒序列包括:核酸聚合酶启动子序列，目的基因序列，多聚腺苷酸转录终止信号序列比如聚 腺苷酸序列AATAAA。
[0046] 为了清楚地描述本发明的线性双链腺相关病毒基因组的DNA分子结构，本文中将 5'-端至3'-端(或者从上游的启动子至下游的多聚腺苷酸信号序列的方向）表示为从左至 右的方向。基于这种定义，本发明中，将位于核酸聚合酶启动子上游的反向末端重复序列命 名为腺相关病毒左端反向末端重复序列、或者左端反向末端重复序列，即L-ITR;将位于多 聚腺苷酸信号(poly A)序列下游的反向末端重复序列命名为腺相关病毒右端反向末端重 复序列、或者右端反向末端重复序列，即R-ITR。
[0047] 本发明的腺相关病毒基因组是线性双链DNA分子，能够突破腺相关病毒单链基因 组转化为双链DNA基因组这一限速步骤的限制，使得目的基因能够在宿主中高效、稳定地表 达。
[0048] 为表述简要起见，本发明中有时将线性双链腺相关病毒基因组简称为线性双链 ITR-DNA-ITR分子或者ITR-DNA-ITR分子，其中"DNA"是指目的基因。
[0049] 本发明中，欲表达的目的基因通常是治疗性核酸或者药靶基因，所述治疗性核酸 例如是治疗性基因或非翻译的RNA如shRNA，一旦到达靶细胞，即可在基因治疗中发挥作用， 在靶细胞中持续表达。治疗性核酸还可导入疾病宿主细胞中缺失的基因，以便修正遗传缺 陷；也可在癌症治疗中导入具有治疗效用的抗体基因、双特异性抗体基因，以及类似物;也 可以用于基因编辑置换，合成RNA指导的与CRISPER相关联的DNA核酸内切酶基因如Cas9、 3&〇389，或合成0嫩指导的核酸内切酶基因如他1：1'〇11(^3(^61'；[111118代80巧;[(%六80)。治疗性 核酸还包括编码的RNA、反义RNA、介导基因转录后沉默的shRNA(short hairpin RNA，即短 发夹RNA)等。
[0050] 在特定的遗传缺陷疾病状况的治疗中，治疗性基因包括编码以下产物的基因：因 子VIII，因子ΙΧ，β珠蛋白，腺苷脱氨酶，α?抗胰蛋白酶，干扰素，葡萄糖6-磷酸酶，α-L-岩藻 糖苷酶，β葡糖苷酸酶，α-L-艾杜糖苷等。治疗中，将通常在宿主中天然发现的编码上述蛋白 质的特定序列用于治疗人类宿主。治疗性基因也可以用于与CRISPER相关联的基因编辑置 换。对于癌症治疗，治疗性基因可以是不同的抗体基因、双特异性抗体基因。shRNA的具体治 疗目标是乙肝病毒和HPV。
[0051] 在本发明的线性双链腺相关病毒基因组中，没有病毒复制蛋白基因(Rep)，没有病 毒结构蛋白基因（Cap)，不会导致天然宿主细胞产生免疫应答。
[0052]本发明的线性双链DNA分子不含任何原核DNA序列比如细菌质粒，没有原核基因组 甲基化的修改，没有内毒素污染，因此不会触发先天免疫应答的毒副作用。
[0053]为了制备线性双链腺相关病毒基因组，本发明采用了滚环扩增(rolling circle amplification，RCA)的方法在体外生产。滚环扩增是一种体外等温核酸扩增方法，以环状 DNA为模板，通过特异性互补配对基因序列引物，在具有链置换性的DNA聚合酶比如 phi29DNA聚合酶的催化下，引物持续沿着环状DNA模板向前移位延伸，同时进行链置换延 伸，形成具有已扩增DNA的多个重复的线状单链产物。
[0054]滚环扩增(RCA)是一种体外等温核酸扩增方法，以环状DNA为模板，通过DNA引物， 在DNA聚合酶比如phi29DNA聚合酶催化下引物持续沿着环状DNA模板向前移位延伸同时链 置换延伸，形成具有已扩增DNA的多个重复的线状单链产物。
[0055] 本发明中特异性互补配对基因序列引物(简称特异性配对引物)是基于AAV2ITR基 因序列设计的。这意味着本发明中生产的腺相关病毒基因组具有从其起始扩增的DNA模板 中的全部互补的序列。因此在链置换反应中形成的是长的线状双链互补DNA分子，并且是多 联体双链DNA产物，包含扩增DNA模板。所述多联体可包含已扩增的"单个单元"的二聚体、四 聚体、八聚体、或更多个单位的多聚体扩增序列，其大小可为至少5kb、或10kb、或20kb、或更 大，从而突破了病毒包装能力较小的限制。
[0056] 本发明提供的滚环扩增方法可在试管里常温下进行，制备出线性双链腺相关病毒 基因组，无需通过传统的基因工程细胞培养来生产。所制备的线性双链DNA由于腺相关病毒 反向末端重复互补序列的存在，可以在宿主细胞核周围形成联体，使得目的基因长期表达 (Mark A.Kay，2003)。
[0057] 本发明的滚环扩增方法操作简单，容易控制，所制备的产物纯度高，而且没有原核 细菌污染，没有细胞杂蛋白污染，易于纯化，适用于基因治疗，尤其是用于抗病毒或抗肿瘤 的治疗。
[0058] 上述的线性双链腺相关病毒基因组可用于制备药物，所述药物用于基因治疗，尤 其是抗病毒或抗肿瘤的药物。
[0059] 出于应用目的，可将线性双链腺相关病毒基因组制备成药物，作为药物直接给药 于受药者身上特定部位，比如肿瘤组织。
[0060] 本发明的药物的剂型可以为多种形式，只要适合于相应疾病的给药、并且恰当地 保持线性双链腺相关病毒基因组的活性并利于目的基因在体内的表达。比如，对于注射用 给药系统，剂型可以是冻干粉。对于皮肤给药，剂型可以选择软膏或涂液。
[0061 ] 实施例 [0062]材料和方法
[0063]本文中的ITR基因载体由GeneScript Inc.合成；ITR引物由百奥迈科生物技术有 限公司合成;表达基因由百奥迈科生物技术有限公司通过PCR制备;表达载体由百奥迈科生 物技术有限公司亚克隆制备。
[0064]实施例1制备线性双链腺相关病毒基因组表达载体
[0065] 合成AAV2左、右ITR基因序列到pUC57载体(pUC57-IT)上。在载体两端添加克隆点 PvuII或PacI，形成pAAVeGFP载体。以pAAVeGFP载体为模板，通过PCR聚合酶链反应合成CMV-EGFP-PolyA表达盒，亚克隆到pUC57-ITR，得到pAAVEGFP-ITR表达载体。用PacI或PVUII酶消 化pAAVEGFP-ITR载体，分离ITR-CMV-EGFP-polyA+-ITR片段，即为用于表达增强型绿色荧光 蛋白eGFP的线性双链腺相关病毒基因组，其分子结构如附图1所示。
[0066] 其中AAV2左、右ITR基因序列即L-ITR(SEQ ID No:5)、R-ITR(SEQ ID No:6)分别 是：
[0067] 5 '-CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGC CCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCA-3'（SEQ ID No:5);
[0068] S'-TGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACC AAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAG-3'(SEQ ID No:6)〇
[0069] 实施例2制备环状DNA模板，
[0070] 用连结酶(连结酶T4,购自NEB公司），按照试剂盒的使用说明书，将实施例1中得到 的ITR-CMV-EGFP-polyA+-ITR片段连接，获得环状模板(参见附图2)。
[0071] 实施例3滚环扩增(RCA)
[0072] 3.1设计特异性配对引物
[0073]设计并合成与腺相关病毒反向末端重复序列(AAV2ITR)互补的特异DNA扩增引物， 如表1所示：
[0074] 表1特异DNA扩增引物
[0075]
[0076] 3.2 DNA聚合酶选择
[0077] 任何商购链置换型DNA聚合酶均适用于本发明方法。本发明方法中优选phi 29DNA 聚合酶。phi29DNA聚合酶基因全长1719bp，共编码572个氨基酸，酶蛋白的分子量为66kD，为 单亚基酶。具有高效链置换活性，3 ' -5 '核苷酸校正活性，高保真度，其最佳反应温度为30 。(:。本实验所用phi29DNA聚合酶购自NEB公司。
[0078] 3.3滚环扩增
[0079] 滚环扩增工艺流程如图3所示。实验步骤及条件包括：
[0080] 3.3.1退火反应：
[0081]
[0083] 运行程序:95°C : 2分钟;-60°C : 30秒;-58°C : 30秒;-冰浴：15分钟。
[0084] 3.3.2滚环PCR 反应：
[0085]
[0086] 反应条件：3(TC，18h。
[0087] 3.3.3取2.5μ1反应混合物，取PCR产物的进行琼脂糖凝胶检测。结果如图4和图5所 示。ITR-eGFP-ITR 长度为 1 · 8kb。
[0088] 3 · 3 · 4变性，复性，酶切：
[0089] 将步骤3.3.2得到的扩增产物在80 °C至90 °C温度下变性3分钟，然后，每0.1°C/秒 降温复性，降温直到22°C，形成基因表达型双链DNA。使用限制性核酸内切酶PacI或PVUII酶 (NEB)，按照试剂盒的使用说明书进行酶切。
[0090] 由于本发明中引物是特异性互补配对引物，因此滚环扩增(RCA)产物在链置换反 应中形成的是长的线性双链互补DNA分子，并且是多联体双链互补DNA产物，存在着每一个 已扩增的"单个单元"DNA的多个拷贝。但是在DNA药物的制备中，是以单个单元的DNA基因表 达框工作的。因此，将限制性核酸内切酶与复性多联体温育，以便在它们的识别位点进行酶 解并且释放单个单元。形成单个单元线性双链DNA表达盒。酶切产物的琼脂糖凝胶检测结果 如图6和图7所示，其中图6是单个单元的线性双链DNA表达盒；图7是多联体线性双链互补 DNA分子。
[0091] 3.3.5酶切产物纯化
[0092] 向800μ1酶切产物中，加入200μ1酚:氯仿:异丙醇(25:24:1)混合溶液，混合，沉淀 蛋白，然后13000rpm离心30分钟。将水相转移到干净的管中，加200μ1氯仿提取，然后 13000rpm离心10分钟。
[0093] 将水相转移到另一个干净的管中，用异丙醇沉淀。13,OOOrpm离心30分钟；用75% 乙醇-TE洗涤沉淀。室温吹干乙醇，然后重新溶解DNA颗粒于TE缓冲液或双蒸水中，紫外分光 光度计量化。
[0094] 实施例4体外细胞内观察线性双链AAV基因组的表达
[0095] 4.1实验步骤：
[0096] 第1天:将对数生长期HEK-293T细胞接种于24孔培养板，1.0X105个细胞/ml;
[0097] 第2天:在细胞生长融合度达到60-70 %时进行转染:分别将0.4yg步骤3.3.5得到 的滚环扩增纯化产物和0.4yg阳性对照质粒(Mo c k)加入到5 0 μ 1 Op t i -MEM无血清培养基中， 混匀，室温孵育5min;取ΙμL LipofectamineTM 2000加入到50μ1 Opti-MEM无血清培养基 中，混匀，室温孵育5min。将DNA样品液和Lipof ectamineTM 2000培养液轻轻混合，室温孵育 20min〇
[0098] 将培养板内按需求量换成无血清及抗生素的基础培养基。一个小时后加入DNA/ Lipofectamine 车专染液。
[0099]转染4_6h后将培养板中换成完全培养基，定时进行后续实验。
[0100] 4.2实验结果：
[0101]在转染24小时、48小时、72小时后，灾光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达，并拍照。 结果如图8所示，转染24小时后观察到绿色荧光蛋白得到表达，48小时、72小时后表达效果 显著。图8中，中间照片Rol 1 ing PCR-ITR-eGFP是步骤3 · 3 · 5的滚环扩增纯化产物；右边照片 pAAV-eGFP是细菌质粒，为阳性对照。
[0102]虽然以上仅以AAV2ITR作为腺相关病毒反向末端重复序列、以增强型绿色荧光蛋 白eGFP基因为示例性的目的基因为例，对本发明的技术方案进行了验证，但是根据本发明 的公开，采用其他种类腺相关病毒反向末端重复序列和目的基因同样可以方便地实施滚环 扩增，制备出线性双链腺相关病毒基因组，这对于本领域的技术人员来说是显而易见的。因 此，在不违背本发明的思想下，本领域技术人员可以在此基础上对本发明作各种改动或者 修改，所做的各种变形或者修改的等价形式，同样应属于本发明的范围。
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[0110] 7.Free DNA Ends Are Essential for Concatemerization of Synthetic Double-Stranded Adeno-Associated Virus Vector Genomes Transfected into Mouse Hepatocytes in Vivo.Hiroyuki Nakai,Mark A.Kay,Molecular Therapy,2003.〇
【主权项】
1. 一种线性双链腺相关病毒基因组，其为线性双链DNA分子，包括腺相关病毒左端反向 末端重复序列L-ITR、核酸聚合酶启动子序列、目的基因序列、多聚腺苷酸信号序列、腺相关 病毒右端反向末端重复序列R-ITR，并且不含病毒复制蛋白基因 Rep、病毒结构性蛋白基因 Cap、细菌质粒DNA序列、细菌DNA甲基化修饰，其中所述的左端和右端是指线性双链DNA分子 的5'-端和3'-端。2. 如权利要求1所述的线性双链腺相关病毒基因组，其特征在于，所述目的基因序列是 选自下组中的一种：治疗性基因、疾病宿主细胞中缺失基因、具有治疗效用的抗体基因、双 特异性抗体基因、基因编辑有关的核酸内切酶基因、可转录为编码RNA的DNA序列、可转录为 反义RNA的DNA序列、可转录为介导基因转录后沉默的shRNA的DNA序列。3. 如权利要求1所述的线性双链腺相关病毒基因组，其特征在于，所述的腺相关病毒反 向末端重复序列来源于腺相关病毒1、2、5、6、8、9或10型，或来源于修饰过的重组腺相关病 毒。4. 如权利要求1所述的线性双链腺相关病毒基因组，其特征在于，所述的核酸聚合酶启 动子为DNA聚合酶II启动子或RNA聚合酶III启动子，选自下组:CAG、CMV、Ef 1 -a、hU6。5. -种制备如权利要求1-4中任一项所述线性双链腺相关病毒基因组的方法，包括如 下步骤： a) 设计并制备线性双链腺相关病毒基因组的环状模板，包括： a_l)设计并合成线性双链腺相关病毒基因组，并在其两端添加限制性内切酶位点，克 隆至质粒DNA载体，得到重组质粒载体； a-2)用对应于步骤a-Ι)中所述限制性内切酶位点的限制性内切酶消化步骤a-Ι)得到 的重组质粒载体，分离含线性双链腺相关病毒基因组的DNA片段，并用DNA连接酶将该DNA片 段自身头尾相连接进行环化，得到线性双链DNA分子环状模板； a-3)对步骤a-2)得到的线性双链DNA分子环状模板进行纯化； b) 以步骤a-3)得到的线性双链DNA分子环状模板为模板，进行体外滚环扩增，包括： b-Ι)设计并合成与所述腺相关病毒反向末端重复序列互补的特异DNA扩增引物； b-2)以步骤a-3)得到的线性双链DNA分子环状模板为模板，以脱氧核糖核苷三磷酸 dNTP为原料，使用具有链置换性的DNA聚合酶进行扩增，得扩增产物； c) 对步骤b-2)得到的扩增产物进行变性、复性，再用步骤a-2)中所述的限制性内切酶 进行酶切，得到线性双链DNA分子； d) 分离纯化步骤c)得到的线性双链DNA分子，得到线性双链腺相关病毒基因组。6. 如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤a-2)和步骤c)中所述的限制性内切酶为 平端末端限制性内切酶或粘性末端限制性内切酶。7. 如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤b-2)中所述的具有链置换性的DNA聚合 酶是phi29DNA聚合酶。8. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤c)中所述的变性、复性、酶切的具体操作 包括:步骤b-2)得到的扩增产物在80°C至95°C温度下变性3分钟，然后，每O.rC/秒降温复 性，降温直到22°C，再用限制性核酸内切酶进行酶切。9. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤b-Ι)中所述的引物包括分别用于腺相关 病毒左端反向末端重复序列L-ITR和腺相关病毒右端反向末端重复序列R-ITR的两对引物， 一对是SEQ ID No:l所示的正向引物L-ITR-F1和SEQ ID No:2所示的反向引物R-ITR-R1，另 一对是SEQ ID No:3所示的正向引物L-ITR-F2和SEQ ID No:4所示的反向引物R-ITR-R2。10.如权利要求1-4中任一项所述的线性双链腺相关病毒基因组在制备药物中的应用， 所述药物用于基因治疗。
【文档编号】A61P31/20GK106086012SQ201610463434
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月23日
【发明人】仇建萍, 吉怡, 周宋峰, 李铁军, 朱远源
【申请人】百奥迈科生物技术有限公司