羊痘病毒重组p32基因及构建和在制备疫苗中的应用
【专利摘要】本发明公开一种羊痘病毒重组P32基因及构建和在制备疫苗中的应用，通过改造羊痘病毒P32基因序列，基因序列大小为777 bp，与原始序列一致性为98.32%，相比于原始序列，在102~103位间插入3 bp碱基，氨基酸数目为259，与原始序列相比，在36~37间插入N氨基酸，但总体氨基酸顺序没有发生改变，等电点pI：9.10，相对分子质量MW=30.268 kD。通过构建以羊痘P32重组基因为靶标抗原基因的活载体DNA疫苗，得到能在体外连续传代，在体内具有良好的安全性，并能在免疫效应细胞内高效表达的减毒鼠伤寒沙门氏菌活载体DNA新型口服疫苗，具有广泛的应用价值和前景。
【专利说明】
羊痘病毒重组基因及构建和在制备疫苗中的应用
技术领域
[0001]本发明涉及分子生物学的技术领域，具体涉及一种羊痘病毒P32重组基因、该基因 的制备方法、该基因作为制备口服DNA疫苗用途的技术领域。
【背景技术】
[0002]羊痕病毒（SAeeftoojr rirt/s a/3t/ GoaijOOJT rirt/s，SGPV)在分类上属于痕病毒科 (Pom'i-ic/ae)脊索动物痕病毒亚科（CAo_rc/〇j〇om>/3ae)羊痕病毒属（Caj〇rij〇om>t/s，CPV)， 主要包括绵羊痘病毒（sAeeftoojr riras，SPPV)和山羊痘病毒（gOaijOOJT rirus，GTPV)，可以 引起绵羊痘/7〇;r，SP)和山羊痘（Aai /7〇;r，GP)。本病是所有动物痘病中最为严重的 一种，妊娠母羊感染极易流产，在羔羊中具有较高的病死率。受感染的羊群生产力大大降 低，毛品质也极大下降，有羊痘流行的国家和地区的易感动物及其相关产品被世界各国列 为严格限制进出的对象，严重影响国际贸易和养羊业的发展。同时，羊痘病毒还可作为生物 武器，威胁国防安全。世界卫生组织将该病列为法定通报传染病，美国疾病控制中心将其划 归到Π 类危险病毒，我国将其列为I类动物疾病。
[0003] 目前对羊痘的治疗无特效药，主要是接种预防和对症治疗。灭活疫苗免疫效果不 佳，只能提供短暂的保护。弱毒疫苗具有潜在的致病性和毒力返强的危险性，且近来越来越 多的报道显示，弱毒疫苗能引起皮肤结节、流产等并发症，为羊痘的有效防控带来了隐患， 不利于彻底消灭羊痘。此外，近年来人感染牛痘病毒的情况在欧洲时有发生，特别是未经种 痘免疫的年轻人。这些动物源性痘病毒感染人的情况的不断出现，使人类防控痘病毒的形 势日趋复杂化，羊痘防控能力、羊肉食品安全等面临严峻的挑战，安全、高效的新型羊痘疫 苗的研制迫在眉睫。
[0004] 随着SGPV基因组的公布，几年的时间内，大量文献报道研究情况，其中以巧2蛋 白为靶标抗原研制新型疫苗是目前国内外学者研究的热点。《2蛋白是SGPV特有的囊膜结 构蛋白，由319-324个氨基酸组成，具有跨膜的螺旋结构和疏水区，跨膜结构位于C端287-307位氨基酸处，疏水区域位于1-18、134-137位氨基酸。《2蛋白含有主要的抗原决定簇，具 有很高的保守性，在所有已分离并检测的SGPV毒株中均存在，可以在感染早期产生抗体，并 且在抗体生成的动态反应实验中发现，/^2蛋白首先引起抗体的反应。近年来，国内外不少 研究人员扩增了基因，克隆至不同载体，并分别在原核和真核细胞中表达了有一定活性 的目的蛋白。但研究发现，巧2蛋白的跨膜区对细胞具有毒性作用，在表达的过程中会出现 表达量低、表达不稳定等问题，这在一定程度上制约着以《2蛋白为靶标抗原的疫苗的应用 前景。研究已证实，截去《2蛋白的跨膜区或疏水区有助于《2蛋白的表达，并能增强其生物 学活性，但至今还未有以同时截去疏水区和跨膜结构及基因突变的重组/^2蛋白作为把抗 原的相关疫苗的报道。
[0005] DNA疫苗是由能够在强真核启动子(如CMV启动子)控制下编码外源抗原基因的细 菌质粒组成，当转染宿主后，抗原呈递细胞(APCs)将DNA疫苗运送至淋巴器官表达目标抗原 并诱导相应的细胞、体液等免疫应答。传统的DNA疫苗免疫接种途径主要是肌肉注射、皮下 注射和电脉冲注射等，研究已表明，这些方法存在抗原递呈效率相对较低，诱导的免疫水平 不高，免疫保护效果不理想，因而，寻求一种安全、高效的疫苗输送体系是DNA疫苗成败的关 键。减毒鼠伤寒沙门氏菌是胞内侵袭性细菌，能够通过粘附、侵袭后定居在肠道相关的淋巴 组织，并经过肠系膜的淋巴结到达肝脏、脾脏，是一种很好的黏膜疫苗载体。携带DNA疫苗质 粒的减毒鼠伤寒沙门氏菌可将DNA质粒直接呈递给APCs，在APCs内发生溶解，或者以宿主吞 噬小体的形式进入细胞质，从而将DNA质粒释放到细胞核内，使外源基因在细胞内表达，从 而刺激机体产生相应的免疫应答。减毒鼠伤寒沙门氏菌活载体除了具有病毒活载体的优点 外，还具有外源基因容纳量大、制备方便、刺激细胞免疫力强等优点，而且细菌载体本身的 脂质体类物质和DNA的未甲基化的基序(motif)还可起到佐剂作用，刺激机体产生更强的B、 T细胞免疫应答。减毒鼠伤寒沙门氏菌活载体疫苗可口服免疫，能诱导机体产生黏膜、细胞、 体液免疫等多种免疫应答反应，因此用它作疫苗的活载体具有巨大的应用潜力，已在多种 疫病的防控疫苗上展开了深入研究。
【发明内容】
[0006] 针对目前国内外对于羊痘病毒P32蛋白的疏水区和跨膜区对细胞具有毒性作用， 在表达的过程中会出现表达量低、表达不稳定等现有技术问题，造成免疫活性低，在一定程 度上制约着P32蛋白开发成疫苗的应用前景。本发明旨在于提供一种羊痘病毒重组《2基因 及构建和在制备疫苗中的应用，通过改造羊痘病毒巧2基因序列，构建以羊痘《2重组基因 为靶标抗原基因的活载体DNA疫苗，得到能在体外连续传代，在体内外具有良好的安全性， 并能在免疫效应细胞内高效表达P32蛋白的新型口服减毒鼠伤寒沙门氏菌活载体DNA疫苗。
[0007] 本发明采用的主要技术方案： 本发明的第一个目的在于提供一种删除跨膜区和疏水区，再经过基因突变、插入碱基 方式改造羊痘病毒《2基因序列，预期这种重组基因疫苗对羊痘的预防和治疗有积极的作 用;本发明的第二个目的在于提供这种羊痘《2重组基因的制备方法，通过取新疆地区某病 羊的皮肤痘疹组织，分离病毒，繁殖培养于原代羔羊睾丸细胞，将病毒感染细胞培养物反复 冻融提取DNA，以羊痘的DNA为模板进行PCR，制备《2基因；本发明的第三个目的在于提供一 种利用本发明公开的羊痘《2重组基因制备用于治疗或预防羊痘的疫苗，特别是一种可以 口服免疫、有较好免疫效果的活载体DNA疫苗以及这种疫苗的制备方法。制备的羊痘病毒 ?2基因减毒鼠伤寒沙门氏菌活载体DNA疫苗能在体外连续传代，安全性好且具有良好的生 物活性，能在免疫效应细胞内高效表达，相比DNA疫苗肌肉注射免疫，该活载体DNA疫苗口服 免疫能够诱导小鼠产生更高水平的体液免疫和细胞免疫水平，并且抗体能以较高水平持续 更长时间，这为应用疫苗进行羊痘的综合防控提供一种新的选择，也为羊痘新型疫苗的制 备开辟了一个新的途径。
[0008] 本发明具体提供一种羊痘《2重组基因，具有如序列表SEQ ID NO. 1所示的碱基序 列，/^2基因序列大小为777 bp，与原始序列一致性为98.32%，相比于原始序列，在78、119、 123、215、275、281、286、492、571、591、594、601、609位发生单个碱基突变，在102~103位间插 入3 bp碱基，氨基酸数目为259,与原始序列相比，28、42、43、72、111、113、115氨基酸发生变 换，在36~37间插入N氨基酸，但总体氨基酸顺序没有发生改变，等电点pi: 9.10，相对分子 质量丽=30.268 kD。
[0009]同时，本发明提供上述羊痘《2重组基因的制备方法，通过选取新疆地区某病羊的 皮肤痘疹组织，分离病毒，繁殖培养于原代羔羊睾丸细胞，将病毒感染细胞培养物反复冻融 提取DNA，以羊痘的DNA为模板进行PCR，制备《2基因，通过将巧2基因原始序列的前20个氨 基酸疏水区和282~304个氨基酸作为跨膜区对应碱基全部去除，设计带有酶切位点引物，通 过PCR突变、碱基插入，改造原《2基因序列获得，采用的上、下游引物分别是： 上游引物： 5 '-CCCAAGCTTACGATGGCCAGAATTAAAAAGTGGCAATGATAT-3 ' 下游引物： 5 '-ACCGAATTCTGAAACCAATGGATGGGATACATAG-3， 进一步，本发明采用上述提供的羊痘巧2重组基因制备用于防治羊痘的药物或者用于 制备防治羊痘的疫苗。
[0010]本发明优先采用制备一种可以口服使用的防治羊痘的减毒鼠伤寒沙门氏菌活载 体DNA疫苗，这种疫苗是将编码前述羊痘《2重组基因的DNA疫苗质粒转入减毒鼠伤寒沙门 氏菌菌株内，构建以羊痘/^2重组基因为靶标抗原基因的活载体DNA疫苗，其中所述的减毒 鼠伤寒沙门氏菌能将DNA疫苗质粒直接输送到免疫效应细胞内进行表达。
[0011]上述的防治羊痘的口服活载体DNA疫苗的制备方法，具体制备方法如下： 通过将本发明的羊痘病毒巧2重组基因与DNA疫苗表达载体pVAXl连接构建重组质粒 pVAXl-/^2,将重组质粒pVAXl-/^2电转化入新鲜制备的大肠杆菌X6212,从其提取重组质 粒，热激法转入减毒减毒鼠伤寒沙门氏菌中间宿主X3730，使DNA疫苗质粒获得鼠伤寒沙门 氏菌的甲基化模式，再从X3730菌中分离DNA疫苗质粒，电转化终末宿主菌X4550，得到减毒 鼠伤寒沙门氏菌活载体DNA疫苗菌X4550/pVAXl-?2，即获得本发明用于防治羊痘的口服活 载体DNA疫苗。
[0012]通过实施本发明具体的
【发明内容】
，可以达到以下技术效果： (1)本发明的重组《2基因通过基因工程手段删除了原始序列疏水区前20位氨基酸和 跨膜区282-304位氨基酸对应碱基，再经碱基突变与插入，优化改造后的序列长度为777 bp，与原始基因序列一致性为98.32%，这些改造有利于提尚P32蛋白的表达量和生物学活 性，并且降低对细胞的毒性。
[0013] ⑵本发明制备的羊痘病毒《2基因能在体内表达，安全性好且具有良好的生物活 性;本发明的减毒鼠伤寒沙门氏菌活载体DNA疫苗株能在体外连续传代，在体内具有良好的 安全性，并能在免疫效应细胞内高效表达，相比DNA疫苗肌肉注射免疫，该活载体DNA疫苗口 服免疫能够诱导小鼠产生更高水平的体液免疫和细胞免疫，并且抗体水平能以较高水平持 续更长时间，这为应用疫苗进行羊痘的综合防控提供一种新的选择，也为羊痘新型疫苗的 制备开辟了一个新的途径。
[0014] (3)采用本发明将DNA疫苗pVAXl-/^2、活载体X4550/pVAXl-?2疫苗分别进行肌肉 注射免疫组、口服免疫组，间接ELISA法检测小鼠血清IgG抗体水平，口服免疫X4550/pVAXl-巧2组与肌肉注射pVAXl-/^2组在免疫42天后抗体水平呈极显著差异(P〈0.01)，口服免疫 X4550/pVAXl-?2组的IgG抗体最高血清稀释滴度达1:51200。结果表明，减毒鼠伤寒沙门氏 菌活载体DNA疫苗的免疫效果明显优于DNA疫苗注射免疫组，且口服活载体DNA疫苗诱导的 体液免疫持续期更长，抗体水平更高。
[0015] (4)采用本发明小鼠于免疫14 d后检测脾淋巴细胞的增殖，口服活载体DNA疫苗 X4550/pVAXl-/^2免疫组与空白对照组差异极显著（？〈0.01)，0嫩疫苗乂4550/?￥4乂1-灼2肌 肉注射免疫组与空白对照组差异显著(0.01〈?〈0.05)。结果表明相对与0嫩疫苗，本发明提 供的活载体DNA疫苗X4550/pVAXl-?2对特异性的淋巴细胞增殖功能效果更强，更易诱导机 体产生较强细胞免疫反应。
[0016] (5)采用本发明携带重组质粒pVAXl-/^2的减毒鼠伤寒沙门氏菌X4550在培养基中 生长曲线良好，可稳定传代100代;通过菌落计数，重组疫苗菌X4550/pVAXl-?2能较持久在 小鼠脾脏内存活，有利于刺激机体产生免疫应答。通过免疫组化法检测X4550/pVAXl-?2在 小鼠脾脏内的表达，减毒鼠伤寒沙门氏菌活载体能将DNA疫苗质粒pVAXl-/^2高效输送到免 疫效应器官，并在其细胞内高效表达。
【附图说明】
[0017] 图1所示为/^2目的基因 PCR的凝胶电泳图，图中：M为DNA Marker DL5000;1为阴性 对照;2为《2基因的PCR产物。
[0018] 图2所示为DNA疫苗重组质粒pVAXl-/^2的PCR的凝胶电泳图，图中:M为DNA Marker DL2000; 1为阴性对照；2为《2基因的PCR产物。
[0019] 图3所示为DNA疫苗重组质粒pVAXl-P32的双酶切凝胶电泳图，图中：M为DNA Marker DL5000; 1为重组质粒pVAXl-/^2的双酶切结果。
[0020] 图4所示为DNA疫苗重组质粒pVAXl-/^2转染BHK-21细胞后的间接免疫荧光检测结 果图，图中：A: pVAXl-P32转染明场;B: pVAXl-P32转染荧光场;C: pVAXl转染明场;D: pVAXl转染荧光场。
[0021] 图5所示为减毒鼠伤寒沙门氏菌活载体DNA疫苗X4550/pVAXl-/^2稳定传代100代 后提取质粒的双酶切鉴定凝胶电泳图，图中：M为DNA Marker DL5000; 1-4为重组质粒 pVAXl-/^2的双酶切结果。
[0022]图6是所示为减毒鼠伤寒沙门氏菌活载体DNA疫苗X4550/pVAXl-P32与空菌株 X4550的生长曲线对比图。
[0023]图7所示为减毒鼠伤寒沙门氏菌活载体DNA疫苗X4550/pVAXl-?2 口服免疫后在小 鼠脾脏细胞内的免疫组化检验图，图中:A为X4550免疫组;B为X4550/pVAXl-?2免疫组。 [0024]图8所示为减毒鼠伤寒沙门氏菌活载体DNA疫苗X4550/pVAXl-?2 口服免疫后的小 鼠血清抗体ELISA检测结果统计图。
[0025]图9所示为减毒鼠伤寒沙门氏菌活载体DNA疫苗X4550/pVAXl-P32 口服免疫与 pVAXl -/?2肌肉注射免疫后的小鼠血清抗体ELI SA检测结果对比图。
[0026]图10所示为减毒鼠伤寒沙门氏菌活载体DNA疫苗X4550/pVAXl-?2 口服免疫后小 鼠血清抗体最高水平时的抗体滴度检测图。
[0027]图11所示为减毒鼠伤寒沙门氏菌活载体DNA疫苗X4550/pVAXl-?2 口服免疫后脾 脏淋巴细胞增殖MTT检测结果图。
[0028]图12所示为减毒鼠伤寒沙门氏菌活载体DNA疫苗X4550/pVAXl-?2的构建流程图。 [0029]图13所示为P32基因测序结果与原始基因序列对比图，图中：两列分别代表 Genbank公布序列(AF124517)和7^2基因测序结果。
[0030] 图14所示为/^2基因翻译后与原始蛋白序列对比图，图中：两列分别代表原始蛋白 序列和《2蛋白。
【具体实施方式】
[0031] 下面结合具体实施例进一步阐明本发明，当然，这些实施例仅用于说明本发明，而 不用于限制本发明要求保护的范围。
[0032] 本发明中涉及到的主要原辅材料、试剂和仪器设备： 主要仪器与试剂:MSSPX-250型生化培养箱，MLS-3020高压蒸汽灭菌锅，SW-CJ-1F B型 单人双面净化工作台，E360K离心机，HWY-100恒温摇床，Eppendorf No:5345PCR仪，Heraeus MultifugeXIR高性能大容量高速冷冻台式离心机，Biotek FLS800t全波长自动荧光酶标 仪，Bio-Rad Mode 200/2.0 电泳仪，Bio-Rad GelDoc XR 凝胶成像仪，Eppendorf BioPhotometer Plus核酸蛋白测定仪，BB150二氧化碳培养箱，NIKON ECLIPSE Ti-E研究级 倒置荧光显微镜，XseriesII型电感耦合等离子体质谱（ICP_MS)，Seven Easy Plus S20P型 精密pH计，DHG-9240A型电热恒温鼓风干燥箱，THZ-82气浴恒温振荡箱，GMSX-280压力蒸汽 灭菌器等。
[0033] EcoRI、HindIII等限制性内切酶、T4 DNA Ligase、DNA Marker DL5000、Ex Taq酶， 宝生物工程（大连）有限公司；PurePlasmid Mini Kit、DNA Purification Kit，北京康为世 纪生物科技有限公司；PageRuler Prestained Protein Ladder，Ferments公司；二氨基庚 二酸（diaminopimelic acid, DAP)、奈啶酮酸（Nalidixic acid, ΝΑ)，Sigma公司；辣根过 氧化物酶（HRP)标记的兔抗羊IgG，北京拜尔迪生物技术有限公司；镍柱，QIGEN; Lipof ectamine 2000脂质体转染试剂盒，Invitrogen公司；RPMI-1640培养基，Hyclone公 司；胎牛血清，浙江天杭生物有限公司；DyLight405 Immunofluorescence Detection Kit (Goat)，生工生物工程(上海)股份有限公司；CCK-8细胞增殖-细胞毒性检测试剂盒，上海贝 博生物；APC Rat Anti-Mouse CD4、FITC Rat Anti-Mouse CD8a、PE Hamster Anti-Mouse CD3e、APC Rat Anti-Mouse IFN_y、PE Rat Anti-Mouse IL-4、固定液、washing buffer、 Golgi stop，BD biosciences;红细胞裂解液，Biosharp;水为超纯水，18.2 ΜΩ .cm，其余 试剂均为分析纯。
[0034]本发明采用的常见的大肠杆菌X6212 (Aasd)(以下简称X6212 )、沙门氏菌中间宿 主X3730(Aasd, Tcs, Strr, AGal)(以下简称X3730)、沙门氏菌终末宿主X4550(Aasd, Acrp, Nalr, Acya)(以下简称X4550)及DNA疫苗表达质粒pVAXl。以上菌株公开于美国专 利US 6872547,本领域普通技术人员可通过公众渠道途径获得。
[0035]本发明中选用的所有试剂和仪器都为本领域熟知选用的，但不限制本发明的实 施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。
[0036] 实施例一 :《2基因的制备 从羊痘感染羊的结痂中分离羊痘病毒，繁殖培养，提取羊痘病毒DNA，以DNA模板进行 PCR，根据GenBank上已发表的GPV P32基因序列(Genbank登录号:AF124517 )，设计引物扩增 删除疏水区和跨膜区的P32碱基。采用的上下游引物分别是： 上游引物F1序列为： 5 '-CCCA^CrrACGATGGCCAGAATTAAAAAGTGGCAATGATAT-3 ' 斜体为^?/κ?ΙΙΙ酶切位点，方框内序列为Kozak序列。
[0037]下游引物F2序列为： 5'-kCCGAA rrCTGAAACCAATGGATGGGATACATAG -3' 斜体为fcoRI酶切位点。
[0038]以XJCJ-GPV的DNA为模板进行PCR反应，反应体系：10X Recation buffer(含 MgCl2)2 yL，dNTP(10 mmol/L)1.6 yL，上游、下游引物Fl/F2(10 pmol/VL)各0.4 yL，DNA模 板 1 yL，灭菌双蒸水 14.1 yL。反应条件:95 °C、5 min;94 °C、1 min;61 °C、1 min;72 °C、1 min，34个循环，72 °C、10 miruPCR产物经1.2 %琼脂糖凝胶电泳，电泳结果参见附图1。以 DNA Purification Kit纯化回收目的基因，测序鉴定。测序结果与原始序列同源性为 98.32%，相比于原始序列，在78、119、123、215、275、281、286、492、571、591、594、601、609位 发生12个碱基突变，在102-103位间插入3 bp碱基，结果见附图13,氨基酸数目为259,与原 始序列相比，28、42、43、72、111、113、115氨基酸发生变换，在36-37间插入天冬酰胺，但总体 氨基酸顺序没有发生改变，结果见附图14，等电点pi:9.10，相对分子质量MW=30.268 kD。上 述采用的羊痘《2重组基因，具有如附后的序列表SEQ ID NO. 1所示的碱基序列。
[0039] 实施例二:DNA疫苗质粒pVAXl-/^2的构建与鉴定 将《2基因目的片段和表达载体pVAXl分别价oRI和历《1ΙΙ?双酶切、回收和纯化，将《2 基房与PVAX1按照摩尔数为3:1的比例通过T4 DNA Ligase连接，连接后的转化产物转化入 新鲜制备的兄coii DH5a感受态中，将转化菌株均匀涂布在含50 yg/mL Kan的LB平板上，37 °C置培养14 h之后，用灭菌牙签蘸取单克隆菌落放入含有Kan的LB培养基中培养14 h，小量 提取质粒之后仍《111:1:和五C〇RI进行双酶切及PCR鉴定，将鉴定正确的菌株命名为pVAXl-?2，PCR及双酶切鉴定结果参见附图2和附图3。
[0040] 实施例三:DNA疫苗质粒pVAXl-/^2表达蛋白的免疫原性检测 1.细胞培养 从液氮中取出冻存的BHK-21细胞，置于37 °C细胞培养箱中快速融化，在7 mL的EP管中 加入4 mL的1640完全培养基，并加入已融化的BHK-21细胞，3000 rpm离心3 min，弃上清， 加入1 mL培养基重悬细胞，置于25 cm2的细胞培养瓶中，并于37 °C、5 % C02培养箱中培养。
[0041] 间接免疫荧光检测pVAXl-/^2转染细胞中《2蛋白的表达 按照常规方法培养BHK-21细胞，以脂质体转染的方法进行细胞转染，具体方法如下： (1)转染前一天，胰酶消化BHK-21细胞后并用细胞计数板计数，细胞以2 X106个/mL的密度 均匀铺在6孔板中，在细胞培养箱中以37 °C培养使细胞在转染时的覆盖密度达到70 %~80 %，转染前2 h，换无抗生素无血清的1640培养基；（2)EP管A:吸取500 yL无血清和抗生素的 1640培养基，加入8 yg pVAXl-/^2重组质粒，弹管壁以混匀液体，于室温条件下静置5 min; (3)EP管B:吸取500 yL无血清和抗生素的1640培养基，加入10 yL Lip 2000脂质体，轻柔混 匀，在室温环境下放置5 min;(4)将A管和B管中的溶液混匀，静置20 min，弃去细胞培养基， 用无血清和抗生素的1640培养基将细胞洗两遍;（5)将混合后的溶液逐滴加入每孔，轻轻以 十字交叉的方向晃动，使溶液均匀铺满整个孔底，放置于37 °C细胞培养箱中培养6 h; (6) 弃去培养基，更换为完全1640培养基，于C02细胞培养箱中培养；（7)PBST洗涤3次，加入固定 液室温固定20 min，PBST洗涤3次，加入0.1 % Triton-X通透15 min;再用PBST洗涤3次，加 入封闭液室温封闭45 min，于每孔中加入1:100稀释的标准羊痘阳性血清作为一抗，4 °C过 夜孵育。PBST洗涤4次，加入1:500稀释的DyLight405标记的兔抗山羊IgG，避光孵育60 min， PBST洗涤3次，滴加900 mol/L的甘油水溶液，在荧光显微镜下观察，间接免疫荧光检测结果 显示，转染pVAXl-/^2重组质粒的BHK-21细胞内能检测到可见荧光，表明重组DNA疫苗质粒 能在细胞内表达P32蛋白，而转染pVAXl质粒的BHK-21细胞检测不到可见荧光，参见附图4。
[0042] 实施例四：活载体DNA疫苗X4550/pVAXl-?2的制备 1.重组质粒pVAXl-/^2转化感受态X6212 实验步骤如下：（1)将3 yL pVAXl-/^2与100 yL X6212感受态菌混匀，冰浴30 min;(2) 放入温度为42 °C的水浴锅90 s(切勿振荡）；（3)迅速放入冰中，冰浴1 min; (4)加入约800 yL 37 °C预热的含50 yg/mL DAP S0C培养基，37 °C，振荡培养1 h;(5)3000 rpm 离心 10 min，弃部分上清，留下约200 yL培养基，轻轻吹起管底部的菌体；（6)将上述菌液均匀涂布 于含20 yg/mL NA的LB平板，倒置培养16~18 h;(7)灭菌牙签挑取单克隆后，37 °C摇菌培 养16 h，碱裂解法小量提取质粒。
[0043] 重组质粒依次电转化X3730和X4550 实验步骤如下：（1)取从上述制备的2-3 yL正常修饰的重组质粒pVAXl-/^2与减毒鼠 伤寒沙门氏菌X3730感受态混匀在一起，冰浴10 min，并将电击杯放在冰上预冷；（2)用滤纸 擦拭电转杯杯壁，将混合液立即滴加到预冷过的的0.2 cm电转杯中，然后放入电转仪样品 槽中；（3)电击转化条件：电压(U)2.5 kV，电容(C)25 Uf，电阻（Ω)200 Ω，将电转液迅速转 入37 °C预热的含50 yg/mL DAP的S0C培养基，并将电击杯中的液体转入灭菌的ΕΡ管中；（4) 37°C，振摇培养lh，弃去部分上清，用剩余液体吹起沉淀并涂布于含50 yg/mL Kan、50 yg/ mL DAP、20 yg/mL ΝΑ的LB平板上，37 °C倒置培养18 h;用灭菌后的牙签挑选单克隆，接种 于含上述抗生素的4 mL LB培养基中，37 °C振荡培养16 h，用碱裂解法提取质粒后电转化 法转入减毒鼠伤寒沙门氏菌X4550感受态（转化步骤同X3730) ; (6)最终所得的重组菌以 X4550/pVAXl-?2命名，原始菌液加入15%甘油冻存于-80°C冰箱备用；（7)同法构建空质粒 重组菌X4550/pVAXl作为空白对照。以上参见附图12。
[0044] 实施例五:活载体DNA疫苗X4550/pVAXl-?2的检测 1. X4550/pVAXl-?2的体外稳定性试验 将重组菌接种在含50 ug/mL DAP、50 ug/mL Kan、20 ug/mL NA的LB培养基中，37 °C摇 菌培养12 h，将重组菌以1:100的比例接种于含上述抗生素 LB培养基中摇菌培养12 h，按照 此方法连续培养4代即50 h，相当于菌体传代100代。取50 h培养的菌液100 yL涂布于含上 述抗生素的LB平板上，随机选取4个单克隆分别接种于含上述抗生素的LB培养基中摇菌培 养16 h，碱裂解法提取质粒，及?〇RI和双酶切，琼脂糖凝胶电泳，以确定重组菌在体 外生长的稳定性。
[0045] 结果显示，X4550/pVAXl-ra2在没有外界选择压力的情况下连续培养100代，随机 挑选4个单菌落经摇菌提取质粒双酶切鉴定后，都有目的条带显现，表明携带重组质粒 pVAXl-/^^勺减毒鼠伤寒沙门氏菌X4550至少可稳定传代100代，电泳结果参见附图5。
[0046] 2. X4550/pVAXl-?2的生长特性试验 分别挑取重组菌ΧΑδδΟ/ρνΑΧΙ-Ζ?ΖαΑδδΟ/ρνΑΧΙ接种于含50 yg/mL DAP、50 yg/mL Kan、20 yg/mL ΝΑ的LB培养基中，两株菌37 °C振荡培养18 h后，分别取50 yL接种于5 mL含 上述相对应抗生素的LB培养基中，继续振荡培养，每隔1 h共18 h测定OD600值，同时绘制两 种菌的生长曲线。结果表明X4550/pVAXl-?2和空菌X4550的生长状态良好，生长曲线基本 一致，表明重组质粒转入减毒鼠伤寒沙门氏菌后，对该菌的生长基本不产生影响，生长曲线 图参见附图6。
[0047] /?小鼠体内稳定性试验 以109 CFU重组菌X4550/pVAn-/^2 口服免疫BALB/C小鼠，于免疫后第2、6、11、31日各 取2只小鼠脱颈处死，无菌取脾脏，加入9倍体积的生理盐水，用手持电动匀浆机处理，以 3000 r/min的转速离心 15 min，取上清涂布于含50 yg/mL Kan、50 yg/mL DAP、20 yg/mL ΝΑ的LB平板上，37 °C倒置培养18 h，菌落计数。结果显示，X4550/pVAXl-/^2 口服接种小鼠 后在免疫第2日，脾脏检测不到X4550/pVAXl-/^2，在第6日可以检测到> 1000个，第11日仍 可检测到317±14个，到31日检测不到重组菌，表明该重组疫苗菌乂4550/?￥六乂1-巧2能较持 久在体内存活，有利于刺激机体产生免疫应答。
[0048] /?脾脏内的表达 免疫组化方法检测X4550/pVAXl-P32在小鼠脾脏内的表达，试验方法如下：（1)将免疫 11日后小鼠脾脏取出后浸泡在10%甲醛溶液中，固定12 h以上直至组织变硬；（2)将组织放 入包埋盒内，用蒸馏水冲洗3遍，再用50%无水乙醇冲洗3遍，用酒精浓度梯度脱水；（3)用 Leica包埋机，将组织包埋在蜡块中，放置室温过夜；（4)将组织蜡块放入-20°C冰箱，用切片 机将组织切成厚度为4 mm的薄片；（5)将组织薄片放入50°C蒸馏水中，使薄片展开，然后用 处理过的载玻片捞片；（6)68°C恒温烤箱烤载玻片2h;(7)脱蜡前将载玻片放入68°C烤箱中 30 min;(8)载玻片放入二甲苯I溶液中15min，二甲苯U溶液中15miη，无水乙醇、95 %酒精I、 95 %酒精11、80 %酒精各5s，自来水洗一遍，蒸馏水洗一遍；（9)载玻片浸泡在3 % Η202中， 室温放置10 min，蒸馏水洗3遍，每次5 min，PBS洗3遍，每次5min; (10)载玻片浸入0.01M枸 橼酸抗原修复液中，将微波炉调至解冻温度(92-98 °C ) 1 Omin，室温冷却，蒸馏水洗1遍，PBS 洗1遍；（11)载玻片放入湿盒中，加入一抗，4 °C冰箱过夜；（12)PBS洗3遍，每次5 min，滴加 186-!?^，37°(：温箱孵育25 1^11，？83溶液洗3遍，每次5 1^11;(13)滴加新鲜配制的048显色 液显色，显微镜下控制显色时间3~10 min，自来水终止显色；（14)苏木素复染5-10 min，蒸 馏水洗、盐酸乙醇分化(快速沾一下）、返蓝(温水1 min)、脱水(梯度酒精80 %、95 % |、11、 无水乙醇各5 s)、透明（二甲苯Σ 41各5 s);(15)中性树胶封片，显微镜下观察、拍照。
[0049] 结果显示，口服免疫组X4550/pVAXl-/^2的小鼠脾脏内有《2蛋白表达，苏木伊红 染色后，可以在免疫组内检测到阳性点，而对照空菌免疫组检测不到阳性点，表明减毒鼠伤 寒沙门氏菌活载体能将DNA疫苗质粒pVAXl-/^2输送到免疫效应器官，并在其细胞内高效表 达，免疫组化结果参见附图7。
[0050]实施例六:小鼠免疫实验 1.小鼠血清IgG抗体水平检测 将50只5~6周龄雌性BALB/C小鼠分成生理盐水对照组、50 yg pVAXl-?2肌肉注射免疫 组、50 yg pVAXl肌肉注射免疫组、101QCFU X4550/pVAXl-/^2口服免疫组、101QCFU X4550/ pVAXl 口服免疫组。小鼠在口服免疫前，过夜禁食，免疫当天禁水4 h后，先用100 yL 10 % NaHC03灌胃以中和胃酸，30 min后免疫小鼠，两次免疫间隔14天，两次免疫剂量相同。所有 小鼠在一免前(0 d)、二免前（14 d)、二免两周(28 d)、二免四周(42 d)、二免六周(56 d)， 用毛细采血针通过眼眶采血法采血，分离免疫血清。间接ELISA法检测血清抗体的OD45Q值， 以《2纯蛋白作为抗原包被ELISA 96孔板，以待检测小鼠的血清为一抗，以HRP标记的羊抗 鼠 IgG( 1:20000)为二抗。具体实验步骤如下：（1)抗原包被:将《2重组蛋白用包被缓冲液稀 释至10 yg/mL，每孔加入150 yL抗原包被液，4 °C包被过夜；（2)封闭：弃去包被液，每孔加 入200 yL PBST，洗涤3次，拍干，每孔加入200 yL封闭液，37 °C封闭2 h;(3)-抗孵育:弃去 封闭液，每孔加入200 yL PBST，洗涤3次，拍干，每孔加入2.5 %封闭液稀释的待检测小鼠血 清150 yL，37 °C孵育4 h;(4)二抗孵育:弃去溶液，每孔加入200 yL PBST，洗涤3次，拍干， 每孔加入1:20000用2.5%封闭液稀释的册?标记的羊抗鼠186 150 41^，37°(：孵育111;(5) 弃去溶液，加入200 yL PBST，洗涤3次；（6)每孔加入新鲜配制的100 yL TMB，37 °C避光显 色15 min，取出后观察颜色变化梯度；（7)每孔加入50 yL终止液，停止显色反应，测量OD45〇 的值；（8)数据通过prism 5进行统计分析、作图；（9)同法检测口服免疫活载体DNA疫苗组的 最高抗体水平时的抗体滴度。
[0051 ] 检测结果显示，口服免疫X4550/pVAXl-/^2组的小鼠在14 d即产生抗巧2 IgG抗 体，在28 d抗体水平达到峰值，随后开始缓慢下降，但42 d、56 d与生理盐水对照组、口服 免疫X4550/pVAXl组相比抗体水平仍呈极显著差异(K0.01、K0.01)。肌注重组质粒pVAXl-巧2免疫组小鼠在14 d也产生抗巧2 IgG抗体，在28 d肌注免疫组小鼠抗体水平达到峰值， 但其抗体水平下降很快，在42 d其抗体水平与生理盐水对照组、肌肉注射重组质粒pVAXl组 差异不显著(A0.05、A0.05)，统计结果参见附图8。口服免疫X4550/pVAXl-?2组与肌肉注 射pVAXl-?2组在免疫42d后抗体水平呈极显著差异(K0.01)，统计结果参见附图9。口服免 疫X4550/pVAXl-?2组的最高血清IgG抗体稀释滴度达1:51200,统计结果参见附图10。由此 可以表明，虽然肌注DNA疫苗也能诱导小鼠产生较高的体液免疫水平，但减毒鼠伤寒沙门氏 菌活载体DNA疫苗的免疫效果明显优于DNA疫苗注射免疫组，且活载体DNA疫苗诱导的体液 免疫持续期更长，抗体水平更高。
[0052] 小鼠脾淋巴细胞增殖的MTT检测 小鼠于免疫14 d后检测脾淋巴细胞的增殖，检测方法如下：（1)小鼠脱颈处死，浸泡于 75 %酒精中，在超净工作台内摘取脾脏，60 mm dish中加入3 mL1640完全培养基，将脾脏于 200目铜网中研磨至无明显的组织和细胞团块，将细胞悬液用200目铜网过滤转至15 mL离 心管中；（2)1200 rpm离心7 min，弃上清；（3)加入约为1 mL的红细胞裂解液，裂解1 min后 加入5 mL 1640完全培养基终止反应；（4)1200 rpm离心7 min，弃上清；（5)加入4 mL 1640 完全培养基，吹散细胞，如果有组织沉淀则需过200铜网；（6)稀释100倍进行细胞计数；（7)1 X106个/mL脾细胞100 yL加入96孔板中，再加入150 yL 1640完全培养基，在边缘孔加入 200 yL培养基；（8)每孔加入20 yg/uL /?2蛋白，37 °C孵育48 h;(9)每孔加入10 yL CCK-8 溶液，37 °C孵育1-4 h;(10)测定每孔450 nm的光吸收值；（11)数据通过prism进行分析、作 图。
[0053] 参见附图11和附图12,检测结果显示，在免疫后14 d，口服活载体DNA疫苗免疫组 与空白对照组差异极显著(P〈〇.〇l)，DNA疫苗肌肉注射免疫组与空白对照组差异显著(0.01 〈代0.05)。结果表明相对与DNA疫苗，活载体DNA疫苗对特异性的淋巴细胞增殖功能效果更 强，更易诱导机体产生较强细胞免疫反应。
[0054]最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发 明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然 可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替 换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明 的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种羊痘《2重组基因，具有如序列表SEQ ID NO. 1所示的碱基序列。2. 如权利要求1所提供的羊痘巧2重组基因，其特征在于，巧2基因序列大小为777 bp， 与原始序列一致性为98.32%，相比于原始序列，在78、119、123、215、275、281、286、492、571、 591、594、601、609位发生单个碱基突变，在102-103位间插入3&?碱基，氨基酸数目为259， 与原始序列相比，28、42、43、72、111、113、115氨基酸发生变换，在36-37间插入~氨基酸，但 P32蛋白氨基酸顺序没有发生改变，等电点pi: 9.10，相对分子质量Mff=30.268 kD。3. -种如权利要求1所述的羊痘巧2重组基因的制备方法，其特征在于，通过分离新疆 地区羊痘病毒，提取DNA，根据DNA模板设计上、下游引物，采用聚合酶链式反应(PCR)制备重 组基因。4. 根据权利要求3所述的羊痘病毒重组巧2基因的制备方法，其特征在于，从羊痘感染 羊的结痂中分离羊痘病毒，繁殖培养，提取羊痘病毒DNA，以DNA模板进行PCR。5. 根据权利要求3所述的羊痘病毒重组巧2基因的制备方法，其特征在于，采用的上下 游引物分别是： 上游引物： 5 '-CCCAAGCTTACGATGGCCAGAATTAAAAAGTGGCAATGATAT-3 ' 下游引物： 5 '-ACCGAATTCTGAAACCAATGGATGGGATACATAG-3 '。6. 如权利要求1所述的羊痘《2重组基因用于制备防治羊痘病的药物。7. 如权利要求1所述的羊痘《2重组基因用于制备防治羊痘病的疫苗。8. -种由权利要求7所述的羊痘烈2重组基因用于制备防治羊痘病的疫苗，其特征在 于，以减毒鼠伤寒沙门氏菌为活载体，将编码羊痘病毒重组《2基因的DNA疫苗质粒递呈到 免疫效应细胞，该重组质粒能在免疫效应细胞内表达《2蛋白。9. 一种如权利要求7所述的防治羊痘的疫苗的制备方法，其特征在于，将权利要求1所 述的羊痘《2重组基因与真核表达载体pVAXl连接构建DNA疫苗重组质粒pVAXl-/^2,将其电 转化大肠杆菌X6212，得到X6212/ pVAXl-/^2，从中提取重组质粒，热激法转化沙门氏菌中 间宿主X3730,使重组质粒获得鼠伤寒沙门氏菌的甲基化模式，再从X3730菌中分离重组质 粒，电转化终末宿主菌X4550,获得重组活载体DNA疫苗株X4550/ pVAXl-/^2。
【文档编号】C12R1/93GK106086043SQ201610562276
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年7月15日
【发明人】丁军涛, 王颖, 张雪彬, 吴金恩, 孔贺磊, 马正海
【申请人】新疆大学, 丁军涛