用于扩增襀翅目昆虫线粒体基因组长片段的通用引物的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于扩增覆盖襀翅目昆虫线粒体全基因组的长片段的通用引物，该通用引物由两对引物组成，其序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4所示。采用本发明的通用引物，可以有效地扩增出多种襀翅目物种线粒体基因组的长片段，有助于缩短获取分子数据的周期，为我国襀翅目昆虫的系统发育研究提供了重要工具。
【专利说明】
用于扩増櫝翅目昆虫线粒体基因组长片段的通用引物
技术领域
[0001] 本发明涉及两对用于扩增積翅目昆虫线粒体基因组长片段的通用引物。
【背景技术】
[0002] 積翅目（Plecoptera)又称石蝇，该类昆虫较广泛地分布在多种类型的水域中，是 重要的水质监测指标生物，加强该类群的分类研究，可以更好地为水质环境监测提供服务。
[0003] 从系统学和进化学的角度来看，積翅目是一个关键的类群。虽然積翅目系统发育 被广泛研究，但仍需要通过其他更多的特征来证明。而通过分子手段获得的资料将更有助 于推断積翅目各科间的亲缘关系以及和其他目的亲缘关系。深入了解積翅目昆虫的起源、 进化和系统发育关系，对重建積翅目系统发育乃至研究昆虫纲的进化关系都具有重要意 义。这就需要借助快速而准确的分子手段对積翅目昆虫进行相关领域的研究。
[0004] 近年来，随着分子技术和高通量技术的快速发展，线粒体基因组已成为区分物种 和研究物种进化关系的热点研究对象。因此，利用线粒体基因组对積翅目昆虫进行系统发 育分析是一种较好的方法。目前，昆虫遗传研究过程中，小规模线粒体基因组研究的主流方 法仍然是传统的基于PCR扩增产物的引物步移法。该方法使用的引物数量较多、扩增效率 低、对模版纯度要求高、耗时长，并且缺少足够的特异性，这将阻碍昆虫线粒体基因组分子 数据的快速积累，并对某些昆虫如对積翅目昆虫的系统发育研究造成困难。目前国际上没 有专门针对扩增積翅目昆虫线粒体基因组长片段的通用引物的相关报道。
【发明内容】
[0005] 本发明目的是提供一种積翅目昆虫线粒体基因组长片段扩增的通用引物，它能满 足现有技术的上述需求。
[0006] -种用于扩增積翅目昆虫线粒体基因组长片段的通用引物，由两对引物组其序列 如SEQIDN0·1~SEQIDN0·4所示。
[0007] 本发明还公开了一种積翅目昆虫线粒体基因组长片段的扩增方法，是采用上述的 引物，用25μ1 PCR体系在特定PCR扩增条件下进行目标片段扩增。
[0008] 所述的25μ1 PCR体系是：5μ1 10Xbuffer(+Mg2+)，2.5yl dNTP(2.5mM)，3yl上游引 物（20μΜ)，3μ1下游引物（20μΜ)，0·2μ1 TaKaRa LA Taq酶（5υ/μ1)，1μ1 DNA模板（30ng/yl)， 10.3μ1双蒸水。
[0009] 所述的PCR扩增条件是：93°C预变性2min;92°C变性10s，54°C退火30s，68°C延伸 8min，扩增20个循环;之后92°C变性10s，54°C退火30s，68°C延伸8min，且每一循环增加20s， 扩增20个循环;最后68°C延伸7min。
[0010] 本发明根据昆虫纲昆虫的线粒体基因组存在保守区域的特性，通过比对Genbank 中不同目昆虫的线粒体基因组序列设计出扩增引物。采用本发明的積翅目线粒体基因组长 片段扩增引物，可以有效地扩增出積翅目不同科物种的长片段序列，填补了積翅目长片段 没有通用的扩增引物的空白，对積翅目不同科和属的昆虫进行大规模的长片段测序，将产 物直接进行高通量测序，有效缩短分子数据的获取周期，为我国積翅目昆虫的系统发育和 种群遗传结构研究提供了重要工具。本发明涉及的扩增引物较过去传统方法有较大的优 势，具体表现为:本引物能有效扩增出总长近16000bp的长片段，完全覆盖线粒体基因组全 长，而过去的传统方法有效扩增长度一般为lOOObp左右，且扩增效率低，不利于上述研究的 数据分析。利用本引物对積翅目昆虫进行大规模的系统发育进化分析，能显著降低实验成 本，缩短实验周期，提高实验的准确性。
【附图说明】
[0011] 图1是本发明引物对積翅目4科昆虫线粒体长片段的扩增效果图。1-2为钩積;3-4 为扁積;5-6为绿積;7-8为刺積;Μ为Marker。
[0012] 图2是实验过程中其它引物对積翅目4科昆虫线粒体长片段的扩增效果图。1-2为 钩積;3-4为扁積;5-6为绿積;7-8为刺積;Μ为Marker。
【具体实施方式】
[0013] 本发明的積翅目线粒体基因组长片段的扩增引物筛选方法共分两个步骤：1.以 Genbank中测得的不同目昆虫的线粒体基因组序列为基础，通过比对找出相对保守的序列 片段进行引物设计，同时引入简并位点增加引物通用性;2.将合成的引物对積翅目昆虫线 粒体基因组进行扩增，检测其在積翅目中的通用性和扩增效率;3.在过程中曾设计出多对 引物，经实验结果验证表明本发明的引物最优。
[0014] 下面结合实例对发明做进一步说明：
[0015] 1.样品准备:样品均使用存放于扬州大学应用昆虫研究所标本室内存放于100% 酒精的積翅目不同科的昆虫，包括钩積科、扁積科、绿積科、刺積科等科的積翅目昆虫。
[0016] 2. DNA提取:Axygen试剂盒提取DNA，具体步骤参照说明书。
[0017] 3 .数据来源：数据来源于美国国立生物技术信息中心（NCB I，h 11 p : / www.ncbi.nlm.gov/)。
[0018] 4.序列比对:利用ClustalX软件将不同目昆虫的线粒体基因组全序列进行比对， 找出比较保守、碱基变异度最小的序列区域。
[0019] 5.引物合成：根据上述的比对结果，利用引物设计软件Primer Premier 5在碱基 变异度最小的序列区域设计出2对引物。引物序列为
[0020] Au:5'CGAGCWTACTTTACTTCAGCMACWATAATTA3'（SEQ ID N0.1);
[0021] Ad:5'GCAAATARRAARTATCATTCATTCTGGTTGGAT 3'（SEQ ID N0.2);
[0022] Bu:5'TACACCAAACAGGATCAAATAAYCCMWTAGG 3'（SEQ ID N0.3);
[0023] Bd:5'GCTCCACARATTTCTRCATTGACCAAARAA3'（SEQ ID N0.4)。
[0024] 6.引物扩增:将上述扩增引物分别应用于PCR扩增所采集的样本。
[0025] 7.扩增结果检测：扩增引物用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测。结果显示，该引物 可以有效地扩增積翅目昆虫的线粒体长片段。利用这2对引物扩增出的DNA片段总长度约为 leooobp，覆盖積翅目昆虫线粒体基因组(全长为leooobp左右），且琼脂糖凝胶电泳检测条 带较为单一（图1);而当使用其它引物时，电泳检测条带则大量弥散，效果较差（图2)。因此， 本发明引物可以有效地扩增出積翅目不同科物种的线粒体基因组长片段，且测序结果较准 确。
[0026] 8.引物扩增条件：上述引物25μ1 PCR体系为：5μ1 10 Xbuffer(+Mg2+)，2.5yl dNTP (2 · 5mM)，3μ1 上游引物（20μΜ)，3μ1 下游引物（20μΜ)，0 · 2μ1 TaKaRa LATaq酶（5UAU)，ΙμL DNA模板（30ng/yl)，10·3μ1 双蒸水。
【主权项】
1. 用于扩增積翅目昆虫线粒体全基因组长片段的通用引物，其特征在于，由两对引物 组成，其序列如SEQIDN0.1~SEQIDN0.4所示。2. -种積翅目昆虫线粒体全基因组序列的扩增方法，其特征是采用权利要求1所述的 通用引物，用25μ1 PCR体系在PCR扩增条件下进行目标片段扩增。3. 如权利要求2所述的方法，其特征在于所述的25μ1 PCR体系是：5μ1添加 Mg2+的10 X buffer，2.5yl dNTP，3yl上游引物，3μ1 下游引物，0·2μ1 TaKaRa LA Taq酶，ΙμL DNA模板， 10.3μ1双蒸水。4. 如权利要求2所述的方法，其特征在于所述的PCR扩增条件是:93 °C预变性2min; 92 °C 变性1〇8,54°(：退火3〇8,68°(：延伸81^11，扩增20个循环；之后92°(：变性1〇8,54°(：退火3〇8,68 °C延伸8min，且每一循环增加20s，扩增20个循环;最后68 °C延伸7min。
【文档编号】C12N15/10GK106086014SQ201610539758
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年7月8日
【发明人】杜予州, 陈志腾
【申请人】扬州大学