一种新型转基因复合物及其制备方法与应用
【专利摘要】本发明公开了一种新型转基因复合物及其制备方法与应用，转基因复合物由质量比为0.01～20：0.1～40：1的两亲性阳离子多肽、非病毒载体、核酸复合而成；两亲性阳离子多肽是具有SEQ ID No:1或SEQ ID No:2所示氨基酸序列的一种肽或任意配比的两种肽；非病毒载体是基于质子海绵效应的一种或任意配比的多种阳离子聚合物；核酸为质粒DNA、基因片段、双链或单链DNA片段、cDNA、siRNA、shRNA、mRNA、反义寡核苷酸中的一种或任意配比的多种的组合。本发明能够显著提高具有单一溶酶体逃逸效应的非病毒载体的转染效率，进而提高核酸的递送效率；此外，本发明采用分子自组装方法，可以方便的大规模制备转染复合物，而且该复合物在生物体内可降解，具有较高的使用安全性。
【专利说明】
一种新型转基因复合物及其制备方法与应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一种复合物及其制备方法与应用，尤其涉及一种新型转基因复合物及 其制备方法与应用。
【背景技术】
[0002] 安全高效的核酸递送技术可以广泛应用于重大疾病的基因治疗领域和生命科学 的基础研究中。由于核酸自身的特性使其无法直接穿越细胞膜进入到细胞内，因此核酸的 递送主要依赖核酸递送载体。一个安全有效的核酸递送载体必须克服一系列的生物结构障 碍，如高效地细胞内吞、核酸载体进入细胞后有效的溶酶体逃逸、核酸在细胞质内的高效释 放等。
[0003] 核酸递送载体分为病毒载体和非病毒载体两大类。其中病毒载体虽然具有较尚的 基因递送效率，但是病毒载体自身存在诸多问题，比如潜在的安全性问题如致病性以及免 疫源性，无法递送大的核酸片段以及高昂的生产成本，这些问题限制了病毒载体在临床、科 研方面的应用。作为病毒载体的代替手段，非病毒载体有较高的安全性，而且生产成本较 低，但非病毒载体主要是通过网格蛋白内吞途径进行核酸递送，其溶酶体逃逸能力较低，造 成其转染效率一直较低，成为影响非病毒载体广泛应用的主要问题。
[0004] 虽然非病毒载体可以通过诸多策略进行溶酶体逃逸，如阳离子聚合物的质子海绵 效应、阳离子脂质体载体的膜融合效应、多肽类载体的膜穿孔效应，这些策略能够提供一定 的溶酶体逃逸，但是拥有单一溶酶体逃逸策略的非病毒载体对于一些细胞系转染尤其是难 转染细胞系的转染效率依然较低。目前针对非病毒载体转染效率较低的问题，人们研究较 多是采用共价修饰的方法，在非病毒载体表面修饰功能基团，从而提高单一的溶酶体逃逸 能力，可以在一定程度上提高转染效率，如在聚酰胺-胺型树枝状高分子(PAMAM)或聚乙酰 亚胺(PEI)表面修饰精氨酸，进行氟基化等。但众所周知，共价修饰纯化过程繁琐耗时，不利 于大规模生产，而且，目前方法大多旨在单方面的提高转染复合物单一的溶酶体逃逸效应， 并没有尝试将两种溶酶体逃逸效应在一种非病毒载体为基础的转染复合物中联合使用。
【发明内容】
[0005] 为了解决上述技术所存在的不足之处，本发明提供了一种新型转基因复合物及其 制备方法与应用。
[0006] 为了解决以上技术问题，本发明采用的技术方案是:一种新型转基因复合物，由两 亲性阳离子多肽、非病毒载体、核酸复合而成;两亲性阳离子多肽、非病毒载体、核酸的质量 比为0.01~20:0.1~40:1;两亲性阳离子多肽是具有SEQ ID No: 1或SEQ ID No:2所示氨基 酸序列的一种肽或任意配比的两种肽;非病毒载体是基于质子海绵效应的一种或任意配比 的多种阳离子聚合物;核酸为质粒DNA、基因片段、双链或单链DNA片段、cDNA、siRNA、shRNA、 mRNA、反义寡核苷酸中的一种或任意配比的多种的组合;质粒DNA包括pEGFP质粒、睡美人转 座子系统。
[0007] 阳离子聚合物包括聚酰胺-胺树形高分子、聚乙烯亚胺;聚酰胺-胺树形高分子的 代数为1代到10代;所述聚乙烯亚胺为分枝状或链状。
[0008] 阳离子聚合物的氨基末端未经过其它基团修饰或经过修饰基团修饰，修饰基团包 括组氨酸基团、鸟氨酸基团、聚乙二醇基团、转铁蛋白基团、氟基。
[0009] -种新型转基因复合物的制备方法，首先对上述阳离子聚合物进行预活化处理或 不做处理;然后将上述两亲性阳离子多肽、预活化处理后的阳离子聚合物、核酸按照质量比 0.01~20:0.1~40:1以任意先后顺序或者同时进行复合，形成新型转基因复合物。
[0010] 预活化处理为对阳离子聚合物分子或其水溶液在30~70 °C下孵浴1~24h，让部分 结构的分支断裂使分子结构更具柔性。
[0011] -种新型转基因复合物的应用，新型转基因复合物应用于提高包括难转染细胞系 在内的真核细胞系的转染效率、提高应用睡美人转座子稳定转染真核细胞的效率、提高在 高浓度血清中的转染效率，从而制备基因治疗药物以及转基因试剂。
[0012] 本发明中转基因复合物具备两种溶酶体逃逸效应，能够显著提高具有单一溶酶体 逃逸效应的非病毒载体的转染效率，进而提高核酸的递送效率。本发明采用分子自组装方 法，可以方便的大规模制备转染复合物，而且该复合物在生物体内可降解，具有较高的使用 安全性。
【附图说明】
[0013] 图1为PAMAM/DNA/LAH4-L1复合物的体外转染实验柱状图。
[0014] 图2为PAMAM/DNA/LAH4-L1复合物的粒度测定结果柱状图。
[0015] 图3为PAMAM/DNA/LAH4-L1复合物的体外细胞毒性测试柱状图。
[0016] 图4为PAMAM/DNA/LAH4-L1复合物在不同浓度血清中的转染实验柱状图。
[0017] 图5为PAMAM/DNA/LAH4-L1复合物对MDCK细胞的转染实验柱状图。
[0018]图6为PEI/DNA/LAH4-L1复合物的体外转染实验柱状图。
[0019] 图7为PAMAM/DNA/LAH4-A4复合物的体外转染实验柱状图。
[0020] 图8为PAMAM/siRNA/LAH4-Ll复合物的体外转染实验柱状图。
[0021 ]图9为PAMAM/转座子/LAH4-L1复合物的体外转染实验结果图。
【具体实施方式】
[0022]下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细的说明。
[0023] -种新型转基因复合物，由两亲性阳离子多肽、非病毒载体、核酸复合而成;两亲 性阳呙子多肽、非病毒载体、核酸的质量比为0.01~20:0.1~40:1;两未性阳呙子多肽是具 有SEQ ID N〇:l或SEQ ID N〇:2所示氨基酸序列的一种肽或任意配比的两种肽;两亲性阳离 子多肽包括LAH4-L1和LAH4-A4; LAH4-L1和LAH4-A4的氨基酸序列分别如下：
[0024] LAH4-L1:KKALLAHALHLLALLALHLAHALKKA(SEQ ID NO:1)；
[0025] LAH4-A4:KKALLHAALAHLLALAHHLLALLKKA(SEQ ID NO:2)；
[0026] 非病毒载体是基于质子海绵效应的一种或任意配比的多种阳离子聚合物；阳离子 聚合物包括聚酰胺-胺树形高分子(PAMAM)、聚乙烯亚胺(PEI);PAMAM的代数为1代到10代， 并优选5代PAMAM分子，5代PAMM分子的数均分子量为28826 JEI为分枝状或链状，并优选分 枝状PEI分子，PEI的数均分子量优选为25kDa。阳离子聚合物的氨基末端未经过其它基团修 饰或经过修饰基团修饰，修饰基团包括组氨酸基团、鸟氨酸基团、聚乙二醇基团、转铁蛋白 基团、氟基。核酸为质粒DNA、基因片段、双链或单链DNA片段、〇0嫩、8丨8祖、8111?熟、1111?熟、反义 寡核苷酸中的一种或任意配比的多种的组合;质粒DNA包括pEGFP质粒、睡美人转座子系统。
[0027] -种新型转基因复合物的制备方法:首先对上述阳离子聚合物进行预活化处理或 不做处理;预活化处理为对阳离子聚合物分子或其水溶液在30~70°C下孵浴1~24h，让部 分结构的分支断裂使分子结构更具柔性，优选为将PAMAM或PEI水溶液在40°C条件下孵浴12 小时。然后将上述两亲性阳离子多肽、预活化处理后的阳离子聚合物、核酸按照质量比0.01 ~20:0.1~40:1以任意先后顺序或者同时进行复合，形成新型转基因复合物。
[0028] -种新型转基因复合物的应用:应用于提高包括难转染细胞系在内的真核细胞系 的转染效率、提高应用睡美人转座子稳定转染真核细胞的效效率、提高在高浓度血清中的 转染率，从而制备基因治疗药物以及转基因试剂。
[0029] 本发明用到的两亲性阳离子多肽可通过多肽合成仪进行化学合成，其它所有试剂 均可通过普通商业途径进行购买。
[0030] 下面由以下具体实施例对本发明的制备方法及应用做进一步的阐述：
[0031] 实施例一:PAMAM/DNA/LAH4-L1 复合物
[0032] PAMAM/DNA/LAH4-L1复合物的制备:首先将10mg/mL的第5代PAMAM储存液溶解于消 毒蒸馏水中，振荡混勾，配制成lmg/mL的PAMAM工作溶液，4°C储存备用;再将LAH4-L1溶解于 消毒蒸馏水中，振荡混匀，配制成lmg/mL的LAH4-L1工作溶液，4°C储存备用。
[0033] 制备方法I:转染前取Iyg pEGFP质粒DNA置于EP管中，加入20yL DMEM培养基。将1μ L的LAH4-L1工作溶液置于EP管中，加入20yL DMEM培养基；将pEGFP质粒DNA溶液加入到 LAH4-L1培养基溶液中，混匀后置室温孵育20分钟，形成DNA/LAH4-L1复合物；
[0034] 将5yL PAMAM工作溶液加入到含有20yL DMEM培养基的EP管中混合均匀，将DNA/ LAH4-L1复合物加入到PAMAM的培养基溶液中，混匀后置室温孵育20分钟，形成PAMAM/DNA/ LAH4-L1复合物I。
[0035] 制备方法Π :转染前取Iyg pEGFP质粒DNA置于EP管中，加入20yL DMEM培养基。将5 yL PAMAM工作溶液置于EP管中，加入20yL DMEM培养基;将pEGFP质粒DNA溶液加入到PAMAM 培养基溶液中，混匀后置室温孵育20分钟，形成PAMAM/DNA复合物；
[0036] 将IyL LAH4-L1工作溶液加入到含有20yL DMEM培养基的EP管中混合均匀，将 PAMAM/DNA复合物加入到LAH4-L1的培养基溶液中，混匀后置室温孵育20分钟，形成PAMAM/ DNA/LAH4-L1 复合物 Π 。
[0037] 制备方法m:转染前取Iyg pEGFP质粒DNA置于EP管中，加入20yLDMEM培养基；5yL 的PAMAM工作溶液和IyL的LAH4-L1工作溶液同时加入到含有40yL DMEM培养基的EP管中混 匀;再将pEGFP质粒DNA加入到含有PAMAM和LAH4-L1的培养基溶液中，混匀后室温孵育20分 钟，形成 PAMAM/DNA/LAH4-L1 复合物 ΙΠ 。
[0038] 对上述三种方法制备出的不同的PAMAM/DNA/LAH4-L1复合物进行以下效果验证实 验：
[0039] (1)、体外转染实验：选取上述制备方法得到的PAMAM/DNA/LAH4-L1复合物I、 PAMAM/DNA/LAH4-L1 复合物 Π 、PAMAM/DNA/LAH4-L1 复合物 ΙΠ 、DNA/LAH4-L1 复合物、PAMAM/ DNA复合物，进行体外转染实验，并与电穿孔法转染法、脂质体法转染法的转染效果相对比， 对比结果如图1所示。
[0040]各复合物的体外转染方法如下：
[00411收集对数生长期的HeLa细胞接种于48孔细胞培养板，每孔20000个，于37 °C和5 % CO2条件下培养24h至细胞达到70 %汇合度，弃培养基，加入新鲜培养基;然后分别加入各复 合物，于37 °C培养4h。转染结束后，更换新鲜培养基，于37 °C和5 %CO2条件下培养24h;用流 式细胞术检测目的基因绿色荧光蛋白（GFP)基因的表达情况。
[0042]电穿孔法转染方法如下：
[0043] 收集IOOyL对数生长期的HeLa细胞（共5x IO5个）加入到2mm电转杯中，将2yg pEGFP质粒DNA加入到电转杯中，采用电转仪进行HeLa细胞电穿孔转染。电穿孔转染结束后， 将细胞收集到6孔板中培养。于37°C和5%C02条件下培养24h;用流式细胞术检测GFP基因表 达情况。
[0044]脂质体法转染方法如下：
[0045]收集对数生长期的HeLa细胞接种于48孔细胞培养板，每孔20000个，于37 °C和5 % CO2条件下培养24h至细胞达到70 %汇合度，弃培养基，加入新鲜培养基。然后加入脂质体/ DNA复合物，于37 °C培养4h;转染结束后，更换新鲜培养基，于37 °C和5 %⑶2条件下培养24h; 用流式细胞术检测GFP基因表达情况。
[0046]脂质体/核酸复合物的制备方法如下：
[0047] 转染前取Iyg pEGFP质粒DNA置于EP管中，加入20yLDMEM培养基；将8yg DC30脂质 体置于加入20yL DMEM培养基的EP管中；将pEGFP质粒DNA溶液加入到DC30脂质体的培养基 溶液中，混匀后置室温孵育20分钟，形成脂质体/DNA复合物。
[0048] 从图 1可以看出，PAMAM/DNA/LAH4-L1复合物I、PAMAM/DNA/LAH4-L1复合物 Π 、 PAMAM/DNA/LAH4-L1复合物ΙΠ 的体外转染效率显著高于DNA/LAH4-L1复合物以及PAMAM/DNA 复合物，也明显高于电穿孔转染法和脂质体转染法。此结果表明，联合应用PAMAM以及LAH4-Ll递送核酸可以显著提高GFP基因在HeLa细胞中的表达。
[0049] (2)、粒度测定:将制备好的PAMAM/DNA/LAH4-L1 复合物I、PAMAM/DNA/LAH4-L1 复合 物Π 、PAMAM/DNA/LAH4-L1复合物ΙΠ 、DNA/LAH4-L1复合物以及PAMAM/DNA复合物分别放入激 光粒度仪自动检测粒径和Zeta电位，测试结果如图2所示；
[0050] 复合物的粒径会直接影响复合物递送核酸的效率，粒径越小，核酸越容易递送成 功。图2中的实验结果表明，PAMAM/DNA/LAH4-L1复合物I、PAMAM/DNA/LAH4-L1复合物Π 、 PAMAM/DNA/LAH4-L1复合物ΙΠ 的平均粒径在60nm左右，可以对其较好的核酸递送效率提供 理论支持。
[0051 ] (3)、体外细胞毒性测试：将制备好的PAMAM/DNA/LAH4-L1复合物I、PAMAM/DNA/ LAH4-L1 复合物Π 、PAMAM/DNA/LAH4-L1 复合物ΙΠ 、DNA/LAH4-L1 复合物以及PAMAM/DNA复合 物，分别转染HeLa细胞后采用CTG细胞增殖检测试剂盒进行检测，并与电穿孔法转染法、月旨 质体法转染法的细胞毒性相对比，实验结果如图3所示;从图中可见，PAMAM/DNA/LAH4-L1复 合物I、PAMAM/DNA/LAH4-L1复合物Π 、PAMAM/DNA/LAH4-L1复合物ΙΠ 转染HeLa细胞后的细胞 活性均较高，表明上述三种复合物无明显的细胞毒性。
[0052] (4)、血清中的转染实验：收集对数生长期的HeLa细胞接种于48孔细胞培养板，每 孔20000个，于37 °C和5 % CO2条件下培养24h至细胞达到70 %汇合度，弃培养基，加入含不同 血清浓度的新鲜培养基;然后分别加入各复合物，于37 °C培养4h。转染结束后，更换新鲜培 养基，于37 °C和5 % CO2条件下培养24h;用流式细胞术检测GFP基因表达情况，实验结果如图 4所示；
[0053]图4表明，PAMAM/DNA/LAH4-L1 复合物I、PAMAM/DNA/LAH4-L1 复合物 Π 、PAMAM/DNA/ LAH4-L1复合物ΙΠ 与DNA/LAH4-L1复合物、PAMAM/DNA复合物相比，在高浓度血清中仍可保持 较高的基因转染效率。此结果表明，血清对PAMAM/DNA/LAH4-L1复合物的转染效率没有显著 影响。
[0054] (5)、对MDCK细胞的转染实验:收集对数生长期的较难转染的细胞系MDCK细胞，接 种于48孔细胞培养板，每孔20000个，于37 °C和5 % CO2条件下培养24h至细胞达到70 %汇合 度，弃培养基，加入含50 %血清浓度的新鲜培养基;然后分别加入各复合物，于37 °C培养4h。 转染结束后，更换新鲜培养基，于37 °C和5 % CO2条件下培养24h;用流式细胞术检测GFP基因 表达情况，实验结果如图5所示；
[0055] 图5中的实验结果可得出以下两条结论:一是PAMAM/DNA/LAH4-L1复合物I、PAMAM/ DNA/LAH4-L1复合物Π 、PAMAM/DNA/LAH4-L1复合物ΙΠ 对MDCK细胞的转染效率均明显高于 DNA/LAH4-L1复合物、PAMAM/DNA复合物的转染效率；二是PAMAM/DNA/LAH4-L1复合物I、 PAMAM/DNA/LAH4-L1复合物Π 、PAMAM/DNA/LAH4-L1复合物ΙΠ 在高浓度血清中仍然可以保持 较高的对难转染细胞系的基因转染效率。
[0056]实施例二:PEI/DNA/LAH4-L1 复合物
[0057] PEI/DNA/LAH4-L1复合物的制备方法同实施例一，并将PAMAM替换为TOI，其中， PEI、pEGFP质粒DNA、LAH4-L1的质量比均为0.4:1:1，制备出PEI/DNA/LAH4-L1 复合物I、PEI/ DNA/LAH4-L1 复合物 Π 、PEI/DNA/LAH4-L1 复合物 ΙΠ 、PEI/DNA复合物、LAH4-L1/DNA复合物。 [0058]对制备的各复合物进行体外转染实验:收集对数生长期的HeLa细胞接种于48孔细 胞培养板，每孔20000个，于37 °C和5 %⑶2条件下培养24h至细胞达到70 %汇合度，弃培养 基，加入含有50 %血清浓度的新鲜培养基;然后分别加入各复合物，于37 °C培养4h。转染结 束后，更换10%血清浓度的新鲜培养基，于37°C和5%C02条件下培养24h;用流式细胞术检 测GFP基因表达情况，实验结果如图6所示；
[0059] 从图6可以看出，PEI/DNA/LAH4-L1 复合物I、PEI/DNA/LAH4-L1 复合物Π 、PEI/DNA/ LAH4-L1复合物ΙΠ 的体外转染效率显著高于PEI/DNA复合物和LAH4-L1/DNA复合物，表明联 合应用PEI以及LAH4-L1递送核酸可以显著提高GFP基因在HeLa细胞中的表达。
[0060] 实施例三:PAMAM/DNA/LAH4-A4 复合物
[0061 ] PAMAM/DNA/LAH4-A4复合物的制备方法同实施例一，并将LAH4-L1替换为LAH4-A4， 其中，PAMAM、pEGFP质粒DNA、LAH4-A4的质量比均为7:1:1，制备出PAMAM/DNA/LAH4-A4复合 物I、PAMAM/DNA/LAH4-A4复合物 Π 、PAMAM/DNA/LAH4-A4复合物ΙΠ 、DNA/LAH4-A4复合物、 PAMAM/DNA 复合物。
[0062]对制备的各复合物进行体外转染实验:收集对数生长期的HeLa细胞接种于48孔细 胞培养板，每孔20000个，于37 °C和5 %⑶2条件下培养24h至细胞达到70 %汇合度，弃培养 基，加入含有50 %血清浓度的新鲜培养基;然后分别加入各复合物，于37 °C培养4h。转染结 束后，更换10%血清浓度的新鲜培养基，于37°C和5%C02条件下培养24h;用流式细胞术检 测GFP基因表达情况，实验结果如图7所示；
[0063] 从图7可以看出，PAMAM/DNA/LAH4-A4复合物I、PAMAM/DNA/LAH4-A4复合物 Π 、 PAMAM/DNA/LAH4-A4复合物ΙΠ 的体外转染效率显著高于DNA/LAH4-A4复合物和PAMAM/DNA复 合物，表明联合应用PAMAM以及LAH4-A4递送核酸亦可以显著提高GFP基因在HeLa细胞中的 表达。
[0064] 实施例四：PAMAM/siRNA/LAH4-Ll 复合物
[0065] PAMAM/siRNA/LAH4-Ll复合物的制备方法同实施例一，并将pEGFP质粒DNA替换为 s i RNA，其中，PAMAM、s i RNA、LAH4-L1 的质量比均为 3 5:2:6，制备出 PAMAM/ s i RNA/LAH4-L1 复 合物I、PAMAM/siRNA/LAH4-Ll复合物H、PAMAM/siRNA/LAH4-Ll复合物ΙΠ 、PAMAM/siRNA复合 物。
[0066] PAMAM/siRNA/LAH4-Ll复合物的转染方法同实施例三，对稳定表达GFP基因的HeLa 细胞进行转染，观察各复合物对GFP基因的表达抑制情况，并与电穿孔法、脂质体法对GFP基 因的表达抑制情况相对比，实验结果如图8所示。
[0067]从图8可以看出，PAMAM/siRNA/LAH4-Ll复合物I、PAMAM/siRNA/LAH4-Ll复合物Π 、 PAMAM/siRNA/LAH4-Ll复合物ΙΠ 可以高效递送siRNA进入目的细胞并抑制目的基因的表达。 [0068] 实施例五:PAMAM/转座子/LAH4-L1复合物
[0069] PAMAM/转座子/LAH4-L1复合物的制备方法同实施例一，并将pEGFP质粒DNA替换为 睡美人转座子系统，其中，PAMAM、睡美人转座子系统、LAH4-L1的质量比均为3:1:1，制备出 PAMAM/转座子/LAH4-L1 复合物I、PAMAM/转座子/LAH4-L1 复合物 Π 、PAMAM/转座子/LAH4-L1 复合物ΙΠ 、转座子/LAH4-L1复合物、PAMM/转座子复合物。
[0070] PAMAM/转座子/LAH4-L1复合物的转染方法同实施例三，观察各复合物对HeLa细胞 作用后GFP基因的表达情况，转染后28d的实现结果如图9所示。
[0071] 从图9可以看出，经过PAMAM/转座子/LAH4-L1复合物I、PAMAM/转座子/LAH4-L1复 合物Π 、PAMAM/转座子/LAH4-L1复合物ΙΠ 转染的细胞，与经过转座子/LAH4-L1复合物、 PAMAM/转座子复合物转染的细胞相比，细胞内的GFP基因表达情况明显增强，即通过PAMAM 和LAH4-L1的联合作用，GFP基因在HeLa细胞中的转染效率明显提高，表明PAMAM/转座子/ LAH4-L1复合物递送的睡美人转座子系统可以稳定转染HeLa细胞。
[0072] 以上实施例以及实验结果表明，两亲性阳离子多肽、阳离子聚合物与核酸形成的 新型转基因复合物不仅可以高效递送DNA，也可以高效递送s iRNA。
[0073] 目前非病毒载体溶酶体逃逸策略主要为质子海绵效应、膜融合效应、膜穿孔或膜 干扰效应。本发明中转染复合物具有两种溶酶体逃逸效应：阳离子聚合物的质子海绵效应 和两亲性阳离子多肽的膜穿孔或膜干扰效应。这两种效应联合使用能够显著提高具有单一 溶酶体逃逸效应的非病毒载体的转染效率，进而提高核酸的递送效率。本发明采用分子自 组装方法，可以方便的大规模制备转染复合物，而且该复合物在生物体内可降解、不易在体 内蓄积，具有较高的使用安全性。
[0074] 上述实施方式并非是对本发明的限制，本发明也并不仅限于上述举例，本技术领 域的技术人员在本发明的技术方案范围内所做出的变化、改型、添加或替换，也均属于本发 明的保护范围。
【主权项】
1. 一种新型转基因复合物，其特征在于:所述转基因复合物由两亲性阳离子多肽、非病 毒载体、核酸复合而成;所述两亲性阳离子多肽、非病毒载体、核酸的质量比为0.01~20: 0.1~40:1;所述两亲性阳离子多肽是具有SEQ ID No: 1或SEQ ID No:2所示氨基酸序列的 一种肽或任意配比的两种肽;所述非病毒载体是基于质子海绵效应的一种或任意配比的多 种阳离子聚合物;所述核酸为质粒DNA、基因片段、双链或单链DNA片段、cDNA、siRNA、shRNA、 mRNA、反义寡核苷酸中的一种或任意配比的多种的组合;所述质粒DNA包括pEGFP质粒、睡美 人转座子系统。2. 根据权利要求1所述的新型转基因复合物，其特征在于:所述阳离子聚合物包括聚酰 胺-胺树形高分子、聚乙烯亚胺;所述聚酰胺-胺树形高分子的代数为1代到10代;所述聚乙 烯亚胺为分枝状或链状。3. 根据权利要求2所述的新型转基因复合物，其特征在于:所述阳离子聚合物的氨基末 端未经过其它基团修饰或经过修饰基团修饰，修饰基团包括组氨酸基团、鸟氨酸基团、聚乙 ^醇基团、转铁蛋白基团、氣基。4. 一种新型转基因复合物的制备方法，其特征在于:所述制备方法为:首先对上述阳离 子聚合物进行预活化处理或不做处理;然后将上述两亲性阳离子多肽、预活化处理后的阳 离子聚合物、核酸按照质量比0.01~20:0.1~40:1以任意先后顺序或者同时进行复合，形 成新型转基因复合物。5. 根据权利要求4所述的新型转基因复合物的制备方法，其特征在于:所述预活化处理 为对阳离子聚合物分子或其水溶液在30~70°C下孵浴1~24h，让部分结构的分支断裂使分 子结构更具柔性。6. -种新型转基因复合物的应用，其特征在于:所述新型转基因复合物应用于提高包 括难转染细胞系在内的真核细胞系的转染效率、提高应用睡美人转座子稳定转染真核细胞 的效率、提高在高浓度血清中的转染效率，从而制备基因治疗药物以及转基因试剂。
【文档编号】A61K48/00GK106086069SQ201610398817
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月7日
【发明人】刘楠
【申请人】刘楠