一种产酰基高丝氨酸内酯（ahl）菌株的可视化检测的方法及其应用
【专利摘要】本发明公开了一种产酰基高丝氨酸内酯(AHL)菌株的可视化检测的方法及其应用。本发明将含有响应AHL的诱导型启动子PahlI及下游绿色荧光蛋白报告基因gfp的pBQ9载体电击转化于产AHL的植物病原菌中，构建荧光标记的重组菌株，通过对产生群体感应的信号分子AHL的植物病原菌进行荧光标记，以可视化宿主植物上的病原菌，以提供一种产AHL菌株的可视化方法。实验表明，利用荧光显微镜可以清晰地观察到荧光标记的病原菌在植物叶片上的定殖位点，尤其是针对于活细胞的定位，具有灵敏、快速、直观的优点。
【专利说明】
一种产酰基高丝氨酸内酯(AHL)菌株的可视化检测的方法及 其应用
技术领域
[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及一种产酰基高丝氨酸内酯(AHL)菌株的可视 化检测的方法及其应用。
【背景技术】
[0002] 早在三十年前，人们发现微生物的细胞间可以相互作用与交流，并且能响应环境 中的多种化学物质，并把某类特殊的次级代谢物以细胞密度依赖的方式来调控基因表达的 这种现象称为群体感应(QS)。简单地说，微生物产生信号分子，随着细胞浓度的增加，当信 号分子达到一定浓度时，信号分子与微生物细胞表面或细胞内的受体结合，随后改变基因 表达。最为典型的群体感应是革兰氏阴性菌中由酰基高丝氨酸内酯类化合物(AHL)作为信 号分子介导的群体感应现象。群体感应作为微生物中一种基因表达的调控方式，在植物病 原菌中也普通存在，且参与植物致病菌多种生物学行为的调控，包括群聚移动、生物膜形 成、毒性因子如胞外多糖、抗生素、表面活性剂等合成，这些被调控的生物学功能均影响着 植物宿主与植物病原菌的相互作用过程与结果。
[0003] 对于植物病原菌在宿主植物上的定位研究，例如生态分布，常采用的方法有荧光 原位杂交(FISH)，它利用荧光探针杂交定位特异核苷酸序列一种技术，存在探针设计及其 是否灵敏等问题。
【发明内容】
[0004] 本发明的一个目的是提供报告基因和驱动所述报告基因表达的酰基高丝氨酸内 酯诱导型启动子的新用途。
[0005] 本发明提供了报告基因和驱动所述报告基因表达的酰基高丝氨酸内酯诱导型启 动子在检测产酰基高丝氨酸内酯的菌株在植物叶片定殖中的应用。
[0006] 本发明还提供了报告基因和驱动所述报告基因表达的酰基高丝氨酸内酯诱导型 启动子在产酰基高丝氨酸内酯的菌株的可视化检测中的应用。
[0007] 本发明的另一个目的是提供含有报告基因和驱动所述报告基因表达的酰基高丝 氨酸内酯诱导型启动子的表达盒或含有报告基因和驱动所述报告基因表达的酰基高丝氨 酸内酯诱导型启动子的重组载体的新用途。
[0008] 本发明提供了含有报告基因和驱动所述报告基因表达的酰基高丝氨酸内酯诱导 型启动子的表达盒或含有报告基因和驱动所述报告基因表达的酰基高丝氨酸内酯诱导型 启动子的重组载体在检测产酰基高丝氨酸内酯的菌株在植物叶片定殖中的应用。
[0009] 本发明还提供了含有报告基因和驱动所述报告基因表达的酰基高丝氨酸内酯诱 导型启动子的表达盒或含有报告基因和驱动所述报告基因表达的酰基高丝氨酸内酯诱导 型启动子的重组载体在产酰基高丝氨酸内酯的菌株的可视化检测中的应用。
[0010] 上述应用中，
[0011]所述酰基高丝氨酸内酯诱导型启动子的核苷酸序列为序列1的第1-353位。
[0012] 上述应用中，
[0013]所述报告基因为荧光蛋白编码基因。
[0014] 上述应用中，
[0015]所述荧光蛋白编码基因具体为gfp基因；其核苷酸序列为序列1的第407-1123位。 [0016] 上述应用中，
[0017]所述重组载体具体为pBQ9载体。
[0018] 上述应用中，
[0019]所述产酰基高丝氨酸内酯的菌株为丁香假单胞菌烟草致病变种P.syringae pv.tabaci 11528〇
[0020] 本发明还有一个目的是提供一种检测产酰基高丝氨酸内酯的菌株在植物叶片上 定殖的方法。
[0021] 本发明提供的检测产酰基高丝氨酸内酯的菌株在植物叶片上定殖的方法包括如 下步骤：
[0022] 1)将报告基因和驱动所述报告基因表达的酰基高丝氨酸内酯诱导型启动子导入 产酰基高丝氨酸内酯的菌株中，得到重组菌；
[0023] 2)将所述重组菌或其菌液施加在植物叶片上，通过荧光检测报告基因的表达，实 现产酰基高丝氨酸内酯的菌株在植物叶片上定殖检测。
[0024]上述方法中，
[0025]所述报告基因和驱动所述报告基因表达的酰基高丝氨酸内酯诱导型启动子通过 重组载体导入产酰基高丝氨酸内酯的菌株中。
[0026]上述方法中，
[0027]所述酰基高丝氨酸内酯诱导型启动子的核苷酸序列为序列1的第1-353位。
[0028]上述方法中，
[0029] 所述报告基因为荧光蛋白编码基因。
[0030] 上述方法中，
[0031] 所述荧光蛋白编码基因具体为gfp基因；其核苷酸序列为序列1的第407-1123位。 [0032]上述方法中，
[0033]所述重组载体具体为pBQ9载体。
[0034]上述方法中，
[0035]所述通过荧光检测报告基因的表达的方法为利用激光荧光共聚焦显微镜直接对 叶片进行检测。
[0036]上述方法中，
[0037]所述产酰基高丝氨酸内酯的菌株为丁香假单胞菌烟草致病变种P.syringae pv.tabaci 11528〇
[0038]本发明的最后一个目的是提供一种重组菌。
[0039]本发明提供的重组菌为上述重组菌。
[0040]本发明将含有响应AHL的诱导型启动子?^:及下游绿色荧光蛋白报告基因 gfp的 PBQ9载体电击转化于产AHL的植物病原菌中，构建荧光标记的重组菌株，通过对产生群体感 应的信号分子AHL的植物病原菌进行荧光标记，以可视化宿主植物上的病原菌，以提供一种 产AHL菌株的可视化方法。实验表明，利用荧光显微镜，可以清晰地观察到荧光标记的病原 菌在植物叶片上的定殖位点，尤其是针对于活细胞的定位，具有灵敏、快速、直观的优点。
【附图说明】
[0041]图1为绿色荧光标记Pta的观察。图1A为紫外光下电击转化后的平板；图1B为重组 菌株Pta/pBQ9菌液与对照Pta菌液的培养液；图1C为重组菌株Pta/pBQ9菌液的荧光显微观 察。
[0042]图2为绿色荧光标记Pta定殖于烟草叶片上的蜜腺中。
【具体实施方式】
[0043] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0044] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0045] 下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
[0046]下述实施例中的LB液体培养基（1L)配方:胰蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，蒸馏 水定容至l〇〇〇mL，调pH 7.2; LB固体培养基:LB液体培养基加入终浓度1.5% (W/V)的琼脂。 [0047]下述实施例中的KB液体培养基（1L)配方：蛋白胨20g，K2HP〇4 1 .5g， MgS〇4.7H201.5g，甘油10ml，蒸馏水定容至1000mL，调pH 7.2;KB固体培养基:KB液体培养基 加入终浓度1.5 % (W/V)的琼脂。
[0048] 下述实施例中的丁香假单胞菌烟草致病变种P.syringae pv.tabaci 11528(Pta) 购买于美国菌种保藏中心(ATCC)，ATCC编号为11528。
[0049] 下述实施例中的pBQ9载体和pPROBE-OT载体均在文献"Quifi〇nes,B·，Pujol， C.J.and Lindow,S.E.(2004)Regulation of AHL production and its contribution to epiphytic fitness in Pseudomonas syringae.Mol.Plant-Microbe Interact.17,521-531. "中公开过，公众可从中国科学研究院环境生态研究中心获得。
[0050] 实施例1、荧光标记的丁香假单胞菌烟草致病变种的重组菌株Pta/pBQ9的制备及 其荧光观察
[0051] -、pBQ9 载体
[0052] pBQ9载体为含有绿色荧光蛋白报告基因和驱动其表达的诱导型启动子?此11的载 体。具体是以pPROBE-OT载体为骨架载体，将诱导型启动子Pahii插入至pPROBE-OT载体中的 绿色荧光蛋白报告基因 gf P的上游，且保持pPROBE-OT载体的其他序列不变得到的载体。其 中，诱导型启动是响应酰基高丝氨酸内酯(AHL)的启动子，且启动下游绿色荧光蛋白 报告基因的表达，含有诱导型启动子P ahn和位于其下游的绿色荧光蛋白报告基因 gfp的片 段的核苷酸序列为序列1，其中，序列1的第1-353位为诱导型启动子PahlI的核苷酸序列，序 列1的第407-1123位为绿色荧光蛋白报告基因 gfp的核苷酸序列。
[0053] 二、重组菌株Pta/pBQ9的制备
[0054] 1、丁香假单胞菌烟草致病变种P.syringae pv.tabaci 11528(Pta)感受态细胞的 制备
[0055] (1)活化 Pta
[0056] 将丁香假单胞菌烟草致病变种P.syringae pv.tabaci 11528(Pta)菌种(该菌表 达AHL)接种5ml KB液体培养基中，30 °C过夜振荡培养，得到Pta培养液;取Pta培养液于KB平 板划线，置于30°C过夜倒置培养。
[0057] (2)培养 Pta
[0058] 挑取单菌落于10ml KB液体培养基中，30°C振荡过夜培养，再转接于100ml KB液体 培养基中，30 °C振荡培养至对数期(0D_ = 0.6-0.7)。
[0059] (3)收集Pta细胞
[0060]将步骤(2)获得的培养液低温离心，离心条件为4°C，5，OOOrpm，15min，弃上清收集 细胞。
[0061] (4)水洗Pta细胞
[0062] 用预冷的无菌水轻柔重悬步骤（3)获得的细胞，低温离心，离心条件为4°C，5， OOOrpm，15min，弃上清。重复操作一次。
[0063] (5)甘油洗Pta细胞
[0064]用预冷的10%甘油轻柔重悬步骤(4)获得的细胞，低温离心，离心条件为4°C，5， OOOrpm，15min，弃上清。重复操作两次。
[0065] (6)分装感受态细胞
[0066] 用200yL预冷的10%甘油轻柔重悬，取50yL分装于1.5mL无菌离心管中，得到Pta感 受态细胞，于_80°C保存备用。
[0067] 2、重组菌株Pta/pBQ9的获得
[0068]将步骤一中的pBQ9载体电击转化步骤1得到的Pta感受态细胞中，得到重组菌株 Pta/pBQ9。具体步骤如下：
[0069] (1)取lyL pBQ9载体于50yL的Pta感受态细胞中，轻柔混匀，冰上放置30min，得到 混合液。
[0070] (2)取步骤(1)获得的混合液于电击转化杯(Bio-Rad)中，轻敲杯底排除气泡，在电 击转化仪(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)模式2条件下进行电击转化。
[0071] (3)立即往电击杯中加入lmL KB液体培养基，混匀，移至1.5mL的离心管中，30 °C， 200r/min离心，培养3h。
[0072] (4)离心菌液，弃900yL上清，其余混匀涂布于含有壮观霉素 SpcYSOμg/ml) (Solarbio)的KB固体培养基上，30°C倒置培养，得到重组菌株Pta/pBQ9。
[0073]将pBQ9载体替换为pPROBE-OT载体，其他步骤不变，得到对照重组菌株Pta/ pPR0BE-0T〇
[0074]待平板上长出单菌落，将平板于紫外灯下观察，结果如图1所示。图1A为紫外光下 电击转化后的平板。从图中可以看出，重组菌株Pta/pBQ9的平板上出现绿色荧光的单菌落， 而对照重组菌株Pta/pPR0BE-0T平板菌落未出现绿色荧光。
[0075] (5)挑取绿色荧光的单菌落进行？0时广增验证（？^验证的引物为6??-1:5'-ATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCAC-3 ' ；GFP-2:5 '-CTATTTGTATAGTTCATCCATGCC-3 '），PCR扩增得 到大小为717bp的即为阳性菌落。取阳性菌落接种于含有壮观霉素 SpcXSOyg/mDKB液体培 养基中30°(：，1211，20(^/1^11扩大培养，即得到重组菌株?丨&/?809菌液。挑取对照重组菌株 Pta/pPR0BE-0T的单菌落进行PCR验证，未扩增到大小为717bp的条带，按照上述方法，将对 照菌株Pta/pPROBE-OT的单菌落进行扩大培养，得到对照重组菌株Pta/pPROBE-OT菌液。 [0076] 将重组菌株Pta/pBQ9菌液与对照重组菌株Pta/pPROBE-OT菌液的培养液于紫外灯 下观察，结果如图1B所示。从图中可以看出重组菌株Pta/pBQ9菌液呈现绿色荧光，而对照重 组菌株Pta/pPROBE-OT菌液没有荧光。
[0077] 3、重组菌株Pta/pBQ9菌液的荧光显微镜观察
[0078] (1)接种重组菌株Pta/pBQ9菌液于含有壮观霉素 SpcXSOμg/ml)的KB液体培养基 中，30°C，12h，200r/min培养至稳定期(0D_ = 2)。
[0079] (2)取步骤（1)获得的培养液5yL于荧光免疫载玻片上，盖上盖玻片，正置荧光显微 镜（Imager A2，Zeiss)观察。GFP激发光波长设置为488nm，发射光探测波长为510nm。重组菌 株Pta/pBQ9菌液的荧光显微观察结果如图1C所示。从图中可以看出：重组菌Pta/pBQ9呈现 绿色荧光，表明已经成功地将Pta进行了绿色荧光标记。
[0080]实施例2、Pta在烟草叶片上的定殖检测方法
[00811 1、将实施例1的步骤二中获得的重组菌株Pta/pBQ9菌液接种于含有壮观霉素 Spd (50μg/ml )KB液体培养基中，30 °C，12h，200r/min培养至对数期(0D6qq = 0 · 6-0 · 7)。
[0082] 2、用磷酸缓冲盐溶液(PBS)(Solarbio)稀释步骤1获得的培养液至其菌液浓度为 106CFU/mL，得到重组菌株Pta/pBQ9菌液;将重组菌株Pta/pBQ9菌液喷施于烟草(普通烟草） 叶片上，待烟草叶面自然晾干后，放置于30°C，80%相对湿度的温室中培养，得到侵染后的 烟草。
[0083] 3、侵染三天后，使用无菌的打孔器(直径= 10mm)采取侵染后的烟草叶片（10mm2)， 置于涂有封片剂Aqua_Poly/Mount(Polysciences)的无焚光载玻片上，轻压盖上涂有封片 剂的盖玻片，置于暗处l〇min。
[0084] 4、利用倒置激光荧光共聚焦显微镜CLSM(LSM 780，Carl Zeiss)观察荧光标记的 丁香假单胞菌烟草致病变种P.syringae pv.tabaci 11528(?丨&)在烟草叶片上分布。6?卩激 发光波长设置为488nm，发射光探测波长为490-553nm。叶片的叶绿素的激发光波长设置为 561nm，发射光探测波长为600-728nm。
[0085] 结果如图2所示，从图2中可以看出，荧光标记的丁香假单胞菌烟草致病变种 P.syringae pv. tabaci 11528(Pta)定殖于烟草叶片的蜜腺中，利用本发明的方法可以清 晰地观察到焚光标记的丁香假单胞菌烟草致病变种P. syringae pv. tabaci 11528(Pta)在 植物叶片上的定殖位点。
【主权项】
1. 报告基因和驱动所述报告基因表达的酰基高丝氨酸内酯诱导型启动子在检测产酰 基尚丝氣酸内酯的菌株在植物叶片定殖中的应用； 或，报告基因和驱动所述报告基因表达的酰基高丝氨酸内酯诱导型启动子在产酰基高 丝氨酸内酯的菌株的可视化检测中的应用。2. 含有报告基因和驱动所述报告基因表达的酰基高丝氨酸内酯诱导型启动子的表达 盒或含有报告基因和驱动所述报告基因表达的酰基高丝氨酸内酯诱导型启动子的重组载 体在检测产酰基高丝氨酸内酯的菌株在植物叶片定殖中的应用； 或，含有报告基因和驱动所述报告基因表达的酰基高丝氨酸内酯诱导型启动子的表达 盒或含有报告基因和驱动所述报告基因表达的酰基高丝氨酸内酯诱导型启动子的重组载 体在产酰基高丝氨酸内酯的菌株的可视化检测中的应用。3. 根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于： 所述酰基高丝氨酸内酯诱导型启动子的核苷酸序列为序列1的第1-353位； 和/或，所述报告基因为荧光蛋白编码基因； 和/或，所述荧光蛋白编码基因具体为gfp基因； 和/或，所述重组载体具体为PBQ9载体。4. 根据权利要求1-3中任一所述的应用，其特征在于： 所述产酰基高丝氨酸内酯的菌株为丁香假单胞菌烟草致病变种P.syringae pv.tabaci 11528。5. -种检测产酰基高丝氨酸内酯的菌株在植物叶片上定殖的方法，包括如下步骤： 1) 将报告基因和驱动所述报告基因表达的酰基高丝氨酸内酯诱导型启动子导入产酰 基高丝氨酸内酯的菌株中，得到重组菌； 2) 将所述重组菌或其菌液施加在植物叶片上，通过荧光检测报告基因的表达，实现产 酰基高丝氨酸内酯的菌株在植物叶片上定殖检测。6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于:所述报告基因和驱动所述报告基因表达的 酰基高丝氨酸内酯诱导型启动子通过重组载体导入产酰基高丝氨酸内酯的菌株中。7. 根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于： 所述酰基高丝氨酸内酯诱导型启动子的核苷酸序列为序列1的第1-353位； 和/或，所述报告基因为荧光蛋白编码基因； 和/或，所述荧光蛋白编码基因具体为gfp基因； 和/或，所述重组载体具体为PBQ9载体。8. 根据权利要求5-7中任一所述的方法，其特征在于： 所述产酰基高丝氨酸内酯的菌株为丁香假单胞菌烟草致病变种P.syringae pv.tabaci 11528〇9. 一种重组菌，为权利要求5-8中所述的重组菌。
【文档编号】G01N21/64GK106086057SQ201610459685
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月22日
【发明人】庄国强, 程菲菲, 马安周
【申请人】中国科学院生态环境研究中心