聚酮合酶基因启动子PBbpksp的用图
【专利摘要】本发明属于微生物技术领域，具体涉及聚酮合酶基因启动子PBbpksp的用途。本发明要解决的技术问题是为虫生真菌的利用提供一种新选择。本发明的技术方案是聚酮合酶基因启动子PBbpksp在调控虫生真菌产孢中的用途。该启动子具有重要的应用价值，可调节特定基因在球孢白僵菌产孢阶段或产孢结构中的表达，从而有效的控制球孢白僵菌的产孢或孢子特性。该启动子为通过分子生物学手段改良和利用虫生真菌提供了一种新选择。
【专利说明】
聚酮合酶基因启动子PBbpksp的用途
技术领域
[0001] 本发明属于微生物技术领域，具体涉及聚酮合酶基因启动子Ppksp的用途。
【背景技术】
[0002] 昆虫病原真菌是控制自然界害虫的主要因素之一(Charnley，1997)，具有种类繁 多、生长迅速、能侵染宿主的不同发育阶段等特点，已成为生物农药中的重要组成部分(李 增智，1997)。虫生真菌还具有对环境友好、宿主不易产生抗性等优点，已被开发成生物杀虫 剂，广泛应用在农林害虫及城市卫生昆虫的防治上。分生孢子是真菌杀虫剂的有效成份，其 通过附着宿主体壁、萌发后穿透宿主体壁开始侵染过程，完成后又在僵虫体表大量产生，开 始下一轮侵染过程。真菌致死昆虫后一般能在其体外大量产孢，引起扩散，在适宜时形成流 行病，并与其它各种天敌和许多杀虫剂相容。真菌杀虫剂已在我国和欧美国家得到广泛的 应用（冯明光，1998)，迄今为止，已有50多种登记注册的产品，包括球孢白僵菌(Beauveria bassiana)、金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae)、玫烟色拟青霉（Paeci lomyces fumosoroseus)和錯蚁轮枝菌(Verticillium lecanii)在内的十多种真菌。最近，昆虫病原 真菌，特别是经过基因工程改良后的菌株，在城市卫生害虫如蚊子、苍蝇、蟑螂及入侵害虫 火蚁的防治中展示了巨大的潜力，显示出昆虫病原真菌在生防领域具有广阔的应用前景 (Wang et al.，2007;Fan et al.，2012a，2012b;Fang et al. ,2011)。因此，利用基因工程 调控虫生真菌的孢子发育对于虫生真菌的推广应用及环境安全等具有重要意义。但总体说 来，由于昆虫病原真菌在应用过程中存在防效不稳定及击倒害虫的时间过程等问题，因此 真菌杀虫剂在农药市场，以及生物农药市场所占份额还较低。
[0003]在昆虫病原微生物中，真菌的侵染机制比较特别，它不必被宿主吞食而直接通过 外骨骼或表皮侵入寄主。其侵染过程分为以下几步:分生孢子附着在昆虫体壁并萌发，形成 侵染结构(如附着胞）；菌丝穿过昆虫体壁，在虫体内生长并致病昆虫;最终真菌以死亡的虫 体为营养源，大量产生分生孢子，孢子扩散后感染其它昆虫，开始其另一轮的侵染过程 (Chanley，2003)。在此过程中，孢子是侵染的起始，也是一轮侵染完成的终点，其产量、活力 及抗逆能力直接决定了真菌生防制剂的防治效果及市场地位。利用基因工程对昆虫病原真 菌的孢子进行改良，提高其田间应用时对紫外、高温等不利条件的耐受性，或提高孢子产 量，对于昆虫病原真菌的应用具有重要价值。现有的研究显示，转基因工程中启动子的选择 是决定成败的关键。长期以来，在昆虫病原真菌的转基因研究中均是以组成性启动子为主。 但组成性启动子在非靶标位置及时间表达，往往会消耗生物体能量，甚至对生物体的生长 造成不利影响。因此，为了利用基因工程调控昆虫病原真菌的产孢及孢子特性，急需有产孢 阶段或产孢结构中特异表达的启动子。但迄今为止，还没有昆虫病原真菌产孢特异阶段或 特异结构相关启动子的报道。
【发明内容】
[0004]本发明要解决的技术问题是为虫生真菌的利用提供一种新选择。
[0005] 本发明的技术方案是聚酮合酶基因启动子PBbpksp在虫生真菌中的用途。
[0006] 具体的，所述的用途为在调控虫生真菌产孢或提高虫生真菌孢子抗性中的用途。
[0007] 具体的，所述的聚酮合酶基因启动子PBbpksp来自于球孢白僵菌。
[0008] 具体的，所述的虫生真菌为绿僵菌或球孢白僵菌。
[0009] 具体的，所述的聚酮合酶基因启动子PBbpksp具有如SEQ ID No. 1所示的核苷酸序 列。SEQIDN0 · lPBbpksP启动子序列（1108bp)
[0010] GCTCAGGAATCTCGGGTAAAAAGACCGGCCCTTCTTCAGCCCCTGTATTGCGGTAGCTATCGCGGGAGC TATCTCGGTAGCAACACACTTAATGCAGGAGCTATGACACTATTGAATGATGACTCGCGTTGGATCAAGCTCGAGAC TGGTTTCGCATGCCGCTCGGAGCCAAACCCCTGGGGATTGCTACTGAGCGCATGCTCCGCGAAACTTTGTCAATATT CTCTCAGTGACATAGAGTAGAAAAGGTTATGAGAGAGTGGGTATGTGTATTTCGTTTAGCGTTACAGGTTTCTACAC AATTGTTTGATGGGAAACTCCATGAGAGCTGAGGATGTTACAGATTGTATTGAGCGCCGTTTAGAAGGTTCCGTTCC GGCCTTGCATAGTCTCCCGAGACATAGCTACTGTTCGACTAGTATAAATTATTGCAGGGGAGTTTCTATAATGATCG CTCCTCGTTCCTTTTCTGATTTGCAGATGTTTATATACAGATATCAGTACAGCCATATCAACCATGTAGTGCTGAGA ATGCCACTTATGCTTTCTCCCGTGTAATCAATTGCCATGTATACCGTTCTAAAGATATAATCATGACTGCTCTGATG CAGAAGATTTGAGTTATTGTGCAAGTCTGTTCAGAATCTCTGACAAATAACTCGGACATTTGTTGTCGATAGATGGT GGAGACGGCCTGAATTAGAAATAATTGGACCATAACAACATAGGAGCTATTGAATGCTAAGTCAGGCGTTTCTGGGG TTGATACGGAGCCGAGATCTGCGCTAACGAGTCAAGTCAAGCAGAGTCATAACCTCCCGGCGCCTGATTATCAGGTC TTCCCGGTTGGTTTTGGGCGGAAAGAGCGCACGGTTTCTTGGCGGGCTATAACGACTAGATGACATTTATAGATTGC TCAGCTTCACGTGGGAATCGGTACGTTGAGACTGACCGTCTCATTCAGGTCAAGTATATAAGAATGGCATTATCTGC CTGTCTTCGGCCACACCTTTTACCATTACATACGCCAATCTACTTTTCTCAACGAGCTTCATACTTTTTGATAACAA GTCATAACTTTCAAACAAAAATAGCACAAGCAGCAACC
[0011] 本发明的有益效果:PBbpksP启动子具有良好的特异性，仅在产孢期间的产孢结构 中特异表达。该启动子具有重要的应用价值，可调节特定基因在球孢白僵菌产孢阶段或产 孢结构中的表达，从而有效的控制球孢白僵菌的产孢或孢子特性。该启动子为通过分子生 物学手段改良和利用虫生真菌提供了一种新选择。可利用其调节相关基因在孢子中的表 达，改良孢子对不良环境的耐受性、产孢量等。
【附图说明】
[0012]图1实时定量PCR检测BbpksP在球孢白僵菌不同发育阶段的表达情况。PDB(3d)，马 铃薯液体培养基中培养3天;PDA(X)，马铃薯固体培养基中培养3，5，10天。纵坐标表示基因 BbpksP的表达量。
[0013] 图2 pPk2-SUR-PpksP: :eGFP图谱。PBbpksP，球孢白僵菌BbpksP的启动子;eGFP，绿 色荧光蛋白基因；TtrpC，构巢曲霉的色氨酸终止子。
[0014] 图3 PDB培养基中芽孢子、菌丝荧光观察。Bb0062，PgpdA: :eGFP，PBbpksP: :eGFP分 别表示球孢白僵菌野生型菌株、组成性启动子PgpdA引导GFP表达的菌株及BbpksP启动子 引导GFP表达的菌株。blastspore，表示球孢白僵菌芽孢子;hyphae表示真菌菌丝。图中所示 为各菌株在马铃薯培养基中培养3天后产生的芽孢子及菌丝荧光观察。
[0015] 图4侵染大蜡螟（Galleria mellonella)时虫菌体荧光观察。Bb0062，PgpdA:: eGFP，BbpksP: : eGFP分别表示球孢白僵菌野生型菌株、组成型启动子PgpdA引导GFP表达菌 株及BbpksP启动子引导GFP表达菌株。图中所示为各菌株侵染大蜡螟4天后产生的虫菌体荧 光观察。
[0016] 图5 PDA培养基中分生孢子、产孢结构、菌丝荧光观察。Brightfield表示明视野， Fluorenscence表示GFP焚光信号，Merge表示明视野与GFP信号的融合。Bb0062_4d表示野生 型菌株培养4天后的产孢结构及孢子;PgpdA ::eGFP-4d表示组成型启动子PgpdA引导GFP表 达菌株培养4天后的观察;PBbpksP: : eGFP-2d，3d，4d，5d分别表示BbpksP启动子引导GFP表 达菌株培养2天，3天，4天，5天后的荧光观察。
【具体实施方式】
[0017] 下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细说明。
[0018] 实施例1球孢白僵菌中PBbpksP启动子的表达模式测定
[0019] BbpksP是一个来自球孢白僵菌的聚酮合成酶基因。为分析其启动子的活性特点， 接种野生型球孢白僵菌于马铃薯培养基(液体培养基PDB，固体培养基PDA)，提取不同时间 点的RNA，反转录为cDNA(TaKaRa，PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser)，利用 Real-time PCR测定BbpksP基因的表达模式。RT引物对为？1:5'-6六660六1'(：1^6〇：1^6八6-3'，P2:5'-AGTCAAACATCTTGGACGGC-3'oRT-PCR 反应体系：5.0yL Universal SYBR Green Supermix(Bi〇-RAD)，4.0yL cDNA，0.5yL Pl，0.5yL P2,总体积lOyl^RT-PCR反应参数：95°C (3111；[11);40循环：95°0（1086(3)，56°0（2086(3)，72°0（2086(3)。球孢白僵菌的&(31:;[11为内标基 因，引物序列为Pact-1 :GTCAAGTCATCACCATTGGC和Pact-2:GAGGAGCAATGATCTTGACC。通常情 况下，在Η)Α培养基上，野生型球孢白僵菌一般在3d时开始形成产孢结构，之后从3d到10d产 孢量持续上升。RT-PCR结果显示（图1)，在PDB中培养时BbpksP基因不表达，但在PDA上培养 3d时（刚开始产生分生孢子）少量表达，而在5d、10d表达水平显著提高。这表明，PBbpksP启 动子是产孢期间启动表达的特异性启动子。
[0020] 实施例2PBbpksP: :eGFP菌株的获得 [0021] l.PBbpskP启动子的克隆及载体构建
[0022]人工合成引物对P3/P4(P3 : 5 '-GCTCAGGAATCTCGGGTAA-3 ' ； P4 : 5 '-GGTTGCTGCTTGTGCTAT-3 '），利用野生型球孢白僵菌基因组DNA扩增BbpksP启动子片段。扩 增体系为：l〇XPhusion Taq PCR Buffer(含Mg2+)2.5yL，10mmol/L dNTP 2yL，10ymol/L引 物(？3/?4)各叫1^，基因组0嫩模板以1^(101^/^)，51]/^?11118丨〇11聚合酶0.2以1^，加水至2541^ 体系。卩〇?反应参数：98°(：(211^11) ;30循环：981€(1086。），561€(1586。），72°(：(3086。） ；721€ (3min)。将获得的PBbpksP启动子片段(约1 · lkb)克隆进pEasy-Blunt载体(TransGen)，经测 序验证获得正确的 pEasy-Blunt-PBbpksP。以 3|*P5/P6(P5:5'_ GCGGCCGCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG;P6:5'-AAGCTTAGGATTACCTCTAA ACA AGTG)，WpK2-BarGFP(Zhang et al.，2010)为模版，PCR扩增eGFP-TtrpC。扩增体系为：10XPhusion Taq PCR Buffer(含Mg2+)2.5yL，10mmol/L dNTP 2yL，10ymol/L引物(P3/P4)各lyL，基因组DNA模 板lyL( 10ng/yL)，5U/yL Phusion聚合酶0· 2yL，加水至25yL体系。PCR反应参数：98°C (211^11);30循环：981€(1〇86。），56。(：（1586。），72。(：（5〇86。） ；72。(：（311^11)。将获得的66卩？-TtrpC片段克隆进pEasy-Blunt载体（TransGen)，经测序验证获得正确的pEasy-Blunt-eGFP-TtrpC。以Xbal与Notl酶切质粒pEasy-Blunt-PBbpksP，获得PBbpksP片段；以Notl与 HindIΠ 酶切的pEasy-Blunt-eGFP-TtrpC质粒，获得eGFP-Ttrpc片段，用XbaI与HindIΠ 酶切 pk2-SUR-Ttrpc质粒（将SUR抗性基因 （Zhang et al. ,2010)代替pK2-BarGFP上的BarGFP (Zhang et al. ,2010)，获得pK2-SUR-TtrpC)，获得线性化载体，以T4DNA连接酶连接这三个 片段（约为 14kb)，获得pk2-SUR-PBbpksP: :eGFP-Ttrpc重组载体（图2)。将口1^2-51]1?-PBbpksP: : eGFP-Ttrpc质粒用电击转化的方法转入农杆菌AGL-1中。
[0023] 2.真菌的遗传转化与筛选
[0024]以野生型球孢白僵菌为转化受体，参照Fang等人的方法(Fang et al，2004)，利用 根癌农杆菌介导的遗传转化法进行转化，所用培养基及具体转化方法如下：
[0025]转化过程中所用的培养基：
[0026]頂固体培养基：（400mL 2.5XMM盐溶液/L，5mL甘油/L，MES 8.5g/L，琼脂粉 15g/L， 使用前加入200ymol/L乙酰丁香酮和5mmol/L葡萄糖）
[0027] IM液体培养基：（400mL 2.5XMM盐溶液/L，5mL甘油/L，MES 8.5g/L，使用前加入 200ymol/L乙酰丁香酮和10mm〇l/L过滤灭菌的葡萄糖，避光保存）
[0028] CZM培养基（1L) :30g/L;NaN〇3,2g/L;MgS〇4 · 7H2〇,0.5g/L;K2HP〇4，lg/L;FeS〇4 · 7H20，0 · 001g/L ;KC1，0 · 5g/L;调pH至7 · 0。琼脂粉，15g/L; 121°C 高温灭菌 15min。
[0029] 将含有质粒载体的根癌农杆菌单菌落接种到YEB液体培养基中（含50yg/mL羧苄青 霉素和50yg/mL卡那霉素），28°C、200rpm摇床过夜培养（16~20h)。取3mL菌液6000rpm、 lOmin离心，弃上清液，用等量的頂液体培养基(含有200μΜ乙酰丁香酮和10mM Glucose)重 悬菌体，并调整浓度至0D660为0.15，然后于28°C，180rpm摇床培养6h。在此期间先将微孔滤 膜(半岛，上海)平铺于頂固体培养基上，用了《的11-80(0.5^^八)配制浓度为2\10 4个/1111的 孢悬液。将上述孢悬液和预培养后的农杆菌菌液等体积混均后，取1〇〇μ1菌液涂布于頂固体 培养基平板上的微孔滤膜上，22°C共培养48h。将共培养之后的微孔滤膜转至一筛培养基 CZM+60μg/ml氯嘧磺隆上继续筛选，26°C培养大约5d直到有抗性菌落出现。将上述阳性菌落 进行PCR验证。转化子robpksP: : eGFP菌株能扩增出大约1.9kb片段。PCR扩增体系：10 X Ex Taq PCR Buffer(含Mg2+)2yL，5mmol/l dNTP 2yL，引物P3(PBbpksP上游引物）lyL，引物 Pgfp-2(eGFP下游：TTACTTGTACAGCTCGTCCA)lyL，DNA模板lyL(50ng)，Ex Taq DNA聚合酶5U/ yL 0.2yL，加水至20yL体系。扩增的程序：94°C预变性5min，94°C30s，56°C30s，72°C3min循 环 32 次，72°C 延伸 10min。
[0030] 3.PBbpksP启动子表达模式研究
[0031] 接种robpksP: : eGFP菌株在PDB培养基中，在多个生长时间点（2d、3d、4d、5d)进行 荧光观察以研究PBbpksP基因的表达模式。观察结果显示，PBbpksP: :eGFP菌株在培养基 中的菌丝和芽孢子没有GFP信号（图3)。球孢白僵菌侵染宿主过程中，会形成酵母样的虫菌 体。？8匕?1^? ::66??在虫菌体中也没有表达（图4)。？匕3::66??为组成型启动子?8?(^与66卩？ 的融合基因。在CZM固定培养基中产孢结构形成之前不表达eGFP，但在产孢过程中，在未成 熟的孢子与产孢结构中eGFP表达量较高（图5)，在成熟的孢子中表达量较低或者基本不表 达。该研究结果表明，PBbpksP启动子具有良好的特异性，仅在产孢期间的产孢结构中特异 表达。该启动子具有重要的应用价值，可调节特定基因在球孢白僵菌产孢阶段或产孢结构 中的表达，从而有效的控制球孢白僵菌的产孢或孢子特性。
【主权项】
1. 聚酮合酶基因启动子PBbpksp在虫生真菌中的用途。2. 如权利要求1所述的用途，其特征在于:所述的用途为在调控虫生真菌产孢或提高虫 生真菌孢子抗性中的用途。3. 如权利要求1或2所述的用途，其特征在于:所述的聚酮合酶基因启动子PBbpksp来自 于球孢白僵菌。4. 如权利要求1或2所述的用途，其特征在于:所述的虫生真菌为绿僵菌或球孢白僵菌。5. 如权利要求3所述的用途，其特征在于:所述的虫生真菌为绿僵菌或球孢白僵菌。6. 如权利要求1或2所述的用途，其特征在于:所述的聚酮合酶基因启动子robpksp具有 如SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列。7. 如权利要求3所述的用途，其特征在于:所述的聚酮合酶基因启动子robpksp具有如 SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列。8. 如权利要求4所述的用途，其特征在于:所述的聚酮合酶基因启动子robpksp具有如 SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列。
【文档编号】C12N15/113GK106086059SQ201610486138
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月28日
【发明人】范艳华, 马玉戈, 裴炎, 金丹
【申请人】西南大学