一种细菌i型拓扑异构酶的抑制剂及其应用
【专利摘要】本发明公开了一种细菌I型拓扑异构酶的抑制剂及其应用，属于分子生物学领域。本发明利用bTopo I识别反应底物的特点，提出将具有不配对碱基结构的双链核苷酸作用于bTopo I，从而达到靶向性的抑菌效果。另外，由于bTopo I与哺乳类动物的topoisomerase I有不同的作用机制，因此以具有不配对碱基结构的双链核苷酸为基础的新型抗菌分子，具有干扰细菌的重要功能而不影响宿主细胞的特性，为抗菌药物的研发提供理论依据和全新发展方向。
【专利说明】
一种细菌I型拓扑异构酶的抑制剂及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一种细菌I型拓扑异构酶的抑制剂及其应用，属于分子生物学领域。
【背景技术】
[0002] 细菌I型拓扑异构酶(Bacterial Toposomerase I，bTopo I)是存在于原核细菌生 物中的一种关键核酶，由590个氨基酸组成，分子量为67kD，N-端被发现具有舒缓DNA负超螺 旋的关键结构，bTopo I通过舒缓细菌DNA负超螺旋结构，改变细菌DNA拓扑结构，维持细菌 核酸正常的复制、转录，保证细菌的正常生长、繁殖。
[0003] 当前，对核酸功能的研究结果表明，除了存在编码蛋白质功能外，核酸还在其他生 命活动中发挥着关键作用。目前存在各种功能性的非编码RNA分子、非编码DNA、引起RNA干 扰作用的RNA分子等。
[0004] 目前，细菌的耐药性问题已经成为全球面临的最大的公共卫生问题之一。因为耐 药性问题的严重性，新型抗菌药物的研发迫在眉睫。理想的抗菌药应该提高药物对病原体 的选择性，降低对宿主的毒性。bTopo I正是抗菌药物研发的一个重要祀点。虽然以bTopo I 为靶标的小分子抑制剂已经有相应研究和应用，但多数小分子化学药物选择性差，容易作 用于哺乳动物的topoisomeras I，产生毒副作用。
【发明内容】
[0005] 本发明的一个目的是提供一种细菌I型拓扑异构酶的抑制剂。
[0006] 所述抑制剂是具有错配碱基的双链核苷酸。
[0007] 所述抑制剂可以包括一段或者多段错配碱基，每一段至少含有一个错配碱基。
[0008] 所述抑制剂的双链核苷酸中两条链的长度可以相同，也可以不同。
[0009] 所述错配碱基，可以位于双链核苷酸的任意位置，包括两端和/或中部。
[0010]所述错配碱基的组成，可以是A、T、C、G中的任一一种或几种的组合。
[0011] 所述双链核苷酸的长度没有特别的要求。
[0012] 在本发明的一种实施方式中，所述抑制剂的5'至3'方向的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，3'至5'方向的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0013] 在本发明的一种实施方式中，所述抑制剂的5'至3'方向的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，3'至5'方向的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0014] 在本发明的一种实施方式中，所述抑制剂的5'至3'方向的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，3'至5'方向的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
[0015] 在本发明的一种实施方式中，所述抑制剂的5'至3'方向的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，3'至5'方向的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
[0016] 本发明的另一个目的是提供一种可以用于食品储藏、保鲜中的防腐剂类产品，或 者是用于医疗杀菌方面的抑菌剂，主要活性成分就是上述细菌I型拓扑异构酶的抑制剂。
[0017] bTopo I是通过识别双链DNA中任意一段打开的DNA单链而且发挥作用，而具有不 配对碱基结构的双链核苷酸正好有一段打开的DNA单链的特殊结构。本发明利用bTopo I识 别反应底物的特点，提出将具有不配对碱基结构的双链核苷酸作用于bTopo I，从而达到靶 向性的抑菌效果。另外，由于bTopo I与哺乳类动物的topoisomerase I有不同的作用机制， 因此以具有不配对碱基结构的双链核苷酸为基础的新型抗菌分子，具有干扰细菌的重要功 能而不影响宿主细胞的特性，为抗菌药物的研发提供理论依据和全新发展方向。
【附图说明】
[0018] 图1(A)琼脂糖凝胶电泳测定特殊结构核酸Mismatch DNA 3-mis对bTopo I的抑制 作用；（B)不同浓度3-mis对bTopo I的抑制效果。
[0019] 图2(A)琼脂糖凝胶电泳测定特殊结构核酸Mismatch DNA 5-mis对bTopo I的抑制 作用；（B)不同浓度5-mis对bTopo I的抑制效果。
[0020] 图3(A)琼脂糖凝胶电泳测定特殊结构核酸Mismatch DNA 7-mis对bTopo I的抑制 作用；（B)不同浓度7-mis对bTopo I的抑制效果。
[0021] 图4(A)琼脂糖凝胶电泳测定特殊结构核酸Mismatch DNA 11-mis对bTopo I的抑 制作用；（B)不同浓度11-mis对bTopo I的抑制效果。
[0022] 图5琼脂糖凝胶电泳方法分析各Mismatch DNA与真核生物toposomerase I的抑制 作用。
【具体实施方式】
[0023] 下列实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法
[0024] 下列实施例中所用的材料、试剂、设备耗材如无特殊说明，均可从商业途径获取。
[0025] 表1为本发明实施例涉及的具有特殊结构的寡居核苷酸单链序列。
[0026]
[0028]注:加粗处为各核苷酸序列中突出的错配单链区域。
[0029] 实施例1验证3-mis对bTopo I的抑制效果并得出IC50
[0030] 实验材料
[0031] E.coli Toposomerase I(购于NEB，产品货号#103015)41](： 19(购于NEB，产品货 号#N3041S)、Mismatch单链(序列见表1，由上海捷瑞公司负责合成）、琼脂糖、TAE缓冲液、水 平电泳槽、移液枪、干式恒温仪、微型离心机、伯乐凝胶成像仪、1M氯化钠溶液、loading dying、50mM KAc、20mM Tris-Ac、10mM Mg(Ac)2、100μg/ml BSA(pH 7·9@25Γ)ΕΒ染液等。
[0032] 实验步骤
[0033] (1)制备Mismatch DNA
[0034] 单链序列（表1)由上海捷瑞公司协助合成，公司提供的单链DNA均为20D稀释至25μ 1最终配置为100μΜ，取表中相应3-mis两条单链DNA稀释50倍，加入1Μ氯化钠溶液使混合溶 液中NaCl浓度为50mM。将混合单链DNA溶液置入干式恒温仪温控90°C，5min，后随环境降至 室温，得到2μΜ Mismatch DNA，标记为3-mis〇
[0035] (2)3-mis对bTopo I的抑制
[0036] 首先取1.5ml离心管分别编号0-6,配置添加相应试剂，使0至6各管最终包含5mM KAc、2mM Tris-Ac、lmM Mg(Ac)2、10μg/ml BSA(pH 7.925°C)、250ng pUC 19,其中 1-6管均 包含2U bTopo I，2-6管3-mis浓度最终依次为 12.5nM、25nM、50nM、110nM、300nM。最后将各 管在震荡器震荡数秒并用离心机混匀处理。将各管在干式恒温器中37°C温浴30min。
[0037] (3)凝胶电泳实验
[0038]精确称取琼脂糖1.5g加入锥形瓶，随后用量筒量取150ml TAE缓冲液倒入锥形瓶， 加热混合溶液至溶液澄清透明，之后将溶液倒入水平电泳槽至冷却成胶。
[0039]将（2)中0-6管各加入4μ1 loading dying，震荡离心混匀，后将其注胶上样。电泳 在100V条件下运行lh，结束后取出将凝胶在EB溶液(EB溶液浓度为0.15mg/ml)中浸泡染色 40min后使用伯乐凝胶成像仪成像并使用软件计算得出其IC 5Q(见图1)。从图1中可以看出伴 随3-mis浓度的增加 ，Mismatch DNA对bTopo I的抑制效果亦成正相关，3-mis对bTopo I制 的 IC5Q为0·2450μΜ。
[0040] 实施例2验证5-mis对bTopo I的抑制效果并得出IC50 [0041 ] 实验材料
[0042] E.coli Toposomerase I(购于NEB，产品货号#103015)41](： 19(购于NEB，产品货 号#N3041S)、Mismatch单链(序列见表1，由上海捷瑞公司负责合成）、琼脂糖、TAE缓冲液、水 平电泳槽、移液枪、干式恒温仪、微型离心机、伯乐凝胶成像仪、1M氯化钠溶液、loading dying、50mM KAc、20mM Tris-Ac、10mM Mg(Ac)2、100μg/ml BSA(pH 7·9@25Γ)ΕΒ染液等。
[0043] 实验步骤
[0044] (1)制备Mismatch DNA
[0045] 单链序列（表1)由上海捷瑞公司协助合成，公司提供的单链DNA均为20D稀释至25μ 1最终配置为1〇〇μΜ，取表中相应5-mis两条单链DNA稀释50倍，加入1Μ氯化钠溶液使混合溶 液中NaCl浓度为50mM。将混合单链DNA溶液置入干式恒温仪温控90°C5min，后随环境降至室 温，得到2μΜ Mismatch DNA，标记为5-mis〇
[0046] (2)5-mis对bTopo I的抑制
[0047] 首先取1.5ml离心管分别编号0-6,配置添加相应试剂，使0至6各管最终包含 5mMKAc、2mM Tris-Ac、lmM Mg(Ac)2、10μg/ml BSA(pH 7.9@25。〇、250即 pUC 19,其中 1-6 管均包含2U bTopo I，2-6管5-mis浓度最终依次为20nM、90nM、160nM、230nM、300nM。最后将 各管在震荡器震荡数秒并用离心机混匀处理。将各管在干式恒温器中37°C温浴30min。
[0048] (3)凝胶电泳实验
[0049] 精确称取琼脂糖1.5g加入锥形瓶，随后用量筒量取150ml TAE缓冲液倒入锥形瓶， 加热混合溶液至溶液澄清透明，之后将溶液倒入水平电泳槽至冷却成胶。
[0050] 将(2)中0-6管各加入4ylloading dying，震荡离心混匀，后将其注胶上样。电泳在 100V条件下运行lh，结束后取出将凝胶在EB溶液(EB溶液浓度为0.15mg/ml)中浸泡染色 40min后使用伯乐凝胶成像仪成像并使用软件计算得出其IC 5Q(见图2)，从图2可以看出，伴 随5-mis浓度的增加 ，Mismatch DNA对bTopo I的抑制效果亦成正相关，5-mis对bTopo I抑 制的 IC5Q 为0.1890μΜ.
[0051 ] 实施例3验证7-mis对bTopo I的抑制效果并得出IC50
[0052] 实验材料
[0053] E.coli Toposomerase I(购于NEB，产品货号#103015)41](： 19(购于NEB，产品货 号#N3041S)、Mismatch单链(序列见表1，由上海捷瑞公司负责合成）、琼脂糖、TAE缓冲液、水 平电泳槽、移液枪、干式恒温仪、微型离心机、伯乐凝胶成像仪、1M氯化钠溶液、loading dying、50mM KAc、20mM Tris-Ac、10mM Mg(Ac)2、100μg/ml BSA(pH 7·9@25Γ)ΕΒ染液等。
[0054] 实验步骤
[0055] (1)制备Mismatch DNA
[0056] 单链序列（表1)由上海捷瑞公司协助合成，公司提供的单链DNA均为20D稀释至25μ 1最终配置为1〇〇μΜ，取表中相应7-mis两条单链DNA稀释50倍，加入1Μ氯化钠溶液使混合溶 液中NaCl浓度为50mM。将混合单链DNA溶液置入干式恒温仪温控90°C5min，后随环境降至室 温，得到2μΜ Mismatch DNA，标记为7_mis〇
[0057] (2)7-mis对bTopo I的抑制
[0058] 首先取1.5ml离心管分别编号0-6,配置添加相应试剂，使0至6各管最终包含 5mMKAc、2mM Tris-Ac、lmM Mg(Ac)2、10μg/ml BSA(pH 7.9@25。〇、250即 pUC 19,其中 1-6 管均包含2U bTopo I，2-6管7-mis浓度最终依次为 12.511]\1、2511]\1、5〇11]\1、10〇11]\1、20〇11]\1。最后 将各管在震荡器震荡数秒并用离心机混匀处理。将各管在干式恒温器中37°C温浴30min。
[0059] (3)凝胶电泳实验
[0060]精确称取琼脂糖1.5g加入锥形瓶，随后用量筒量取150ml TAE缓冲液倒入锥形瓶， 加热混合溶液至溶液澄清透明，之后将溶液倒入水平电泳槽至冷却成胶。
[0061]将（2)中0-6管各加入4μ1 loading dying，震荡离心混勾，后将其注胶上样。电泳 在100V条件下运行lh，结束后取出将凝胶在EB溶液(EB溶液浓度为0.15mg/ml)中浸泡染色 40min后使用伯乐凝胶成像仪成像并使用软件计算得出其IC 5Q(见图3)，从图3可以看出，伴 随7-mis浓度的增加 ，Mismatch DNA对bTopo I的抑制效果亦成正相关，7-mis对bTopo I抑 制的 IC5Q 为0.04647μΜ.
[0062] 实施例4验证11-mis对bTopo I的抑制效果并得出IC50
[0063] 实验材料
[0064] E.coli Toposomerase I(购于NEB，产品货号#103015)41](： 19(购于NEB，产品货 号#N3041S)、Mismatch单链(序列见表1，由上海捷瑞公司负责合成）、琼脂糖、TAE缓冲液、水 平电泳槽、移液枪、干式恒温仪、微型离心机、伯乐凝胶成像仪、1M氯化钠溶液、loading dying、50mM KAc、20mM Tris-Ac、10mM Mg(Ac)2、100μg/ml BSA(pH 7·9@25Γ)ΕΒ染液等。
[0065] 实验步骤
[0066] (1)制备Mismatch DNA
[0067] 单链序列（表1)由上海捷瑞公司协助合成，公司提供的单链DNA均为20D稀释至25μ 1最终配置为100μΜ，取表中相应11-mis两条单链DNA稀释50倍，加入1Μ氯化钠溶液使混合溶 液中NaCl浓度为50mM。将混合单链DNA溶液置入干式恒温仪温控90°C5min，后随环境降至室 温，得到2μΜ Mismatch DNA，标记为 11-mis〇
[0068] (2)ll-mis对bTopo I的抑制
[0069] 首先取1.5ml离心管分别编号0-6,配置添加相应试剂，使0至6各管最终包含 5mMKac、2mM Tris-Ac、lmM Mg(Ac)2、10μg/ml BSA(pH 7.9@25。〇、250即 pUC 19,其中 1-6 管均包含2U bTopo I，2-6管3-mis浓度最终依次为 1.562nM、3.125nM、6.25nM、12.5nM、 25nM。最后将各管在震荡器震荡数秒并用离心机混匀处理。将各管在干式恒温器中37°C温 浴30min。
[0070] (3)凝胶电泳实验
[0071]精确称取琼脂糖1.5g加入锥形瓶，随后用量筒量取150ml TAE缓冲液倒入锥形瓶， 加热混合溶液至溶液澄清透明，之后将溶液倒入水平电泳槽至冷却成胶。
[0072]将(2)中0-6管各加入4ylloading dying，震荡离心混匀，后将其注胶上样。电泳在 100V条件下运行lh，结束后取出将凝胶在EB溶液(EB溶液浓度为0.15mg/ml)中浸泡染色 40min后使用伯乐凝胶成像仪成像并使用软件计算得出其IC 5Q(见图4)，从图4可以看出伴随 11-mis浓度的增加，Mismatch DNA对bTopo I的抑制效果亦成正相关，11-mis对bTopol抑制 的 IC5Q为0·01630μΜ.
[0073] 实施例5验证Mismatch DNA对真核生物Toposomerase I的抑制作用 [0074] 实验材料
[0075] CalfToposomerase I(Calftopo I)(购与Takara，产品货号2240A)、pUC 19(购于 NEB，产品货号#似0415)^观&丨^1单链(序列见表1，由上海捷瑞公司负责合成）、琼脂糖、 TAE缓冲液、水平电泳槽、干式恒温仪、微型离心机、移液枪、伯乐凝胶成像仪、1M氯化钠溶 液、loading dying、35〇mM Tris-HCl，（pH8·0)、72〇mM KCl、5〇mM MgCl2、5〇mM DTT、5〇mM spermidine、。· 1 %BSA、EB染液
[0076] 实验步骤
[0077] (1)单链序列（表1)由上海捷瑞公司协助合成，各管单链DNA均为20D稀释至25μ1最 终浓度1〇〇μΜ，取表中相应两条单链DNA稀释50倍，加入1Μ氯化钠溶液使混合溶液中NaCl浓 度为50mM。将混合单链DNA溶液置入干式恒温仪温控90°C5min，后随环境降至室温，得到2μΜ Mismatch DNA，标记为X-mis(X为1、3、5、7、11)〇
[0078] (2)首先取1.5ml离心管分别编号0-7,配置添加相应试剂，使0至7各管最终包含 35mM Tris-HCl，（pH8.0)、72mM KCl、5mM MgCl2、5mM DTT、5mM spermidine、0.01%BSA、 250ng pUC 19,其中 1-7管均包含 1U Calftopo I，2-7管分别包含0·2μΜ的Control、l-mis、 3-111&、5-1114、7-111&、11-111&。将各管在震荡器震荡数秒并用离心机混匀处理。将各管在干 式十旦温器中37 C温洛30min。
[0079] (3)凝胶电泳实验
[0080]精确称取琼脂糖1.5g加入锥形瓶，随后用量筒量取150mlTAE缓冲液倒入锥形瓶， 加热混合溶液至溶液澄清透明，之后将溶液倒入水平电泳槽至冷却成胶。
[0081 ]将（2)中0-7管各加入4μ1 loading dying，震荡离心混匀，后将其注胶上样。电泳 在100V条件下运行lh，结束后取出将凝胶在EB溶液(EB溶液浓度为0.15mg/ml)中浸泡染色 40min后使用伯乐凝胶成像仪成像，见图5,图中，X-mis为不同种类核酸适配体，各特殊结构 寡居核苷酸浓度均为0.2μΜ。通过使用不同种类特殊结构寡居核苷酸研究对Calftopo I的 作用效果发现:通过设计的具有Mismatch结构的寡居核苷酸对Calftopo I没有抑制作用。 [0082]虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技 术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范 围应该以权利要求书所界定的为准。
【主权项】
1. 一种细菌I型拓扑异构酶的抑制剂，其特征在于，是具有错配碱基的双链核苷酸。2. 根据权利要求1所述的一种细菌I型拓扑异构酶的抑制剂，其特征在于，包括一段或 者多段错配碱基，每一段至少含有一个错配碱基。3. 根据权利要求1或2所述的一种细菌I型拓扑异构酶的抑制剂，其特征在于，所述抑制 剂的双链核苷酸中的两条链的长度相同或者不同。4. 根据权利要求1所述的一种细菌I型拓扑异构酶的抑制剂，其特征在于，所述错配碱 基，位于双链核苷酸的任意位置，包括两端和/或中部。5. 根据权利要求1或2或4任一所述的一种细菌I型拓扑异构酶的抑制剂，其特征在于， 所述错配碱基的组成，可以是A、T、C、G中的任一一种或几种的组合。6. 根据权利要求1所述的一种细菌I型拓扑异构酶的抑制剂，其特征在于，所述抑制剂 的5'至3'方向的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，3'至5'方向的核苷酸序列如SEQ ID NO.2 所示；或者，所述抑制剂的5 '至3 '方向的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示，3 '至5 '方向的核 苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；或者，所述抑制剂的5'至3'方向的核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示，3 '至5 '方向的核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示;或者，所述抑制剂的5 '至3 '方向 的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，3'至5'方向的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。7. -种细菌杀菌剂，其特征在于，活性成分包括权利要求1所述的细菌I型拓扑异构酶 的抑制剂。8. -种防腐剂，其特征在于，活性成分包括权利要求1所述的细菌I型拓扑异构酶的抑 制剂。9. 一种医用杀菌剂，其特征在于，活性成分包括权利要求1所述的细菌I型拓扑异构酶 的抑制剂。10. 权利要求1所述的细菌I型拓扑异构酶的抑制剂在食品储藏、保鲜，或者医疗杀菌中 的应用。
【文档编号】A61P31/04GK106086023SQ201610421602
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月13日 公开号201610421602.3, CN 106086023 A, CN 106086023A, CN 201610421602, CN-A-106086023, CN106086023 A, CN106086023A, CN201610421602, CN201610421602.3
【发明人】杨兆琪, 姜拓昱, 仲晗实, 刘元法
【申请人】江南大学