CXCR4RNAi慢病毒载体的构建方法
【专利摘要】本发明提供一种CXCR4RNAi慢病毒载体的构建方法，通过根据GenBank CXCR4的mRNA全序列，经BLAST同源性比对证实特异性后应用RNA structure 4.4软件对靶mRNA序列的二级结构进行评估，得到19nt靶序列；然后针对各靶序列设计合成其相应的两条shRNA寡核苷酸单链；然后环状空质粒酶切后，酶切片段连接PLVX.1载体与shRNA寡核苷酸双链，连接形成的重组载体，连接产物转化新鲜感受态细胞E.coli DH5α，37℃培养16h后挑阳性克隆进行菌落PCR鉴定，测序结果验证重组质粒构建成功后，提取重组质粒。
【专利说明】
CXCR4RNA i慢病毒载体的构建方法
技术领域
[0001 ]本发明属于基因工程领域，具体涉及一种CXCR4RNAi慢病毒载体的构建方法。
【背景技术】
[0002] 当前在世界范围内肺癌发病率逐年上升，每年大约有超过一百万人死于肺癌，已 成为恶性肿瘤最常见死因之一，肺癌约30%患者在病程中出现颅脑转移，脑转移瘤自然生存 时间为1~3个月，是恶性肿瘤严重并发症之一，颅脑转移为肺癌死亡的重要原因之一。趋化 因子是一类具有生物化学趋化性的细胞因子，其中SDF-I及其特异性受体CXCR4在肿瘤细 胞的迀移与侵袭中发挥了重要的作用。研究显示SDF-I及其受体CXCR4组成的信号传导通 路可能与肺癌的发生、发展及颅脑转移关系密切。在非小细胞肺癌早期诊断和治疗中，侵袭 和转移是非小细胞肺癌治疗效果不佳的主要因素。为了更好的研究CXCR4/SDF-1生物学轴 在非小细胞肺癌侵袭及转移特别是脑转移中的作用，本研究采用具有脑转移潜能的肺癌细 胞PC-9构建细胞模型，通过设计针对CXCR4基因序列的shRNA片段，构建慢病毒shRNA干扰表 达载体，从而特异性的靶向沉默肺癌细胞CXCR4基因的表达。慢病毒介导的shRNA干扰的特 点是高效、稳定且静默持续时间长，为进一步研究SDF-1/CXCR4生物学轴在非小细胞肺癌颅 脑转移中的作用提供了工具。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于提供一种CXCR4RNAi慢病毒载体的构建方法。
[0004] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案： CXCR4RNAi慢病毒载体，所述载体含有CXCR4基因片段。
[0005] CXCR4RNAi慢病毒载体的构建方法，包括如下： (1)干扰序列设计:根据GenBank CXCR4的mRNA全序列，经BLAST同源性比对证实特异性 后应用RNA structure 4.4软件对祀mRNA序列的二级结构进行评估，得到19nt靶序列;然后 针对各祀序列设计合成其相应的两条shRNA寡核苷酸单链;同时设计一对对照序列siRNAc; (2 )慢病毒表达载体的构建及鉴定:空载体pGC-LV带有GFP标记，将PLVX-shRNA-PURO vector环状空质粒用BamH I:和EcoR ?限制性内切酶进行双酶切，并回收PLVX-SHRNA-PURO vector酶切片段，连接空PLVX. 1载体(来自clontech公司）与shRNA寡核苷酸双链，连接形成 的重组载体，连接产物转化新鲜感受态细胞E. coli DH5a，37°C培养16h后挑阳性克隆进行 菌落PCR鉴定，测序结果验证重组质粒构建成功后，提取重组质粒； (3)QPCR筛选shRNA:CXCR4基因的QPCR引物为载体多克隆位点两端的引物，培养293细 胞，将质粒和lip〇2000复合物加入六孔板293细胞中，提取各组细胞的RNA，将RNA反转录为 cDNA，利用cDNA为模板，利用所述QPCR引物检测CXCR4基因的相对表达量，焚光定量检测各 组引物;PCR 反应条件:95°C30s，l 循环，55°C30s40 循环，95°C5s，60°Clmin，95°C15s。
[0006] 步骤（3)中所述QPCR引物序列为：PrimeK + ) : 5 'GGAGAGTTGTAGGATTCTAC-3 ' ' Primer(-):5'-CCTCGGTGTAGTTATCTGAAG-3'。
[0007] PLVX-shRNA-PURO vector环状空质粒是由clontech公司载体PLVX_shRNA2改造 的，具体方式是：扩增puro表达框，将puro表达框克隆至PLVX-shRNA2载体ZSgreen后面。公 认的绿色强荧光蛋白，本领域技术人员可以按此方法获得该质粒。
[0008] 本发明的优点在于： 慢病毒载体和逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体等相比，具有以下的优 点：（1)可感染分裂期细胞与非分裂期细胞，如神经系统、造血系统等非分裂期细胞，免疫反 应较小；（2)可转移基因片段较大，可插入约10 kb的基因片段；（3)病毒突变与产生有复制 能力的病毒机率较小，大大减少了产生有复制能力的病毒（replication competent virUS，RCV); (4)目的基因和宿主基因组通过整合，可实现目的基因较长时间的表达。基因 治疗中的RNA干扰技术已成为肿瘤治疗的新方法，慢病毒载体能安全将肿瘤目的基因转移 到机体。通过慢病毒载体介导的RNAi技术，发现与疾病相关的影响因素，并尝试由此着手研 究治疗的方法，达到治疗疾病的效果。为此还应该保证更高的安全性、有效性和可靠性，并 逐步从体外实验和动物实验进入到临床试验阶段，相信该技术将在今后的研究领域和临床 实际应用方面有着更广阔的前景。
【附图说明】
[0009] 图 I CXCR4-shRNA阳性克隆PCR鉴定图，1:阴性对照（ddH20) ; 2 : Marker ; 3-8 : CXCR4-shRNA 克隆。
[0010] 图2各组293细胞中CXCR4表达变化(又土 5?，n=3)，*P〈 0.01，**/5 =0.192 >0.05)。
【具体实施方式】
[0011] 1材料与方法 1.1材料 人肺腺癌PC9细胞株购自上海玉博生物科技有限公司。细胞用DMEM 90%，Fetal Bovine Serum 10%培养基，在37°C，5%C〇2的细胞培养箱中常规培养。CXCR4兔多克隆抗体、 GAPDH鼠多抗购自abeam公司，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗购自abeam公司 1.2方法 1.2.1干扰序列设计 根据GenBank CXCR4的mRNA全序列(Accession No:NM_003467)，经BLAST同源性比对证 实特异性后应用RNA structure 4.4软件对革EmRNA序列的二级结构进行评估，得到3条19nt 靶序列。然后针对各靶序列设计合成其相应的两条shRNA寡核苷酸单链。同时设计一对对照 序列s iRNAc。然后根据s iRNA的序列设计合成两条shRNA寡核苷酸单链。设计如下:BamH i:酶 切位点+19 nt靶核苷酸序列+茎环结构(TTCAAGAGA)+靶序列互补序列+RNA Polyiil聚合酶 转录中止位点(TTTTTT)+EcoR|酶切位点六个区域，分别命名为shRNAl、shRNA2、shRNA3、， 以及shRNAc，具体序列见表UshRNA寡核苷酸链由上海生工公司合成。
[0012] 表1. CXCR4基因的3条特异性SiRNA靶序列
1.2.2慢病毒表达载体的构建及鉴定 空载体pGC-LV带有GFP标记。将PLVX-shRNA-PURO vector环状空质粒用BamH f和 EcoR I限制性内切酶进行双酶切，并回收PLVX-SHRNA-PURO vector酶切片段。连接空 PLVX. 1载体与shRNA寡核苷酸双链，连接形成的重组载体分别标记为:PLVX-CXCR4shRNAl、 PLVX-CXCR4shRNA2、PLVX-CXCR4shRNA3、PLVX-CXCR4shRNAc。连接产物转化新鲜感受态细胞 E.coli DH5cu37°C培养16h后挑阳性克隆进行菌落PCR鉴定，送上海生工进行DNA测序鉴定。 测序结果验证重组质粒构建成功后，提取重组质粒。
[0013] 1.2.3 QPCR筛选最佳干扰效果的shRNA CXCR4基因的QPCR引物为载体多克隆位点两端的引物，序列为Primer( + ):5, ' GGAGAGTTGTAGGATTCTAC3'，Primer(_) :5'CCTCGGTGTAGTTATCTGAAG3'， 培养293细胞，将质粒（pLVX-CXCR4shRNAl，pLVX-CXCR4shRNA2，pLVX-CXCR4shRNA3、 pLVX-acGFP-Cl)和lipo2000复合物加入六孔板293细胞中，提取各组细胞的RNA，将RNA反转 录为cDNA，利用cDNA为模板，检测CXCR4基因的相对表达量，荧光定量检测各组引物。PCR反 应条件：95°C 30s，1 循环，55 °C30s40循环，95°C 5s，60°C Imin，95 °C 15s。以 2-Met值表示 CXCR4基因 mRNA的相对表达水平。
[0014] 1.2.4慢病毒包装 根据干扰筛选的结果，将最佳干扰效果的干扰载体PLVX-CXCR4-shRNAl涂板，37 °C培养 过夜，挑取单菌落，接种到200ml的LB培养基中，250rpm，37 °C摇菌培养过夜，大量提取质粒。 大量培养293T细胞，转染前一天，用胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞，用不含抗生素 的DMEM完全培养基接种293FT细胞于60 mm平皿中，每个皿接种细胞2 X 106个细胞，37 °C、5% C02培养箱内培养24 h。将shRNAc、CXCR4-shRNA分别和慢病毒包装质粒共转染293T细胞。 48 h收集转染后的293T细胞上清液，滤液经超速离心后浓缩，去掉上清，保留下面沉淀，加 入适量的PBS溶解病毒沉淀，分装后保存在病毒管中，-80°C长期保存。
[0015] 1.2.5病毒滴度测定 培养293细胞，将细胞接种到48孔板，每孔105个细胞，37 °C，5%C02继续培养18h。取20μ1 的病毒稀释到200μ1的DMEM培养基，依次10稀释病毒即（10_3、10_4、10_ 5、10_6、10_7)，混匀稀 释的病毒，分别加到48孔中，每孔100yl，37°C，5%C02继续培养48h。利用荧光倒置显微镜检 测统计各个孔带荧光细胞的数量，结合稀释倍数计算病毒滴度:滴度(TU/ml )=荧光细胞数 X有效稀释倍数。
[0016] 1.2.6稳定干扰细胞株的建立 感染前1天取对数生长期状态良好的PC9细胞按每孔5 XlO5个接种于6孔板。感染时， 按照MOI=IOO稀释慢病毒，孔中分别加入含8 mg·!/1聚凝胺的2种稀释后病毒液lmL，同时 设定空白的靶细胞作为对照。培养16h后，更换为新鲜的DMEM完全培养基2mL继续培养，48h 后荧光显微镜下观察感染效率。将感染后的细胞用胰酶消化后制成单细胞悬液，按照每皿 1000个的密度接种于IOcm的培养皿，培养至形成单克隆细胞团，选择单克隆细胞再一次进 行克隆，然后挑取足够数量单克隆细胞进行扩增培养，为下一步检测作准备。得到的稳定干 扰细胞分别命名为PC9/CXCR4-shRNA，阴性对照细胞命名为PC9/shRNAc。
[0017] 1.2.7 QPCR检测细胞PC-9mRNA干扰效率 收集PC9/CXCR4-shRNA、PC9/shRNAc细胞，按QIAGEN Rneasy Mini kit试剂盒说明书中 的实验方法和步骤提取细胞总RNA，并按照反转录试剂盒(PrimeScript RT reagent Kit) 进行cDNA逆转录合成。以此cDNA为模板，应用荧光定量PCR试剂盒进行PCR扩增，CXCR4和 GAPDH基因（内参照）引物由生工生物工程（上海）股份有限公司设计合成。CXCR4: Pr imer (+ ) : 5' GGAGAGTTGTAGGATTCTAC3，，Primer(-): 5'CCTCGGTGTAGTTATCTGAAG3'。PCR反应条 件:95°C30s，l 循环，55°C30s40 循环，951：58,60°(：111^11，95°(：158。以2~-(1(1(^值表示〇父〇?4基 因 mRNA的相对表达水平。
[0018] 1.2.8 Western blot检测细胞PC-9蛋白干扰效率 收集PC9/CXCR4-shRNA、PC9/shRNAc细胞，加入细胞裂解液冰上裂解10 min，取蛋白上 清用BCA蛋白浓度测定浓度。取50~80g蛋白质进行10%SDS-PAGE电泳，分离后的蛋白质 电转移至PVDF膜上，用含5 %脱脂奶粉的封闭液室温封闭2 h;加入1:2000稀释的兔抗人 CXCR4多克隆抗体和1:2000稀释的小鼠抗人GAPDH单克隆抗体，4°C反应过夜;TBS洗膜后， 分别加入1:3000稀释的二抗(HRP标记的山羊抗兔或山羊抗小鼠 IgG)，室温反应2h; TBS洗 涤后，加入化学发光试剂，冷CCD成像系统曝光、显影和定影。扫描胶片，对各蛋白条带进行 灰度值分析，以CXCR4蛋白条带灰度值与内参照GATOH蛋白条带灰度值的比值表示CXCR4蛋 白的相对表达水平。
[0019] 2 结果 2.1重组慢病毒质粒的PCR和测序鉴定 PCR鉴定重组慢病毒质粒时，连接入shRNA片段的阳性克隆PCR片段大小为200bp。将PCR 产物进行电泳，第1、2、3对靶点序列结果均显示阳性克隆(Figl)。从每个靶点序列的阳性克 隆中各选一个进行测序，结果测试结果显示序列是正确的。
[0020] 2.2最佳干扰效果的ShRNA筛选 各组293细胞中的CXCR4的mRNA表达水平如图2所示，结果显示:通过单因素方差分析， 与空白对照组相比，实验组中的293细胞的CXCR4的表达水平均显著下降(P=0.00 01〈0.01)， 阴性对照载体组的293细胞的CXCR4表达水平变化无统计学意义（P=0.192>0.05)，说明 CXCR4-shRNA载体能显著下调293细胞中CXCR4mRNA的表达，且CXCR4-shRNAl载体下调最明 显。
[0021] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与 修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
【主权项】
1. CXCR4RNAi慢病毒载体的构建方法，其特征在于:所述构建方法包括如下： (1) 干扰序列设计:根据GenBank CXCR4的mRNA全序列，经BLAST同源性比对证实特异性 后应用RNA struc化re 4.4软件对祀1111?^4序列的二级结构进行评估，得到1911*祀序列;然后 针对各祀序列设计合成其相应的两条shRNA寡核巧酸单链； (2) 慢病毒表达载体的构建及鉴定：空载体pGC-LV带有GFP标记，将化VX-shRNA-PURO vector环状空质粒，用BamHf和EcoR i:限制性内切酶进行双酶切，并回收化VX-S皿NA-PUR0 vector酶切片段，连接空化VX. 1载体与shRNA寡核巧酸双链，连接形成的重组载体，连接产 物转化新鲜感受态细胞E.coli DH5a，37°C培养16h后挑阳性克隆进行菌落PCR鉴定，测序结 果验证重组质粒构建成功后，提取重组质粒pLVX-CXCR4shRNA; (3) QPCR筛选shRNA: CXCR4基因的QPCR引物为载体多克隆位点两端的引物，培养293细 胞，将获得的质粒pLVX-CXCR4shRNA和lipo2000复合物加入六孔板293细胞中，提取各组细 胞的RNA，将RNA反转录为cDNA，利用cDNA为模板，利用所述QPCR引物检测CXCR4基因的相对 表达量，巧光定量检测各组引物;PCR反应条件:95 °C 30s，1循环，55 °C 30s40循环，95 °C 5s，60 °Clmin，95°C15s。2. 根据权利要求1所述的CXCR4RNAi慢病毒载体的构建方法，其特征在于:步骤(3)中所 述QPCR引物序列为：Prime^ + ) :5'GGAGAGTTGTAGGATTCTAC-3' 'Primer(-) :5'- CCTCGGTGTAGTTATCTGAAG-3'。3. 根据权利要求1所述的CXCR4RNAi慢病毒载体的构建方法，其特征在于:所述的化VX- shRNA-PURO vector环状空质粒是载体PLVX-shRNA2改造获得。4. 如权利要求1所述的构建方法构建获得的载体。
【文档编号】C12N15/867GK106086075SQ201610462279
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月23日
【发明人】胡志坚, 陈愉生, 李鸿茹, 钟雪晶
【申请人】福建医科大学