猪繁殖与呼吸综合征病毒gp5基因重组乳酸菌的构建与表达的制作方法

猪繁殖与呼吸综合征病毒gp5基因重组乳酸菌的构建与表达的制作方法
【专利摘要】一种猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因重组乳酸菌的构建与表达，属于生物技术领域，其特征是：将猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因克隆、测序，对重组质粒pMD19(simple)?dGP5和载体pNZ8149均以Nco Ⅰ、Xba Ⅰ双酶切，酶切产物纯化后以T4DNA连接酶连接；连接产物电转化至lacF基因缺失型的乳酸菌感受态NZ3900中，在LM17恢复培养基上培养，经Ellike平板筛选获得重组表达质粒pNZ8149?dGP5；其有益效果是：猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因可在乳酸乳球菌表达载体pNZ8149中进行重组，通过检测，表明外源基因GP5可以通过表达载体pNZ8149在乳酸菌中表达并具有反应原性，为下一步开发安全、有效、廉价的口服制剂提供实验依据。
【专利说明】
猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因重组乳酸菌的构建与表达
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，尤其是属于一种猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因重 组乳酸菌的构建与表达的生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种高度接触性传染病，该病可引起母 猪的繁殖障碍以及仔猪和育成猪严重的呼吸道疾病，给我国养猪业带来巨大的经济损失。 猪繁殖与呼吸综合征病毒粒子呈球形，直径为48-83nm，有囊膜，属于尼多病毒目动脉炎病 毒科动脉炎病毒属。PRRSV为单股、正链RNA病毒，基因组长约15kb，5 '端具有帽子结构，3 '端 非编码区后存在多聚腺苷酸的P〇ly(A)尾巴。编码9个ORFs，基因分别为0RFla、0RFlb、 01^2 &、01^213、01^3-7，分别编码病毒的非结构蛋白（118?1€[、11叩比和11叩2~8)和结构蛋白 (GP2、E、GP3、GP4和GP5、M、N)。其中GP5是由0RF5基因编码的糖基化囊膜蛋白，分子量大小约 为25kDa，其N端是由约31个氨基酸组成的可切割的信号肽。引导蛋白形成3次跨膜结构。GP5 含有6个抗原决定簇，可以诱导产生中和抗体，且其中和活性在全部结构蛋白中最强，是在 机体免疫应答过程中具有重要意义的结构蛋白。而PRRS目前没有特效药物治疗，主要采取 以预防为主，综合性的治疗措施。国内外均已研制出多种商品化弱毒疫苗和灭活苗，常见的 毒株包括此财4112、01-11?、1?98、几41-1?等不同毒株。通常认为弱毒疫苗免疫效果比灭活疫 苗较好，能在细胞内繁殖，同时刺激机体产生体液免疫和细胞免疫，但可能存在灭活不彻底 和毒力返强的危险。灭活疫苗不能在细胞内进行复制，免疫应答不强，需要多次免疫才能达 到有效的抗体水平，免疫效果不理想。近几年，包括云南省在内的国内猪场的PRRS和由此引 发的继发感染以及多种病原的混合感染普遍存在，因此研制一种安全、高效的新型疫苗显 得尤为重要。
[0003] 乳酸菌(Lactic acid bacteria,LAB)是一类可发酵碳水化合物产生乳酸的非病 原性、革兰氏阳性细菌。在机体的腔道内，如□腔、胃、肠、阴道中都存在多种乳酸菌，分泌有 益于机体的生物活性物质并有效地抑制有害菌的生长。这对于维持机体健康具有很大的作 用，被公认为是安全级(generally recognized as safe,GRAS)的微生物。乳酸菌与大肠杆 菌、酵母菌相比，其分子遗传学的研究起步较晚，随着生物技术的发展，乳酸菌相关的代谢 机制、调控组件、遗传信息已逐步被研究清楚，并建立了包括一系列的乳酸菌表达系统。 [0004] 乳酸菌NICE表达系统即乳酸菌乳链菌肽表达(Nisin controlled expression, NICE)系统，该系统最早由Kuipers等提出。NICE表达系统是以Nisin生物合成相关基因（包 括结构基因 nisA)的启动子nisA和双组分调节系统基因 nisRK为基础，经Nisin诱导表达的 系统。其具体调控机制为:NisK是组氨酸蛋白激酶，它存在细胞膜表面并且作为Nisin分子 的受体。Ni s in和Ni sK结合后，Ni sK自身磷酸化并将磷酸基团传递给细胞内的Ni sR(Ni sR是 反应调控元件），NisR通过NisK的磷酸化作用而被激活，从而作为转录激活物激活下游的诱 导性启动子nisA的基因表达。1928年，Rogerst Whittier首先发现了Nisin，直到1944年 Mattick和Hirsch证明该物质可对许多革兰氏阳性菌具有抑制作用，并将该物质命名为 Nisin<a953年Nisin作为商品进入市场。1988年，美国食品及药品管理局(FDA)确定Nisin可 作为天然的抗菌物质被广泛地应用。1990年1月19日，我国卫生部批准作为食品的抗菌保藏 剂，公认对人和动物安全、无毒害。
[0005] 目前，常见的NICE表达系统包括Lactococcus lactisNZ9000和NZ3900。似3900/ PNZ8149表达系统的优点包括:乳酸乳球菌NZ3900分子遗传背景清晰，调控机制得到深入的 研究，本身为食品级、可鉴定、性质稳定的微生物;质粒PNZ8149上不携带抗性基因，采用了 食品级的筛选标记代替了抗生素抗性基因，安全稳定;诱导物Nisin为食品级，早已广泛应 用于食品防腐，对人体安全无害;乳酸菌安全无毒素，表达的蛋白无需经过纯化，可直接与 菌体一起服用，为蛋白表达后进一步的动物实验研究提供极大的便利。

【发明内容】

[0006] 本发明的目的是:根据云南省猪繁殖与呼吸综合征的流行情况，本研究从云南省 某猪场采集的病料中提取RNA，采用RT-PCR方法扩增GP5基因，利用了乳酸菌NZ3900生长迅 速、易于操作，不含有抗性基因，缺失乳糖操纵子，将PRRSV GP5基因克隆到含有该操纵子的 乳酸乳球菌PNZ8149表达载体中，从而构建pNZ8149-GP5乳酸乳球菌表达载体，并使得PRRSV GP5获得表达。
[0007] 本发明的技术方案是：
[0008] -段用于猪繁殖与呼吸综合征病毒重组乳酸菌表达的基因，本发明该基因段为猪 繁殖与呼吸综合征病毒基因组中的GP5基因。
[0009] -对扩增猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因用的引物，从猪繁殖与呼吸综合征病 毒中提取总RNA为模版，用特异性引物GP5-F/GP5-R，RT-PCR方法扩增出其GP5基因，本发明 的引物基因为，GP5-F: 5' CATGAGGTGGGCAACTGTT 3'，GP5-R: 5' GTCATGTACCCGAAGGTGA 3'。
[0010] -对猪繁殖与呼吸综合征病毒分析用的酶切插入位点，其酶切插入位点为Ncol和 Xbal 〇
[0011] 一对猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因克隆用的引物，该引物对为，dGP5-F: 5'
[0012] CATGCCATGGGCAACAACAACAGCTCTCATATTCA 37
[0013] dGPS-R^^CTCTAGACTAGAGACGACCCCATCGTTCC 37 〇
[0014] 一种猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因重组乳酸菌的构建方法，包括以下步骤： (1)以从猪繁殖与呼吸综合征病料中提取的总RNA为模版，用引物GP5-F/GP5-R，RT-PCR方法 扩增出GP5基因，并将其克隆至pMD19-T载体中，进行核苷酸序列分析;所述的引物：
[0015] GPS-F^^ATGAGGTGGGCAACTGTT 37 ,GP5-R： 57 GTCATGTACCCGAAGGTGA 37 ；
[0016] (2)以上述克隆得到的质粒pMD19-GP5为模版，用带有Ncol和Xbal酶切位点的一对 扩增缺失信号肽的GP5基因（dGP5)表达引物:dGP5-F/dGP5-R扩增dGP5基因，将其克隆至丁-Vector pMD19(simple)后测序，充分培养阳性重组菌，提取质粒pMD19(simple)_dGP5;所述 的引物：
[0017] dGP5-F：57 CATGCCATGGGCAACAACAACAGCTCTCATATTCA 37
[0018] dGPS-R^^CTCTAGACTAGAGACGACCCCATCGTTCC 37 ；
[0019] (3)将上述提取得到的质粒pMD19(simple)-dGP5用NcoI、XbaI双酶切后与用同种 酶双酶切的载体连接，乙醇沉淀法纯化浓缩连接产物，电转化感受态乳酸乳球菌NZ3900，所 述载体为PNZ8149;
[0020] (4)筛选阳性乳酸乳球菌，提取阳性乳酸菌中重组质粒酶切鉴定并对插入序列进 行测序。
[0021] -种猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因重组乳酸菌的构建的表达方法，本发明将 步骤4)筛选到的阳性克隆，经Ni s in诱导后，采用SDS-PAGE进行鉴定，可见约19kDa的融合蛋 白，经Western blotting和IFA分析表明该蛋白具有与PRRSV克隆抗体结合具有免疫反应 性。
[0022] l.PRRSV GP5蛋白0RF5基因的克隆与序列分析
[0023] 参考661^&1^中的美洲型毒株￥1?-23322(1]87392)、1乂41^?112445)、!111财 (EF635006)等基因序列应用Primer5软件设计扩增GP5全长基因的引物:GP5-F/GP5-R，应用 RT-PCR方法扩增出GP5基因，将其克隆至pMD19-T载体中并进行测序和序列分析。根据测序 结果和SignalP 4.1服务器设计去除信号肽的GP5基因（dGP5)表达引物dGP5-F/dGP5-R。其 中dGP5-F引物中酶切位点为Ncol:序列CCATGGdGPS-R引物中酶切位点Xbal，序列:TCTAGA。 dGP5-F/dGP5-R扩增片段用于乳酸乳球菌表面表达载体pNZ8149的重组构建；根据从 GenBank中选取的考序列采用DNAStar生物学软件将测序结果与参考毒株基因序列进行分 析。结果表明：6?5基因片段大小为835匕？，该基因与美洲代表株￥1?-2332同源性为88.4%~ 89.7 %，而与欧洲型代表株LV同源性仅为62.9 %~63.5 %。
[0024] (2) PRRSV重组表达载体pNZ8149-dGP5的构建
[0025] 以阳性质粒pMD19-GP5为模板，用缺失信号肽的亚克隆引物dGP5-F/dGP5-R进行 PCR扩增，经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定后进行胶回收纯化测序。对测序正确的PCR产物与载体 T-Vector pMD19(simple)进行连接转化到DH5a感受态细胞中，通过蓝白斑筛选，挑取白色 单菌落扩大培养后提取质粒，从而得到阳性质粒pMD19(simple)-dGP5。分别用NcoI、XbaI双 酶切质粒pMD19(simple)-dGP5和乳酸乳球菌表面表达载体pNZ8149,对双酶切片段进行胶 回收，将回收的dGP5基因和pNZ8149载体进行连接，把连接产物电转化到乳酸菌NZ3900感受 态细胞中，通过LM17恢复培养基培养后筛选扩大培养得到阳性重组质粒pNZ8149-dGP5。
[0026] (3)重组质粒pNZ8149-dGP5在乳酸乳球菌中的表达
[0027]将保存的pNZ8149-dGP5/NZ3900菌种接种到诱导培养基中培养，使其活化，将活化 的细菌，再次接种到诱导培养基中培养到0D600 = 0.6后用Nisin诱导表达，表达产物经SDS-PAGE分析，可见约19kDa的融合蛋白。经Western blotting分析表明该蛋白具有与PRRSV克 隆抗体具有免疫反应性。
[0028] 本发明的有益效果是：本研究首次构建了PRRSV GP5基因乳酸菌表达载体，用 Nisin诱导表达后，经过SDS-PAGE、Western blotting和IFA分析，表明外源基因 GP5成功地 在乳酸乳球菌中获得了表达，并且具用反应原性，这为开发安全、有效、廉价的口服疫苗奠 定基础，同时利用这一平台也可将其它引起猪类高度接触性传染病的病原微生物的保护性 抗原基因转入益生的乳酸乳球菌中，使其表达。
【附图说明】
[0029]图 1 PRRSV GP5基因 RT-PCR扩增结果M:DL5000Marker;l-4:部分分离株RT-PCR产 物。
[0030] 图2 dGP5PCR扩增电泳结果M:DL2000Marker; 1 :YN03-2012分离株PCR产物。
[0031] 图3 pNZ8149-dGP5的双酶切（NcoI、XbaI)鉴定M:DL5000Marker;l:pNZ8149-dGP5 质粒；2pNZ8149-dGP5双酶切产物。
[0032] 图4不同浓度诱导重组菌的SDS-PAGE分析M:蛋白质分子量标准；1 :NZ39002:未诱 导重组菌3_6: 5、15、20、25ng/mL的Nisin诱导表达菌。
[0033] 图5表达产物的间接免疫荧光分析(200 X)A:诱导的空载体乳酸乳球菌B:诱导的 重组乳酸乳球菌。
【具体实施方式】
[0034] -段用于猪繁殖与呼吸综合征病毒重组乳酸菌表达的基因，本发明该基因段为猪 繁殖与呼吸综合征病毒基因组中的GP5基因。
[0035] -对扩增猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因用的引物，从猪繁殖与呼吸综合征病 毒中提取总RNA为模版，用特异性引物GP5-F/GP5-R，RT-PCR方法扩增出其GP5基因，本发明 的引物基因为，GP5-F: 5' CATGAGGTGGGCAACTGTT 3'，GP5-R: 5' GTCATGTACCCGAAGGTGA 3'。
[0036] -对猪繁殖与呼吸综合征病毒分析用的酶切插入位点，其酶切插入位点为Ncol和 Xbal 〇
[0037] 一对猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因克隆用的引物，该引物对为，dGP5-F: 5'
[0038] CATGCCATGGGCAACAACAACAGCTCTCATATTCA 37
[0039] dGP5-R:5'GCTCTAGACTAGAGACGACCCCATCGTTCC 3'。
[0040] -种猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因重组乳酸菌的构建方法，包括以下步骤： (1)以从猪繁殖与呼吸综合征病料中提取的总RNA为模版，用引物GP5-F/GP5-R，RT-PCR方法 扩增出GP5基因，并将其克隆至pMD19-T载体中，进行核苷酸序列分析;所述的引物：
[0041] GPS-F^^ATGAGGTGGGCAACTGTT 37 ,GP5-R： 57 GTCATGTACCCGAAGGTGA 37 ；
[0042] (2)以上述克隆得到的质粒pMD 19-GP5为模版，用带有Nco I和Xba I酶切位点的一对 扩增缺失信号肽的GP5基因（dGP5)表达引物:dGP5-F/dGP5-R扩增dGP5基因，将其克隆至丁-Vector pMD19(simple)后测序，充分培养阳性重组菌，提取质粒pMD19(simple)_dGP5;所述 的引物：
[0043] dGP5-F：57 CATGCCATGGGCAACAACAACAGCTCTCATATTCA 37
[0044] dGP5-R:5'GCTCTAGACTAGAGACGACCCCATCGTTCC 3';
[0045] (3)将上述提取得到的质粒pMD19(simple)-dGP5用NcoI、XbaI双酶切后与用同种 酶双酶切的载体连接，乙醇沉淀法纯化浓缩连接产物，电转化感受态乳酸乳球菌NZ3900，所 述载体为PNZ8149;
[0046] (4)筛选阳性乳酸乳球菌，提取阳性乳酸菌中重组质粒酶切鉴定并对插入序列进 行测序。
[0047] 一种猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因重组乳酸菌的构建的表达方法，本发明将 步骤4)筛选到的阳性克隆，经Ni s in诱导后，采用SDS-PAGE进行鉴定，可见约19kDa的融合蛋 白，经Western blotting和IFA分析表明该蛋白具有与PRRSV克隆抗体结合具有免疫反应 性。
[0048] 实施例1
[0049] ( - )猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因的克隆及序列分析
[0050] 1.主要试验材料及分子生物学试剂
[0051] (1)样品来源
[0052]从我国云南省各个不同地区采集疑似PRRSV病料，取肺脏、脾脏、淋巴结等组织样 品，分装冻存管中并保存于_80°C。
[0053] (2)菌种与质粒
[0054] 大肠杆菌DH5a及PMD19-T Vector均购自宝生物工程(大连)有限公司。
[0055] (3)主要材料与试剂
[0056] RNAiso Plus、PrimeScript Reverse Transcriptase、RT_PCR反应试剂、DNA Marker均购自宝生物工程(大连)有限公司；DNA胶回收试剂盒购自天根生化科技(北京)有 限公司，普通质粒小提试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司。
[0057] (4)自制试剂
[0058] 100mg/mL氨苄青霉素、0· 1%的DEPC水溶液。
[0059] (5)培养基
[0060] LB 培养液、LB (Amp/X-ga 1 /1PTG)培养基。
[0061] 2.引物的设计与合成
[0062] 参考661^&1^中的美洲型毒株￥1?-23322(1]87392)、1乂六1^?112445)、!111财 (EF635006)等基因序列应用Primer5软件设计扩增GP5全长基因的引物:GP5-F/GP5-R，引物 序列如下：
[0063] GP5-F:5'CATGAGGTGGGCAACTGTT 3'
[0064] GP5-R:5'GTCATGTACCCGAAGGTGA 3'
[0065] 3.样品RNA的提取及RT-PCR扩增
[0066] 按照RNAiso Plus试剂操作说明书，从样品（病料组织和弱毒疫苗）中提取RNA，主 要操作步骤：
[0067] (1)对超低温保存的病料组织称重后迅速移至液氮预冷的研钵中，使用配套的研 杵研磨组织，研磨过程中不断加入液氮直至研磨结束(粉末状）。弱毒疫苗样品的处理:使用 DEPC水溶解疫苗瓶内的冻干粉配制成弱毒疫苗稀释液。
[0068] (2)将研磨好的组织粉末转移至DEPC处理过的1.5mL的离心管中，加入lmL RNAiso Plus(或者吸取300yL弱毒疫苗稀释液加入700yL RNAiso Plus中），反复震荡，室温静置 5min，使其充分裂解。
[0069] (3)加入氯仿(RNAiso Plus的1/5体积量），盖紧离心管盖，混合至溶液乳化呈乳白 色。
[0070] (4)4°C低温离心机12,000g离心10min。从离心机中小心取出离心管，液体分为三 层，即：无色的上清液(含RNA)、中间的白色蛋白层（大部分为DNA)及带有颜色的下层有机 相。
[0071] (5)小心吸取上清液转移至另一新的1.5mL离心管中。向上清中加入等体积的异丙 醇，上下颠倒离心管充分混匀后，_20°C静置10min。
[0072] (6) 12，000g 4°C离心10min。弃去上清，用lmL预冷的75 %的乙醇清洗沉淀，并离心 弃去上清，在超净工作台内打开离心管盖，挥发掉残留的乙醇。
[0073] (7)用DEPC 水溶解 RNA，-80 Γ 保存。
[0074]以提取的RNA为模板，按表1-1在冰盒上配好体系后，轻轻混匀，42°C水浴lh，产物 于-20°C保存。取2yL cDNA为模板进行PCR扩增。PCR体系见表1 -2。
[0075] 表1-lcDNA合成体系
[0076]
[0077]
[0078]
[0079]
[0080] PCR反应条件为：94°C预变性4min;94°C变性40s，58°C退火45s，72°C延伸50s，共30 个循环；72°C终延伸8min。PCR扩增结束后的产物用1 %的琼脂糖凝胶进行电泳，120V恒压 20min，电泳结束后凝胶成像系统检测结果并拍照记录。获得的目的片段与预期大小相符， 大小为835bp结果见图1。
[0081 ] 4. GP5基因的克隆与测序
[0082]按照天根普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒的操作说明对PCR产物进行胶回收操作， 回收产物在16°C条件下与PMD19-T载体连接4h以上，连接体系见表1-3。
[0083] 表1-3连接反应体系
[0084]
[0085] 连接产物转化E.coli DH5a感受态细胞进行蓝白斑筛选，主要步骤为：
[0086] (1)于超低温冰箱中取出冻存的E.coli DH5a感受态细胞置于冰盒上使其融化。 [0087] (2)将10yL的连接产物全部加入到100yL的感受态细胞中轻轻混匀冰浴30min。 [0088] (3) 42 Γ热应激90s，置于冰盒中5min。
[0089] (4)加入800yL的LB培养基，37 Γ震荡培养2h。
[0090] (5)取100yL菌液无菌操作均匀涂布在事先配置好的LB(Amp/X-gal/IPTG)培养基 上，37 °C恒温培养12h以上。
[0091] (6)挑取白色菌落接种于2mL LB(Amp+)培养基中，37°C震荡摇菌后提取质粒并作 PCR鉴定。
[0092]质粒提取主要步骤为：离心待处理的菌液lmL，弃去上清，加入无色溶液RB(含 Rnase A)，吹打使细菌悬浮;加入蓝色溶液LB温和地上下翻转4-8次，使菌体充分裂解，溶液 变为透明的蓝色，最长裂解时间不能超过5min;加入黄色溶液NB，轻柔上下颠倒4-8次，形成 紧实的黄色凝集块，室温下静置2min;12000g离心5min，小心吸取上清加入吸附柱中， 12000g离心lmin，弃去流出液;加入650yL溶液WB，12000g离心lmin，弃去流出液；12000g离 心2min，彻底除去残留的WB;将离心柱置于干净的1.5mL的离心管中，在柱中央小心的加入 预热至55°C的30-50yL EB或去离子水（pH>7.0)，室温静置2min;12000g离心2min，洗脱 DNA，产物于-20°C保存。
[0093] 以提取出的质粒为模板进行PCR鉴定，体系与程序步骤与上述相同，将阳性克隆送 华大基因公司测序。
[0094] 5.GP5基因序列分析
[0095] 从GenBank中选取参考序列，其中包括美洲型代表株、欧洲型代表株采用DNAStar 生物学软件将测序结果与参考毒株基因序列进行分析。得到片段大小为835bp的GP5基因， 该基因与美洲代表株VR-2332同源性为88.4%~89.7%，而与欧洲型代表株LV同源性仅为 62.9% ~63.5%〇
[0096](二）乳酸菌重组表达质粒pNZ8149-dGP5的构建
[0097] 1.主要试验材料及分子生物学试剂
[0098] (1)菌种与质粒
[0099] 大肠杆菌DH5a及T-Vector pMD19(simple)均购自宝生物工程(大连)有限公司；乳 酸乳球菌表达载体PNZ8149及Lactococcus lactis NZ3900及Lactococcus lactis NZ3900 由爱尔兰科克大学惠赠。
[0100] (2)酶和试剂
[0101] 限制性内切酶NcoI和XbaI为TaKaRa公司产品；DNA Marker购自宝生物工程(大连） 有限公司;DNA胶回收试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，普通质粒小提试剂盒购自 北京全式金生物技术有限公司。
[0102] (3)培养基
[0103] M17培养基(无碳源）、LM17培养基、LM17恢复培养基、GSGM17培养基、Ellike培养 基。
[0104] ⑷自制试剂
[0105] 0.5mol/L EDTA(pH 8.0)、10%甘油。
[0106] 2.引物设计及合成
[0107]根据华大基因公司测序结果和SignalP 4.1服务器设计去除信号肽的GP5基因 (dGP5)表达引物dGP5-F/dGP5-R。其中dGP5-F引物中酶切位点为NcoI:序列CCATGG。dGP5-R 引物中酶切位点Xbal，序列：TCTAGA，dGP5-F/dGP5-R扩增片段用于乳酸乳球菌表面表达载 体PNZ8149的重组构建。引物由宝生物(大连)有限公司合成。
[0108] dGP5-F:5 ' CATGCCATGGGCAACAACAACAGCTCTCATATTCA 3'
[0109] dGP5~R：5；GCTCTAGACTAGAGACGACCCCATCGTTCC 3'
[0110] 3.dGP5基因的PCR扩增
[0111] (1)以PMD19-GP5阳性质粒为模板，用缺失信号肽的亚克隆引物dGP5-F/dGP5-R进 行PCR扩增，PCR反应条件为:94°C预变性4min; 94°C变性40s，60°C退火45s，72°C延伸50s，共 35个循环;72°C终延伸SmiruPCR反应体系同表1-2。扩增得到513bp的特异性条带，与预期目 的片段大小相符。结果如图2。
[0112] (2)PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定后进行胶回收纯化，纯化产物送华大基因 公司测序。对测序正确的PCR产物与载体T-Vector pMD19(simple)进行连接，该载体消除了 多克隆酶切位点，方便进行双酶切并准确获得目的片段。水浴16°C连接4h以上，并转化DH5a 感受态细胞，通过蓝白斑筛选，挑取白色单菌落扩大培养后提取质粒，将阳性质粒命名为 pMD19(simple)-dGP5，-2(TC 保存。
[0113] 4.pMD19-dGP5及乳酸乳球菌表面表达载体pNZ8149的双酶切
[0114] 按照普通质粒提取试剂盒操作说明进行提取操作，提取完毕后，用Ncol和Xbal双 酶切，pMD19(simple)-dGP5双酶切操作。乳酸乳球菌表面表达载体pNZ8149的双酶切体系同 表1-4。37°(：水浴6h。将pMD19(simple)-dGP5和乳酸乳球菌表面表达载体pNZ8149大量双酶 切的产物分别用1%的琼脂糖电泳后，再次进行胶回收操作，回收产物_20°C保存。酶切完毕 后取5yL酶切产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果。对提取的乳酸菌重组表达质粒进行 Ncol和Xbal双酶切，得到与预期结果一致的约513bp的片段（图3)。本发明的重组乳酸菌在 曲靖市千村农牧科技有限公司、云南农业职业技术学院生猪综合试验示范场等一些养殖单 位进行了赠送推广，效果十分显著。
[0115] 表l-4Nco I、Xba I双酶切反应体系
[0116]
[0117] 5.乳酸乳球菌NZ3900感受态的制备
[0118] 按照Mobitec公司的说明书提供的感受态制备方法进行操作：
[0119] (1)将-80°C保存的菌株接种到5mL的GSGM17中，30°C静置培养过夜。
[0120] (2)取5mL培养好的菌液转接到50mL GSGM17中，30°C静置培养过夜。
[0121] (3)将50mL菌液稀释到400mL GSGM17中。培养到0D600 = 0.2-0.3(大约31〇。4°(：离 心机离心，6000g 20min，弃上清收集沉淀。
[0122] (4)用400mL0.5M蔗糖，10%甘油（4°C)清洗细菌，然后离心（6000g)10min，弃上清 收集沉淀。
[0123] (5)细菌重悬于200mL 0.5M蔗糖，10%甘油，50mM EDTA(4°C)，重悬后的细菌置于 冰上15min，然后离心10min，弃上清收集沉淀。
[0124] (6)用100mL0.5M蔗糖，10%甘油（4°C)清洗细菌，然后离心(6000g)10min，弃上清 收集沉淀。
[0125] (7)细菌重悬于4mL 0.5M蔗糖，10%甘油(4°C)。
[0126] (8)每管100yL分装于1.5mL的无菌离心管中，置于-80°C保存。
[0127] 6.PRRSV dGP5基因乳酸乳球菌表达载体的构建及电转化
[0128] (1)将双酶切后回收的dGP5基因和pNZ8149载体进行连接，连接体系见表1-5，16°C 连接过夜。
[0129] 表1-5连接反应体系
[0132] (2)连接产物的纯化(采用乙醇沉淀法）：准备1.5mL的离心管，在反应液中加入1 /
[0130]
[0131] 10体积的3M CH3⑶ONa (pH5.2)和2.5倍体积的无水乙醇。-20 °C静置20min或-80 °C静置 lOmin。然后4°C离心10min，弃去上清，加入lmL的70%冷乙醇清洗沉淀，离心后弃去上清并 干燥2min，加入10yL ddH2〇溶解。
[0133] (3)连接产物电转化入乳酸菌NZ3900:从-80 °C冰箱中取出感受态细胞，置于冰上 溶解。溶解后轻轻加入1 〇yL的连接产物混匀，转入2mm预冷的电击杯中准备电击。电击参数： 电压2.5KV，电容25yF，电阻200Ω。电击时间5ms，电击后加入lmL预冷的LM17恢复培养基，将 菌液转移至1.5mL离心管中，冰上静置5min，30°C静置培养2h。取100yL菌液涂布于Ellike平 板，30°C静置培养24h，观察有无黄色菌落。结果在紫色的背景上可以看到黄色的单菌落，挑 取黄色单菌落进一步划线纯化。
[0134] 7.乳酸乳球菌质粒DNA的提取
[0135] 挑取黄色单菌落接种于5mL的LM17培养基中扩大培养，30°C静置培养24h后，采用 溶菌酶预处理乳酸乳球菌和普通质粒小题试剂盒相相结合的方法提取质粒DNA。取2mL培养 后的菌液，12000g离心5min，弃上清，收集菌体。取20mg/mL的溶菌酶250mL重悬菌体，37°C水 浴lh，期间多次上下颠倒样品。然后按照普通质粒小提试剂盒操作说明进行质粒提取。
[0136] 8.PRRSV dGP5乳酸乳球菌的表达载体的双酶切、PCR鉴定及序列测定
[0137] 将上述提取的质粒，用Ncol和Xbal双酶切，酶切体系同表1-4。
[0138] 轻轻混匀以上组分，37°C水浴4h。同时取2yL提取的质粒作为模板，用引物dGP5-F/ dGP5-R进行PCR鉴定，反应体系同表1-2 JCR程序为:94 °C预变性4min; 94 °C变性40s，60 °C退 火45s，72°C延伸50s，共35个循环;72°C终延伸8min。取5yL酶切产物及PCR产物进行1 %琼脂 糖凝胶电泳，鉴定酶切和PCR结果。鉴定为阳性的重组表达质粒送华大基因测序，测序正确 的质粒命名为pNZ8149-dGP5。
[0139] (三)重组质粒pNZ8149_dGP5在乳酸乳球菌中的表达鉴定
[0140] 1.主要试验材料及分子生物学试剂
[0141] (1)菌种与质粒
[0142] 重组质粒pNZ8149-dGP5由本人构建、乳链菌肽(Nisin)购自Sigma公司。
[0143] (2)主要材料与试剂
[0144] 蛋白Marker购自宝生物工程（大连）有限公司；PRRSV高免血清由本实验室制备， FITC标记的兔抗猪IgG购自广州华拓生物科技有限公司。
[0145] (3)培养基:诱导培养基
[0146] ⑷自制试剂
[0147] 吓了6(2411^/11^)、、？83缓冲液、30%丙烯酰胺混合液、1.5111〇1/11^8(?!18.8)、 1 · 0mo 1/L Tri s (pH6 · 8)、10 % SDS、10 % 过硫酸铵、电极缓冲液(pH8 · 3)、2 X SDS上样缓冲液、 考马斯亮蓝染色液、脱色液、转移缓冲液、1 〇 X丽春红染液。
[0148] 2.重组乳酸乳球菌的诱导表达
[0149] (1)将保存的pNZ8149-dGP5/NZ3900菌种和空载体菌种以1:100的比例，接种到诱 导培养基中培养，30 °C静置培养8-1 Oh，使其活化。
[0150] (2)将活化的细菌，再次以1:100接种到诱导培养基中，30°C静置培养到0D600 = 0.6〇
[0151] (3)采用终浓度5、15、20、25即/1^的附8丨1130°(：诱导611后终止培养，菌液置于4 1€ 保存，用于SDS-PAGE检验表达效果。
[0152] 3.表达产物的SDS-PAGE分析
[0153] (1)样品制备:取诱导后的菌液lmL，12000g离心3min，弃去上清并用200yL的roS缓 冲液清洗沉淀后，12000g再次离心3min并弃去上清。加入100yL 20mg/mL的溶菌酶，37°C水 浴lh，期间需多次轻轻颠倒。12000g离心3min，弃去上清，加入50yL的roS及等量的2 X SDS凝 胶上样缓冲液，轻轻吹打混勾后，沸水中煮沸l〇min，12000g离心lmin取上清。
[0154] (2)制胶:12 %分离胶的配制体系见表1-6，5 %浓缩胶的配制见表1-7。
[0155] 表1-6分离胶配制体系
[0156]
[0157] 混匀以上组分后沿玻璃板灌注凝胶，上层加入异丙醇封闭，室温聚合lh以上。[0158] 表1-7浓缩胶配制体系
[0159]
[0160]
[0161]弃去分离胶上层的异丙醇，并用ddH20多次冲洗后用吸水纸吸干残余水分。轻轻混 匀以上组分，灌入胶板，插入制胶的梳子，室温聚合lh以上。
[0162] (3)电泳:凝胶制备完成后，轻轻取下梳子，按照蛋白垂直电泳仪说明书组装好电 泳装置，加入足量的电泳缓冲液，加样孔加入10yL样品，120V恒压电泳至溴酚蓝接近底边1-2cm时停止。
[0163] (4)染色脱色：用考马斯亮蓝R250染色液在水平摇床上染色2h，然后凝胶用脱色液 浸泡后放入水平摇床脱色，脱色期间多次更换脱色液至背景清晰为止。
[0164] 分别以终浓度5、15、20、25ng/mL的 Ni sin 对 pNZ8149-dGP5/NZ3900进行诱导表达， 发现pNZ8149-dGP5/NZ3900在19kDa左右处有特异性蛋白表达（图4)。
[0165] 4.表达产物的IFA检测
[0166] (1)取诱导后的 pNZ8149-dGP5/NZ3900 和 pNZ8149/NZ3900 各 1 mL 菌液，4°C12000g 离心3min，收集沉淀并弃去上清，使用PBS缓冲溶液对沉淀洗涤3次。
[0167] (2)向沉淀中加入1 mL 1:50倍稀释的猪抗PRRSV高免血清，悬浮混匀，37°C作用30 分钟，4°C 12000g离心3min离心收集沉淀，使用PBS缓冲溶液洗涤沉淀3次。
[0168] (3)向沉淀中加入1 mL 1:200倍稀释的FITC标记的羊抗猪荧光抗体，悬浮混匀，37 。(:避光作用30min，4°C12000g离心3min，收集沉淀，使用PBS缓冲溶液沉淀3次。
[0169] (4)菌体沉淀悬浮于300yLPBS缓冲溶液中，取适量涂在准备好的无荧光载玻片黑 色滤膜上，自然干燥，冷丙酮4°C固定30min，荧光显微镜观察。
[0170]重组菌在荧光显微镜下可以看到明显的绿色荧光（图5)，但是与本实验处理的菌 体数量相比呈现荧光的菌体数量偏少。空载体未出现绿色荧光，仅出现暗绿色的背景弱光。 表明重组表达的蛋白位于菌体表面，且具有反应原性。
【主权项】
1. 一段用于猪繁殖与呼吸综合征病毒重组乳酸菌表达的基因，其特征在于，该基因段 为猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组中的GP5基因。2. -对扩增猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因用的引物，从猪繁殖与呼吸综合征病毒 中提取总RNA为模版，用特异性引物GP5-F/GP5-R，RT-PCR方法扩增出其GP5基因，其特征在3. -对猪繁殖与呼吸综合征病毒分析用的酶切插入位点，其特征在于，其酶切插入位 点为Nco I和Xba I。4. 一对猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因克隆用的引物，其特征在于，该引物对为， dGPS-FWCATGCCATGGGCAACAACAACAGCTCTCATATTCA 37 dGP5-R ： 57 GCTCTAGACTAGAGACGACCCCATCGTTCC 37 〇5. -种猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因重组乳酸菌的构建方法，其特征在于，包括以 下步骤：（1)以从猪繁殖与呼吸综合征病料中提取的总RNA为模版，用引物GP5-F/GP5-R，RT-PCR方法扩增出GP5基因，并将其克隆至pMD19-T载体中，进行核苷酸序列分析;所述的引物： GPS-F^^ATGAGGTGGGCAACTGTT 37 ,GP5-R： 57 GTCATGTACCCGAAGGTGA 37 ； (2) 以上述克隆得到的质粒pMD 19-GP5为模版，用带有Nco I和Xba I酶切位点的一对扩 增缺失信号肽的GP5基因（dGP5)表达引物：dGP5-F/dGP5-R扩增dGP5基因，将其克隆至丁-Vector pMD19(simple)后测序，充分培养阳性重组菌，提取质粒pMD19(simple)_dGP5;所述 的弓 I 物：dGPSU7 CATGCCATGGGCAACAACAACAGCTCTCATATTCA 37 dGP5-R： 57 GCTCTAGACTAGAGACGACCCCATCGTTCC 3,； (3) 将上述提取得到的质粒pMD19(Simple)-dGP5用Nco I、Xba I双酶切后与用同种酶 双酶切的载体连接，乙醇沉淀法纯化浓缩连接产物，电转化感受态乳酸乳球菌NZ3900，所述 载体为PNZ8149; (4) 筛选阳性乳酸乳球菌，提取阳性乳酸菌中重组质粒酶切鉴定并对插入序列进行测 序。6. 根据权利要求5所述的的一种猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因重组乳酸菌的构建 的表达方法，其特征在于，将步骤4)筛选到的阳性克隆，经Nisin诱导后，采用SDS-PAGE进行 鉴定，可见约19kDa的融合蛋白，经Western blotting和IFA分析表明该蛋白具有与PRRSV克 隆抗体结合具有免疫反应性。
【文档编号】C12N15/40GK106086044SQ201610541306
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年7月11日
【发明人】张以芳, 马志亮, 杨洁, 周玉照, 张辰宇, 郑锦玲, 刘旭川
【申请人】云南农业大学