slIP?L基因光效应启动子的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种自番茄中分离出的，能与番茄花叶病毒外壳蛋白互作蛋白slIP?L的光效应启动子。该启动子具序列表中SEQ ID NO.1的核苷酸序列，该启动子的功能是可以在不同光周期的诱导下驱动基因表达，能在分析光调控基因的功能方面发挥重要作用。本发明得到的slIP?L的光效应启动子能够受到不同光周期的调控来引导基因在植物中产生不同程度的表达，从而分析与光调控相关基因的功能，对研究植物光调控相关基因功能方面具有重要意义。
【专利说明】
si IP-L基因光效应启动子
技术领域
[0001] 本发明涉及的是一种基因工程技术领域的基因启动子，具体是一种S1IP-L的光效 应启动子。
【背景技术】
[0002] 番前(Lycopersicon esculentum Mill.)是世界上年产量最高、栽培最广泛的蔬 菜作物之一，也是遗传学、育种学和生物工程等学科研究中的重要对象和试验材料，它在遗 传理论上研究较为深入，其研究结果常常被借鉴用于其他作物上。它品种多、用途广、营养 丰富，在我国南北各地广泛种植。
[0003] 但近年来，随着栽培面积的不断增加和栽培形式的多样化，我国的番茄病害也日 益严重，给番茄生产造成了严重损失。番茄的病害种类繁多，世界上发生较严重的病害就有 40多种，其中番前花叶病毒(Tomato mosaic virus，ToMV)引起的番前病毒病是造成番前生 产减产的重要病害之一。该病毒是烟草花叶病毒属(Tobamovirus)的成员之一。其寄主范围 很广，能侵染茄科、十字花科、禾本科、藜科、豆科等许多植物，番茄是其主要寄主。
[0004] IP_L(Interaction Protein L)是从烟草cDNA文库中筛选出的与ToMV CP互作的 寄主蛋白，其序列与普通烟中的一个未知功能的激发子应答蛋白（AB040409)同源性达到 100%〇Zhang C Z等在〈〈Biochemical and Biophysical Research Communications〉〉（生物 化学与生物物理通讯）2008年374卷253-257页发表了题为"Characterization of a specific interaction between IP_L，a tobacco protein localized in the thylakoid membranes ,and Tomato mosaic virus coat protein"（分析了 IP-L的定位和 功能）的论文。文章指出IP-L定位在叶绿体类囊体膜，可能参与光合作用。我们从番茄基因 组中克隆出了 IP-L的同源基因 slIP-L(KP791801)，该基因与烟草IP-L核苷酸和氨基酸的同 源性分别为99.8%和99.4%，并且烟草IP-L中与ToMV CP互作的必需氨基酸位点均未出现 突变。表明slIP-L也与ToMV CP相互作用。番茄抗病毒基因的获得主要是通过大量收集番茄 种质资源进行抗病毒评价，然后，通过生物技术确定抗病克隆鉴定抗病毒基因，最后借助分 子标记辅助育种获得抗病毒番茄新品种。在番茄中已经发现的抗ToMV基因主要是显性抗病 基因 Tm-l、Tm-2和Tm-22(或Tm-2a)，借助这些抗病基因的分子标记标签，已经获得了较好的 抗ToMV品种。但随着病原的不断变异，这些抗性基因显然不能满足抗病毒育种的需求，寻找 新的抗病相关基因已经成了番茄抗病毒育种的关键。有限的种质资源是借助抗病性评价来 发掘更多抗ToMV基因的瓶颈。目前，通过筛选与病毒互作的寄主基因，并进行功能鉴定和抗 病性评价是获得抗病毒基因的新途径。既然slIP-L是与ToMV CP互作，且可能参与光合作 用，受光的调节。
[0005] 目前，研究基因过量表达及敲除基因所用的启动子都是花椰菜花叶病毒的35S启 动子，其在番茄中虽然能成功启动基因的表达，但不受光的调控，在研究光调控基因的功能 方面受到限制。番茄中目前也发现了许多基因的启动子，但多数是组织特异表达启动子，或 受激素及热诱导的启动子，尚未有受光调控启动子的报道。因此克隆slIP-L的启动子对研 究植物光调控相关基因功能方面具有重要意义。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于克服目前已知的番茄启动子的不足，提供能够受到不同光周期 的调控来引导基因在植物中产生不同程度的表达，从而分析与光调控相关基因功能的 slIP-L基因启动子。
[0007] 本发明的技术方案为:一种SlIP-L基因启动子，该启动子的序列为SEQ ID:1。该启 动子来源于番茄，受光周期的调控。
[0008] 该SlIP-L基因启动子的制备方法：
[0009] 步骤一，培养番茄苗至4-6叶期；
[0010]步骤二，采用CTAB法提取番茄总DNA;
[0011] 步骤三，TAIL-PCR法克隆启动子基因组序列；
[0012]步骤四，分析启动子上的顺式作用元件，确定S1IP-L基因启动子的类型；
[0013]步骤五，S1IP-L基因启动子的载体构建；
[0014]步骤六，根癌农杆菌介导slIP-L基因启动子gus基因融合的植物表达载体光诱导 在本氏烟上瞬时表达gus;
[0015] 该制备方法还包括:步骤七，si IP-L基因启动子在本氏烟中的GUS活性测定和染色 检测。
[0016] 该启动子在分析与光调控相关基因功能中的应用。
[0017] 本发明涉及的根癌农杆菌EHA105已在《黄亚丽，蒋细良，田云龙，郭萍，朱昌雄;根 癌农杆菌介导的哈茨木霉菌遗传转化的研究，中国生物工程杂志，2008，28(3): 38-43》文献 中公开。根癌农杆菌EHA105可通过公开市售的商业渠道取得，如可以从澳大利亚CAMBIA公 司购得，菌株编号为Gambarl。
[0018] 本发明的有益效果：
[0019] 本发明克隆得到的slIP-L基因启动子，可以受光的诱导启动并高效表达外源基 因，能应用于分析与光调控相关基因功能中。
【附图说明】
[0020] 图1巢式PCR扩增IP-L基因启动子序列，M:Marker V;l:巢式PCR第二轮产物;2:巢 式PCR第一轮产物。
[0021] 图2 PCR检测启动子序列，M:Marker V;l:未加模板PCR体系；2:含有模板PCR体系。 [0022]图3启动子区顺式作用元件。
[0023]图4光诱导条件下slIP-L基因启动子启动的GUS表达。
[0024]图5本发明的启动子的序列图。
【具体实施方式】
[0025] 1.在温室中盆栽播种番茄种子，培养至4-6叶期；
[0026] 2.烟草基因组DNA的提取（改良CTAB方法）：取lg新鲜番茄叶片在液氮中迅速研磨 成粉末，用预冷的药匙将粉末迅速转移至预冷的50mL离心管中，然后加入10mL预热的CTAB 缓冲液，同时加入巯基乙醇至终浓度为1 % (v/v)，在65°C水浴中轻摇温育10-15min;加入等 体积的氯仿:异戊醇(24:1，v/v)，室温下颠倒混勾；15-20°C，6000rpm离心25-30min，用剪掉 尖头的Tip头将上清转移至新的离心管中；加入至少2/3体积的异戊醇，同时加入NaAc至终 浓度为0.1M，轻轻旋转混匀，-20°C沉淀l_2h;用Tip头挑出团状DNA并转移至1.5mL离心管 中，6000rpm离心10min，除去残余液体；用预冷的70%酒精(900yL)和0.1MKAc/HAc缓冲液 (100yL)洗涤2次，6000rpm离心10min除去残余液体；用预冷的无水乙醇浸泡DNA5min， 12000rpm离心5-10min，除去上清，37 °C干燥；用ddH20溶解干燥的DNA，加入RNase至终浓度 20yg/mL，37°C温育过夜；将DNA转移至15mL离心管中，加入2mL TE、lmL 10M NH4Ac和8mL预 冷的无水乙醇，轻轻混勾；用Tip头挑出团状DNA并转移至1.5mL离心管中，用预冷的无水乙 醇浸泡，12000rpm离心5min，尽可能除去多余液体，37°C干燥5-10min，用ddH2〇重新溶解干 燥的DNA;用紫外分光光度计测量DNA浓度，以1 %的琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量。
[0027]表1本实施例所用的引物
[0028]
[0029] 3.以表2所列出的克隆策略，首先将所制备番茄基因组DNA用几组酶进行单酶切， 然后选择2000-3000bp的片段纯化回收。回收后片段与经相应限制酶切割的T载体连接，以 连接产物为模板进行巢式PCR。如图1所示，只在使用Sac I酶切并连接的产物里扩增到大约 1500bp片段，用稀释后PCR产物做模板进行第二轮巢式PCR，结果又得到了比较特异的产物 (图1)。将该片段纯化回收后克隆入pMD 18-T载体中进行测序。将测序结果拼接后得到 slIP-L上游955bp的片段。为进一步验证该结果的可靠性，根据拼接后序列设计了引物 s 1IP-LP-F，并以番茄基因组DNA为模板、si IP-LP-F和si IP-L-R为引物进行PCR。如图2所示， 在含有番茄基因组DNA为模板的体系中成功扩增到了 1400bp左右的特异性条带，该片段测 序表明含有si IP-L的全长序列。而不加模板的对照中则未见任何条带，表明扩增到的955bp 片段确实为IP-L基因上游启动子序列。
[0030] 表2 IP-L启动子克隆策略
[0031]
[0032] 4.IP-L启动子生物信息学分析
[0033] 利用分子生物学软件和在线软件（http : //bioinformatics · psb · ugent · be/ ?^131：0〇18/^13111^3^/111：1]止/)对获得的811?-1^启动子序列进行初步的生物信息学分析。仅 以启动子序列分析，应用PlantCARE工具在线预测slIP-L启动子区含有多个顺式作用元件， 其中包括多个启动子核心元件CAAT-box和TATA-box。另外该启动子还含有8个不同类型的 光应答元件，如:正链上的Box 4、L_box;负链的ATCT-motif、G-box、GA_motif、GTl-motif、 MRE、chs-Unit lml等(表3)。以slIP-L转录起始位点为+1，其在启动子正链上的顺式作用元 件位置如图3所示。
[0034] 表3应用PlantCARE在线预测的启动子区顺式作用元件 [0035]
[0036] 5. siIP-L基因启动子的载体构建：用表1所列的引入酶切位点的引物以前述获得 的s 1IP-L基因启动子为模板进行PCR，扩增产物经Pst I和BamH頂每切后，连接到经同样酶 双切的p BI121载体上，替换35S启动子。成功构建成slIP-L基因启动子gus基因融合的植物 表达载体。
[0037] 6.将含slIP-L基因启动子和gus基因融合的植物双元表达载体转入根癌农杆菌， 并进行PCR验证。结果表明，含植物双元表达载体已成功导入根癌农杆菌菌株中。
[0038] 7.将含slIP-L基因启动子和gus基因融合的植物双元表达载体的根癌农杆菌5yL 菌液加入5mL含有卡那霉素和链霉素 YEP培养基中，225rpm/min，30°C，培养12-16h;
[0039] 从5mL菌液中取lmL加入浓度为20μΜ的乙酰丁香酮5yL，加入到25mL含有卡那霉素 和链霉素 YEP培养基中225rpm/min，30 °C培养12-16h;
[0040] 从25mL农杆菌菌液中取2mL加入到50mL离心管中，室温5000rpm/min离心15min，弃 上清；
[0041 ] 将沉淀用新配置的缓冲液重悬并调节OD600值至0.6，室温静置3h;
[0042]取培养至5-6叶期生长健壮的本氏烟，在叶片背面用针头打小孔，用去掉针头的 2mL针管吸取农杆菌悬浮液注射到叶片内，每个注射点注射30yL OD600为0.6的菌悬液。光照 条件下诱导⑶S表达。
[0043] 8.用GUS染色缓冲液将X-gluc染色液为50X浓缩液稀释50倍，配成⑶S染色液。将 诱导表达了GUS的本氏烟叶片浸泡在GUS染色液中，于25-37 °C保温1小时。转入70 %乙醇中 脱色2-3次，至阴性对照材料呈白色。肉眼或显微镜下观察⑶S表达情况。如图4所示，在光诱 导条件下可看到本氏烟中的蓝色GUS蛋白，而在黑暗条件下，GUS不能成功表达，未见蓝色。
[0044]以上对本发明的一个实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施 例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进 等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。
【主权项】
1. 一种slIP-L基因启动子，其特征在于，该启动子的序列为SEQ ID:1。2. 根据权利要求1所述的slIP-L基因启动子，其特征在于，该启动子来源于番茄，受光 周期的调控。3. 权利要求1所述的slIP-L基因启动子的制备方法:其特征在于，包括以下步骤： (1)培养番茄苗至4-6叶期；（2)采用CTAB法提取番茄总DNA;(3)TAIL-PCR法克隆启动子 基因组序列；（4)分析启动子上的顺式作用元件，确定slIP-L基因启动子的类型；（5)slIP-L 基因启动子的载体构建；（6)根癌农杆菌介导slIP-L基因启动子gus基因融合的植物表达载 体光诱导在本氏烟上瞬时表达gus。4. 根据权利要求3所属的制备方法，其特征在于:还包括，步骤(7)，slIP-L基因启动子 在本氏烟中的GUS活性测定和染色检测。5. 权利要求1或3所述的slIP-L基因启动子在分析与光调控相关基因功能中的应用。
【文档编号】C12N15/10GK106086024SQ201610430499
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月16日
【发明人】孙现超, 刘凤霞, 彭浩然, 潘琪, 张永至, 魏周玲, 青玲, 张旺
【申请人】西南大学