用于car?t制备的慢病毒载体及其构建方法和应用

文档序号:10715812阅读:1803来源:国知局
用于car?t制备的慢病毒载体及其构建方法和应用
【专利摘要】本发明公开了用于CAR?T制备的慢病毒载体及其构建方法和在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明还建立了荧光定量PCR检测病毒滴度的方法,为临床应用提供了检测标准。本发明提供的慢病毒载体具有长度小,能够高效表达CAR基因,包装出足够滴度的慢病毒、而且不表达GFP等与治疗无关的标志基因等优点,经实验验证,该慢病毒载体适用于CAR?T研究和临床应用。
【专利说明】
用于CAR-T制备的慢病毒载体及其构建方法和应用
技术领域
[0001] 本发明涉及生物技术领域,具体涉及慢病毒载体及其制备和应用。
【背景技术】
[0002] 免疫细胞治疗技术是近几年出现的最新的治疗肿瘤的技术,和现有的手术、放疗、 化疗、靶向治疗相比,具有自身不可替代的优势和发展潜力,因此,被称为肿瘤治疗的第五 大技术。免疫细胞治疗主要包括传统的CIK(Cytokine Induced Killer cells,CIK)、DC-CIK(Dendritic Cells,DC)和最新的CAR-T技术。CAR-T技术,全称为嵌合抗原受体T细胞技 术(Chimeric Antigen Receptor T cells,CAR_T),CAR主要结构包括细胞外结合肿瘤相关 抗原(Tumor Associated Antigen,TAA)的单链抗体结构域和细胞胞衆内活化T细胞的0)28 协同刺激信号和CD3G信号,该组合的基因工程设计的序列,克隆入慢病毒载体,包装为慢病 毒,感染肿瘤患者的T细胞,就制备成功CAR-T,CAR-T回输肿瘤患者后,T细胞表面的单链抗 体识别肿瘤细胞TAA,进而活化T细胞,活化的T细胞杀死识别的肿瘤细胞。CAR-T技术从2011 年取得突破性进展以来,在白血病和淋巴瘤的大量临床试验中,对白血病取得了93%的缓 解率,对淋巴瘤取得了47%的缓解率,对于肺癌、肝癌、胃癌等实体肿瘤,正在进行不同设 计、不同临床实施方法的临床试验,逐渐将会报道振奋人心的结果。
[0003] 在CAR-T技术的实施中,最为关键的是慢病毒载体的构建,尽管慢病毒载体的研究 有了很大进展,但距离临床应用还有很长的路要走。例如,重组病毒的滴度还不够高,除 Naldini等报道的结果外,其余均在IO1TUAiI~103TU/ml之间,难以达到体内应用的需要。造 成重组病毒滴度低的主要原因之一是慢病毒载体偏大,较大的载体会直接影响到病毒的滴 度和T细胞的感染效率。为此,设计、构建、使用合适大小的高效表达的慢病毒载体是CAR-T 应用中的关键环节,已成为制约CAR-T技术研究和应用的主要瓶颈之一。

【发明内容】

[0004] 本发明公开了一种用于CAR-T制备的慢病毒载体及其构建方法和在制备抗肿瘤药 物中的应用。该发明还建立了荧光定量PCR检测病毒滴度的方法,为临床应用提供了检测标 准。
[0005] 本发明提供了一种用于嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)制备的慢病毒载体Pre-Lenti-EFl-MCS,其核苷酸序列如SEQ IDl所示。
[0006] 本发明还公开了慢病毒载体Pre-Lenti-EFl-MCS的制备方法,包括以下步骤:
[0007] 步骤1:基因合成EFl-MCS序列,两端设置ClaI和MluI限制性内切酶位点,所述EFl-MCS序列如SEQ ID 2所示;
[0008] 步骤2:用限制性内切酶Cla I和MluI双酶切pLVX-IRES-Puro载体和所述EFl-MCS 序列,分别回收酶切后目的产物;
[0009] 其中,所述EFl-MCS序列可以是直接基因合成得到,也可以是先将基因合成得到 EFl-MCS序列连接到合适的质粒载体中,转入大肠杆菌中体内扩增、双酶切制备得到,还可 以是针对所述EFl-MCS序列设计PCR引物体外扩增,然后双酶切扩增产物得到;
[0010]步骤3:连接步骤2回收获得的酶切后目的产物获得慢病毒表达载体。
[0011 ] 本发明还公开了慢病毒载体Pre-Lenti-EFl-MCS的使用方法,包括下述步骤:
[0012] 步骤1:将目的基因克隆入Pre-Lenti-EF卜MCS载体获得重组慢病毒载体;
[0013] 步骤2:将步骤1获得的重组慢病毒载体和psPAX2和pMD2. OG共同转染宿主细胞; [0014]步骤3:培养宿主细胞,所述宿主细胞优选293或293T细胞;
[0015]步骤4:分离获得重组慢病毒。
[0016]本发明还公开了一种的重组慢病毒载体,该重组慢病毒载体如下方法制备得到: 将针对肿瘤相关抗原(TAA)的CAR基因克隆入如Pre-Lenti-EFl-MCS的多克隆位点处。其中 所述CAR基因识别的肿瘤相关抗原(TAA)选自CD19、CD20、CD22、CD33、CD138、BCMA、CD38、 NKG2D、RORl、间皮蛋白、c-Me t、EGFR、ERBB2、ERBB3、ERBB4、PDGFR、GPC3、PSCA、EpCAM、PSMA、 EGFRvII I、GD-2或其任意组合。
[0017]本发明公开的慢病毒载体Pre-Lenti-EFl-MCS和前述克隆有CAR基因的重组慢病 毒载体适用于制备抗肿瘤药物。
[0018] 本发明还公开了一种测定重组病毒滴度的方法,包括如下步骤:
[0019] 步骤1:慢病毒包装,用前述克隆有针对肿瘤相关抗原(TAA)的CAR基因的重组慢病 毒载体和提供病毒膜蛋白和结构蛋白的包装质粒psPAX2和pMD2. OG共转染宿主细胞,收获 重组病毒;
[0020] 步骤2:制备梯度浓度的DNA样品:按照5-15倍比例梯度浓度稀释步骤1制备得到的 重组病毒,制成3-10组等梯度浓度的重组病毒稀释液,用稀释后的等梯度浓度的重组病毒 稀释液分别感染相同浓度的293或293T细胞并培养,收集等体积经感染和培养的293或293T 细胞分别提取DNA,制3-10组梯度浓度的DNA样品;
[0021] 步骤3:设计荧光定量PCR引物:设计靶向CAR基因胞内段⑶3ζ基因的引物;
[0022] 步骤4:荧光定量PCR方法测定重组病毒滴度:分别取等量步骤2提取的梯度浓度的 DNA样品和步骤3获得的荧光定量PCR引物构建荧光定量PCR扩增体系,相同条件下进行扩 增,分析实验结果,用绝对定量的方法测定重组病毒滴度。
[0023] 本发明提供的慢病毒载体Pre-Lenti-EFl-MCS中设计有能在T细胞高效表达的EFl 启动子,且该载体长度小,经实验验证,由Pre-Lenti-EFl-MCS构建的表达嵌合抗原受体 (CAR)的重组慢病毒载体可大大提高重组病毒滴度(检测可达2xl0 6TU/ml),且不表达GFP等 与治疗无关的标志基因,适用于CAR-T研究和临床应用。
【附图说明】
[0024] 图I :Clontech公司pLVX-IRES-Puro载体图谱
[0025] 图2:本发明构建的Pr e -Len t i -EFI-MCS慢病毒载体图谱
[0026] 图3.CD19CAR基因 PCR产物电泳图,其中,CD19CAR基因:1743bp,
[0027] Marker:1000,2000,3000,4000,5000,6000,8000,1000 Obp
[0028] 图4.菌液PCR鉴定电泳图,其中,CD19CAR基因:1743bp,
[0029] Marker:1000,2000,3000,4000,5000,6000,8000,1000 Obp
[0030] 图5.荧光定量PCR恪解曲线
[0031] 图6.荧光定量PCR扩增曲线
[0032] 图7.CD19CAR-T 的杀伤率 具体实施例
[0033] 实施例1 · CAR-T用慢病毒载体Pre-Lenti-EFl-MCS设计和合成
[0034] 1.1使用Clontech公司的pLVX-IRES-Puro慢病毒载体作为起始载体,pLVX-IRES- Puro大小是8140bp,载体序列见SEQ ID 3,载体图谱见附图1。
[0035] 1 · 2合成EFl-MCS序列(中美泰和生物技术有限公司)
[0036] 使用pDRAW32软件分析pLVX-IRES-Puro载体的序列,发现单酶切位点ClaI (序列 ATCGAT,位置2180)和单酶切位点MluI (序列ACGCGT,位置4049)能够切下起始载体上的CMV+ MCS+IRES+Puro元件(共切下1870bp长度的序列),酶切后载体大小为6270bp。使用EFl启动 子的序列,加上pLVX-IRES-Puro载体的多克隆位点序列,得到序列EF1-MCS,见SEQ ID 2。合 成的EFl-MCS序列,EFl启动子553bp,MCS 38bp,两端分别加上ClaI或MluI的序列。合成基因 全长603bp(中美泰和生物技术有限公司)。
[0037] 1.3酶切pLVX-IRES-Puro载体和含EFl-MCS基因序列的合成载体,酶切体系如下: pLVX-丨RES-Puro 载体或 EFl-MCS 载体 2,ug Cla I (NEB) 2μ1
[0038] MiuI-HF (NEEi) 2μ] Culsmart bulTcr ( NEB ) 5μ1 补水H2O至总体积 5:0μ1
[0039] 反应条件为37 °C水浴,酶切2小时。
[0040] 1.4回收酶切后产物
[00411 使用Biomiga胶回收试剂盒(货号:DC-3511-01)
[0042]胶回收步骤(参照说明书):
[0043] (1).琼脂糖凝胶产物纯化:从凝胶上割下带有目的片段的凝胶块到一个1.5mL或 者2. OmL离心管中,加入1倍体积的Buffer GC,置于55°C水浴中10分钟左右,期间颠倒混匀 几次,直至凝胶块完全溶化。冷却离心管至室温。
[0044] (2).转移以上混合液(每次不超过700μ1)至一个带有收集管的吸附柱中,室温, 13,000Xg离心1分种,弃废液,将离心柱放回收集管中。重复步骤"2",直至剩余的混合液全 部通过吸附柱。
[0045] (3).加入650μ1 DNA Wash Buffer至吸附柱中,室温下13,000 X g离心30秒,倒掉 收集管中的废液,将吸附柱放回到收集管中。重复步骤3。
[0046] (4).室温下,13,000 X g,将吸附柱开盖离心2分钟,去除残留的乙醇。
[0047] (5).转移吸附柱至1.5mL收集管中,加入30μ160Γ预热的Elution Buffer(10mM Tri s-HCl,pH8.5)到吸附柱膜中央,室温放置1分钟。13,000 X g离心1分种以洗脱DNA。如果 想提高收获量,将洗脱液加回到吸附柱中重新洗脱一次。
[0048] 1.5连接反应
[0049]使用Takara的快速连接试剂盒(货号:6022)
[0050]根据载体(酶切过)nmole数:片段(酶切过的目的基因片段)nmole数= 1:3,即:[载 体质量(50ng/100ng)/载体分子质量]X3 =片段质量/片段分子量;其中,载体pLVX-IRES-Puro 8140bp,基因序列EFl-MCS 603bp。
[0051 ]连接体系如下:
)
[0052]
[0053] 按上述内容定量加入各组分至1.5mL离心管中(SolutionI冰上加),充分混勾。16 °C 水浴 30min。
[0054] 1.6转化,涂氨苄平板
[0055] 冰上加感受态50μ1,冰上孵20~30min;42°C水浴90s;冰上2~5min;加500μ1 LB复 苏lh;4000rpm离心5min,留适量上清液50-100μ1重悬,涂板(氨节抗性)。
[0056] 1.7挑克隆,摇菌
[0057]第二天,待克隆长出后,随机挑取几个克隆,于3ml LB液体培养基内摇菌过夜。 [0058] 1.8质粒提取
[0059]使用Biomiga的无内毒素质粒提取试剂盒(货号:PD1220-02)
[0060] (1).取1.7制备得到的菌液。
[0061] (2).室温下10,000Xg离心1分钟,收集菌体,并尽可能的吸去上清。
[0062] (3).加入250μ1 Buffer Al,用移液器或涡流震荡确保细菌沉淀重新悬浮。
[0063] (4).加入250μ1 Buffer BI,轻轻地反转5-10次以混合均匀,然后静置2-5分钟至 溶液由粘稠变澄清。
[0064] (5).加入60μ1 Buffer N3,立即反转5次,用手用力摇晃5次充分混匀,此时出现白 色絮状沉淀。
[0065] (6).将离心管转至高速离心机,在室温下13,000rpm离心10分钟(若上清中仍有白 色沉淀,可再次离心)。
[0066] (7).定量吸取离心后的上清液至新的1.5mL管中,加入1倍体积的Buffer RET,(如 500μ1裂解液加入到500μ1的上清液)及250μ1的100%ethonal,用手用力甩3次以混匀。 [0067] (8).将溶液700μ1转移至带有收集管的DNA柱中,室温下13,000rpm离心20秒,倒掉 收集管中的废液,将离心柱重新放回到收集管中。再重复此步骤至全部溶液转移至DNA柱 中。
[0068] (9).向DNA柱中加入500μ1 Buffer KB,室温下13,000rpm离心1分钟,倒掉收集管 中的废液,将离心柱重新放回到收集管中。
[0069] (10).向离心柱中加入650μ1 DNA Wash Buffer(确保已加入无水乙醇),室温下, 13,OOOrpm离心20秒,倒掉收集管中的废液,将离心柱重新放回到收集管中。重复步骤"10"。
[0070] (11).将离心柱放回高速离心机中,13,OOOrpm室温下开盖离心2分钟,以彻底去除 残留的乙醇。
[0071] (12).将离心柱转至一个新的1.5mL离心管中,向DNA柱的正中间加入100μlEndo-Free Elution Buffer,室温放置1分钟,13 ,OOOrpm离心1分钟,洗脱质粒DNA。将离心管中的 洗脱液再次加到DNA柱的正中间,室温放置1分钟,13 ,OOOrpm离心1分钟,收集洗脱液到同一 个离心管中。
[0072] 1.9测序
[0073] 测序引物如SEQ ID 4所示,测序结果和EFl-MCS合成序列Blast,测序结果完全正 确。至此,构建成功了Pre-Lenti-EFl-MCS载体。Pre-Lenti-EFl-MCS全长序列如SEQ ID 1所 示,载体图谱见附图2,长度为:6867bp,比pLVX-IRES-Puro慢病毒载体小1273bp。
[0074] 实施例2表达CD19CAR慢病毒载体Pre-Lenti-EFl-MCS-CD19的构建
[0075] 2.1.CD19CAR 基因合成
[0076] CD19CAR基因序列如SEQ ID 5所示。
[0077] 2.2引物设计
[0078] 使用PDRAW32软件分析CD19CAR基因序列,发现单酶切位点EcoRI (识别序列 GAATTC)、BamHI (识别序列GGATCC)适合用于基因克隆,能够和Pre-Lenti-EFl-MCS载体的多 克隆位点匹配,设计上、下游引物如下,
[0079] EcoRI-正向引物序列如SEQ ID 6所示;
[0080] BamHI-反向引物序列如SEQ ID 7所示。
[0081] 2.3PCR扩增:收到合成的序列和引物后,进行PCR扩增,反应体系见下(使用Toyobo 的高保真KOD Fx酶), 2XPCR buffer for KOD Fx 25μI 2m MdN TP ΙΟμΙ IOmM Primer il. |i-'J 1.5 μ I IOmM Primer ,丨乂向 1,5μ1
[0082] .、 CD 19 CAR Template ΙμL i. 50ng/uL· KOD FX ΙμL _H1O_IOul 总体积 50μ]
[0083] 反应程序为 1: 94Γ 2min 步骤 2: 98 Γ IOsec 步骤 3: 50°C 30sec Γ ? 步骤4: 68°C 2min进入步骤2 重复5个循环
[0084] 丄 # 步骤 5: 98 〇C IOsec 步骤 6: 60Γ 30scc 步骤7: 68 °C 2min进入步骤5 重复30个循环 少骤 8: 68°C IOmin
[0085] 步骤 9: 4°C Ih
[0086] PCR产物电泳见附图3。
[0087] 2.4酶切
[0088] 酶切反应体系如下: Pre-Lcmi-EFI-MCS 载体或 CDl9 CAR 基因 PCR 产物 2f.ig EcoRI-HF (NEB) 2μΙ
[0089] BamHI-HF (NEB) 2μΙ CutsmartbulTer (NEB) 5μΙ 补H2O至总体积50μΙ
[0090] 反应条件为37 °C水浴,酶切2小时。
[0091] 2.5回收酶切后产物,使用別〇11^8&胶回收试剂盒(货号:0(:-3511-01),步骤同前 Pre-Lenti-EFl-MCS 载体构建。
[0092] 2.6连接反应,操作同前Pre-Lenti-EFl-MCS载体构建。
[0093] 2.7转化,涂氨苄平板,操作同前Pre-Lenti-EFl-MCS载体构建。
[0094] 2.8挑克隆,摇菌,PCR鉴定,引物为克隆所用引物,反应条件同前2.3PCR扩增,实验 结果见附图4。
[0095] 2.9质粒提取,使用Biomiga的无内毒素质粒提取试剂盒(货号:PDl220-02),步骤 同前Pre-Lenti-EFl-MCS载体构建。
[0096] 2.9测序
[0097] 测序引物为:Pre-up-Seq如SEQ ID 8所示;Pre-down-Seq如SEQ ID 9所示;
[0098] 测序结果经和⑶19CAR基因比对,完全正确。至此,得到⑶19CAR慢病毒载体Pre- Lenti-EFl-MCS-CD19。
[0099] 实施例 3 · Pre-Lent i -EFI-MCS-CD19 慢病毒包装
[0100] 3.1慢病毒包装遵循常规方法,大致如下:
[0101] 3. 1 · 1细胞培养293T细胞培养于37°C,5%C02孵箱内,培养基为DMEM/High Glucose/10%FBS〇
[0102] 3.1.2种植细胞包装病毒前一天,胰酶消化293T细胞,5 X IO6细胞/孔种植IOcm培 养皿,准备包装Pre-Lenti-EFl-MCS-CD19慢病毒。
[0103] 3.1.3细胞转染细胞转染时,除了使用Pre-Lenti-EFl-MCS-CD19质粒外,每种质粒 还需要和包装质粒(提供病毒膜蛋白和结构蛋白)psPAX2、pMD2. OG共转染。其中
[0104] Pre-Lenti-EFl-MCS-CD19 使用 5yg,psPAX2 使用 3.75以8印]\?2.06使用1.25以8。转染 时,将以上三种质粒的混合物加入500μ1 MEM培养基内,在另一个微型离心管内将25μ1
[0105] Lipofectamine 2000转染试剂加入500μ1 MEM培养基内,然后,将稀释后的转染试 剂加入稀释后的质粒上方,混匀,离心,室温静置20分钟;时间到后,将质粒和转染试剂的混 合物加入IOcm培养皿内,摇晃、混匀,放入孵箱。
[0106] 3.1.4收获病毒细胞转染3天后,可以收获病毒,将9ml含病毒培养基转入50ml离心 管内,4°C,1500rpm,离心5分钟,去除死亡的293T细胞,然后,将含病毒培养基过滤分装,-80 °C冻存。
[0107] 实施例4.荧光定量PCR测定病毒滴度
[0108] 4.1测定前一天,种植293T细胞至24孔板,2 X IO5个细胞/孔,一种病毒准备4个孔;
[0109] 4.2第二天,感染病毒;
[0110] 首先10倍比例系列稀释病毒,具体为首先在1.5ml离心管准备180μ1细胞培养基, 第一管内加入20μ1病毒原液,吹打混匀,移出20μ1稀释后的病毒液至第二管,吹打混匀,依 次往后稀释,得到的每管内的病毒液为20μ1、2μ1、0.2μ1、0.02μ1,吸掉24孔板内培养基,加 入稀释过的病毒液;C〇2孵箱培养72h;
[0111] 4.3DNA提取(组织/细胞基因组DNA快速提取试剂盒,博迈德生物技术有限公司), 参照说明书,简要步骤如下,
[0112] 收集IO5-IO6细胞到1.5ml离心管中,13000rpm离心10秒,使细胞沉淀下来,弃去上 清,加200μ11 X PBS重悬洗涤,13000rpm离心10秒,弃上清,180μ11 X PBS重悬,加入4μ1 RNaSeA(10mg/ml)溶液,振荡15秒,室温静置5min,再加入20μ1蛋白酶k( 20mg/ml)溶液充分 混匀,然后加入200μ1结合液CB,立即涡旋振荡混匀,在70°C放置10分钟,冷却后加 100μΙ异 丙醇,立即涡旋振荡混匀,将混合物加入吸附柱AC中,吸附柱放入收集管中,13000rpm离心 60秒,倒掉收集管废液,加入500μ1抑制物去除液IR,12000rpm离心30秒,弃废液,再加入500 μL漂洗液WB,12000rpm离心30秒,洗2次,再将吸附柱放回空收集管,13000rpm离心2分钟,尽 量去除漂洗液,取出吸附柱AC,放入干净离心管中,在吸附膜中间部位加入100μΙ洗脱缓冲 液EB(先70°C水浴中预热),室温放置3-5分钟,12000rpm离心1分钟,将所得液体再加入吸附 柱中,室温放置2分钟,12000rpm离心1分钟,收DNA。
[0113] 4.4荧光定量PCR
[0114] 4.4.1设计荧光定量PCR引物,锚定CD19CAR基因的0)3ζ链,产物164bp,
[0115] ⑶3ζ-正向引物如SEQ ID 10所示,⑶3ζ-反向引物序列如SEQ ID 11所示。
[0116] 4.4.2用THUNDERBIRD SYBRqPCR Mix(Toyobo)进行扩增,实验操作按产品说明书 进行,反应体系为: 灭菌蒸馏水 8μ1 THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix ΙΟμΙ CD3C-正向引物 ()·5μ1 C〇117] 033ζ-反向引物 0.5μ1 DNA ! μ! 总体积 20μ!
[0118]扩增程序:95£€6〇8〇。,(95。(:1586。,60。(:1586。,72 1€4586。)\40个循环,
[0119]熔解曲线如附图5所示。
[0120] 扩增曲线如附图6所示。
[0121] 4.4.3标准曲线和滴度计算:
[0122] 标准曲线样品用Pre-Lenti-EFl-MCS质粒换算为拷贝数,根据质粒浓度和分子量 将样品稀释成4000拷贝数/μ1、400拷贝数/μ1、40拷贝数/μ1、4拷贝数/μ1、0拷贝数/μL,具体 如下表:
[0124] 表1标准曲线样品Ct值和病毒拷贝数对应表
[0125]测算测定病毒的滴度方法,具体为:20μ1的ct均值为22.46,将该值代入γιο . 371 x+11. 98 得4 .01, 4X1O4·01 =41510.8, 就说明 20μ1 病毒感染的该孔中拷 贝数为 41510.8,10μ1就有20755.4个拷贝,所以该病毒滴度就是2.1 X IO6Ail.取平均值为2.25 X IOfVml,即包装所得Pre-Lenti-EFl-MCS-CD19
病毒的滴度为2.25 X 106pfu/ml。
[0127] 表2标准曲线样品Ct值、病毒拷贝数和病毒滴度对应表
[0128] 实施例5.⑶19CAR-T制备和杀伤实验
[0129] 5 .IPBMCs 分离
[0130] (1)抽血:在无菌的条件下抽取人体的静脉血。
[0131] (2)稀释:将获得的血液用相同体积的1640培养基(RPMI Medium Modified)稀释。
[0132] (3)在离心管中加入血液稀释完后的体积的二分之一的"人淋巴细胞分离液" (Human Lymphocyte Separation Medium,达科为生物工程有限公司)。
[0133] (4)用移液枪将血液贴壁缓慢的加入到离心管中,保证血液在分离液的上层。
[0134] (5)将离心管放入低温高速离心机中以700g在22°C下离心25分钟。使得血液在分 离液中发生分层。
[0135] (6)淋巴细胞在组织匀浆层和分离液之间的白膜层中,
[0136] (7)用84滴管尽量将白膜层吸到另一支离心管中。注意不要吸到分离液。
[0137] (8)将离心管放入低温高速离心机中以250g在22°C下离心10分钟。
[0138] (9)吸掉上层的液体,用加人白介素 -2(IL2)的含灭活血清的1640培养基重悬,计 数。
[0139] 5.2T细胞纯化
[0140] (1)将分离出来的淋巴细胞计数,取个淋巴细胞于微型离心管中。
[0141] (2)将微型离心管放入低温高速离心机中以250g在22°C下离心10分钟。
[0142] (3)吸除上层液体,并用80μ1磁珠分离缓冲液重悬,并加入20μ1的CD3Micr〇BeadS。
[0143 ] (4)在4 °C的冰箱中放置1小时,并将磁体放入生物安全柜中灭菌。
[0144] (5)1小时之后在微型离心管中加入ImL的缓冲液。再在低温高速离心机以317g,在 5 °C离心10分钟。此时准备过滤柱子,将过滤柱安放在磁铁上,用500μ1的缓冲液洗,缓冲液 随着重力向下流。
[0145] (6)离心弃上清,细胞用500μ1的缓冲液重悬,并加入柱子,下面用离心管接收废 液。缓冲液随着重力向下,并用500μ1的缓冲液冲洗四次。
[0146] (7)冲完之后,将柱子从磁铁上取下来,并用ImL缓冲液将T细胞冲下来。
[0147] (8)将冲下来的细胞在低温高速离心机以317g,在5°C离心10分钟。
[0148] (9)最后用加了 IL2的含灭活血清的1640培养基重悬,计数。
[0149] 5.3T细胞慢病毒感染
[0150] (1)将纯化的T计数,I X IO6个T细胞/孔(6孔板)种植,培养过夜后,加入MOI为2的 对照病毒液(空载体包装,Control)和Pre-Lenti-EFl-MCS-CD19病毒液,感染过夜。
[0151] (2)感染第二天,加入1ml新鲜培养基。
[0152] (3)感染后第三天,T细胞已充分活化,增殖旺盛,此时将T细胞转入25cm2小培养 瓶。
[0153] (4)感染5天后,进行杀伤实验。
[0154] 5.4杀伤实验
[0155] (1)计数表达CD19分子的Raji细胞,IX IO4个Raji细胞/孔(96孔板);计数病毒感 染的T细胞(Control病毒液感染的Control T细胞和Pre-Lenti-EFl-MCS-CD19病毒感染的 ⑶19CAR-T细胞),按照效靶比10:1,5:1,2.5:1的比例加入Raji细胞上层,实验设计如下表:
[0157] 表3杀伤实验设计表
[0158] 5.5杀伤测量
[0159] 使用Promega试剂盒(CytoTox 96非放射性细胞毒性检测,货号:G1780)通过测量 死亡细胞的LDH酶得到CAR-T细胞杀死Ra j i细胞的百分率。操作照试剂盒说明书,
[0160] (1)杀伤实验进行4小时后,最大释放孔加入试剂盒提供的10 X细胞裂解液。
[0161] (2) 2小时后,每孔取50μ1上清,加入50ylLDH反应底物,反应20分钟后,于酶标仪测 量492nm处吸光度0D492。
[0162] 5.6杀伤率计算
[0163] 按照公式" %细胞毒性=[(实验-效应细胞自发-靶细胞自发)/(祀细胞最大-靶细 胞自发)]X 1〇〇"计算杀伤率,其中实验孔为不同效靶比得到的0D492,效应细胞自发为 Control T细胞或CD19CAR-T细胞单独的0D492,靶细胞自发为Raji单独(最小释放),靶细胞 最大为Raji单独(最大释放)。计算得到的杀伤率见附图7,表明我们构建的Pre-Lenti-EFl-MCS-CD19载体能够成功地包装为慢病毒,制备CAR-T,具有杀伤功能,完全能够满足CAR-T研 究和应用的需要。
[0164] 序列表 <110>北京普瑞金科技有限公司、普瑞金(天津)生物技术有限公司 <120>用于CAR-T制备的慢病毒载体及其构建方法和应用 <130、 2016 <160> 11 <170, PalcnlIn version 3.5 <2i0> I <211> 6266 <212> DNA <2丨3>人丨:合成 <400> 1 tggaagggct aattcactcc caaagaagac aagatatcct tgatctgtgg atctaccaca 60 ckckaggeta cttccctgat tagoagaaet acacaccagg geeaggggtG agatatc€ac 120 tgaeetttgg atggtget汍e aagctagtac eagttgagcc agataaggta gaagaggcca 180 ataaaggaga gaacaccagG ttgttacacc Ctgtgageet gcatgggatg gatgacccgg 240 agagagaagt gttagagtgg aggtttgaea gG€g:eetagc atttcateae gtggeeegag 3〇Q agctgcatee ggagtacttc aagaactgct gat ate gage ttgctacaag ggactttccg 360 C 112 I; Si' SI C ? t t C C LI Li, 12 cl 12, U C t ii, C C t ii, Li C ii, Π C t ii, Li, 12 ? t ii, C I; i\ C C C t C Π cl t 42 0 cctgcatata agcagctgct ttttgcctgt actgggtctc tctggttaga ccagatctga 480 gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta agcctcaata aagcttgcct 540 tgagtgettc aagtagtgtg tgcecgtetg ttgtgtgact c'tggtaacta gagatcoctc 600 agaccGtttt agteagtgtg gaaaatGtct agcagtggcg eecgaacagg gaGttgaaag 660 Cgaaagggaa aceagaggag etctctegae geaggactcg gettgctgaa gcgcgcaegg 720 eaagagggga ggggeggcga Gtggtgagta cgqcaaaaat tttgactage ggaggctaga 78 0 aggagagaga tgggtgcgag age;g:tc:agta 11a:ageggg.g gagaattaga tcgcgatggg 840 aaaaaatteg gnaaggcca gggggaaciga a a a cUitataa attaaa;icar atagtcUgug 900 caagcaggga gctagaacga ttcgcagtta atcctggcct gttagaaaca tcagaaggct 960 gtagacaaat actgggaeag ctacaaecat ccetteagac aggatcagaa gaacttagat IQ20 cattataiaa; tacagtagca accctctatt gtgtgcatca aaggatagag ataaaagaca 1080 ccaaggaagc tttagacaag atagaggaag agcaaaacaa aagtaagacc accgcacagc 1140
[0165] aagcggecgg ccgctgatct tcagaccigg aggaggagat atgagggaca attggagaag 1200 tgaattatat aaatataaag tagtaaaaat tgaaccatta ggagtagcac ccaccaaggc 1260 aaagagaaga gtggtgcaga gagaaaaaag agcagtggga ataggagctt tgttccttgg 1320 gttcttggga gcagcaggaa gcactatggg cgcagcgtea atgacgctga cggtacaggc 1 38:0 cagacaatta ttgtctggta tagtgcagca gGa.gaacaat ttgetgaggg ctattgaggc 144U gcaacagcat ctgttgcaac tcacagtctg gggcatcaag cagctccagg caa^aatcct 1500 ggctgtggaa agatacctaa aggatcaaca gctcctgggg atttggggtt gctctggaaa 1560 actcatttgc aceactgctg tgcettggaa tgctagttgg agtaataaat ctctggaaca 1620 gatttggaat caeaegaect ggatggagtg ggaeagagaa attaaeaatt aeacaagett 1680 aatacactcc ttaattgaag aatcgcaaaa ccagcaagaa aagaatgaac aagaattatt 1740 :gga at tag at a a a t gg g c aa grttgtggaa ttggtttaaG ataacaaatt ggctgtggta 1800 tataaiaatta ttcataatga tngtaggagg cttggtaggt ttaagaatag tttttgctgt 1860 actttctata gtgaatagag ttaggcaggg atattcacca ttatcgtttc agacceacct 1920 cccaaccccg aggggacccg ncaggcccga aggaatagna gaagaaggtg gagagagaga I 9S0 c a g a g i\ c a g n tccattcgat tagtgaacgg atctcgacgg tatcgccttt a a a a g a i\ a a g 2()40 gggggatigg ggggraciigt gdggggiiwi CiUiUHMgCii iicagitcnrHc 2 I 00 aaactaaaga attacaaaaa caaattacaa aaattcaaaa ttttcgggtt tattacaggg 2160 acagcagaga tccagtttat cgatgttctt tttcgcaacg ggtttgccgc cagaacacag 2220 ctgaagcttc gaggggctcg catctctcct tcacgcgccc gccgccctac ctgaggccgc °280
[0166] catccacgcc ggttgagtcg cgttctgccg cctcccgcct gtggtgcctc ctgaactgcg 2340 tccgccgtct aggtaagttt aaagctcagg tcgagaccgg gccttigtcc ggcgctccct 2400 tggagcctac ctagactcag ccggctctcc acgctttgcc tgaccctgct tgctcaactc 2460 tacgtctltu tttcgttttc tgttctgGge cgttaciagat ccaagctgtg accggcgcct 2520 acgctagacg aattcctcga gaetagttct agagcggccg cggatccacg cgtgcctcga 2580 etgtgeette tagttgecag ecatctgttg tttgcccctc ecccgtgcct tecttgaecc 2640 tgg.aaggtge cacteGeaet gtcctitcct aataaaatga gga:aattgca tegcattgtc 2700 tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacageaag ggggaggatt 2760 gggaagacaa tagcaggcat gctggggact gicagtcgaga cctagaaaaa eatggagcaa 2:820 tcacaagtag eaatacagca: gctaccaatg ctgattgtgc ctggctagaa gcacaagagg 2880 aggaggaggt gggtttteca gteaeacetc aggtaccttt aagaecaatg acttacaagg 2940 cagctgtaga tcttagccac tttitaaaag aaaagagggg actggaaggg ctaattcaet 3000 CGcaaegaag aGaagatatc cttg:atctgt ggat<itaee3 Caeacaaggc tacttccctg 3060 attagcagaa ctacacacca g;gg:Geagggg tcagatatcc actgaeGttt ggatggtgct 3120 acaagctagt accagttgag ccagataagg tagaagaggc caataaagga gagaacacca 3180 gctigttaca ccctgtgagc ctgeatggga tggatgaccc ggagagagaa gtgttagagt 3240 ggaggtttga cagccgccta gcatttcatc acgtggcccg agagctgcat ccggagtact j300 tGaagaactg ctgatatcga gcttgctaca agggactttc cgctggggac tttccaggga 3 360 ggcgtggcct gggcgggact ggggagtggc gagccctcag atcctgcata taagcagctg 3420 ctttttgcct gtactgggtc tctctggtta gaccagatct gagcctggga gctctctggc 3480
[0167] taactaggga acccactgct taagcctcaa taaagcttgc cttgagtgct tcaagtagtg 3540 tgtgcccgtc tgttgtgtga ctctggtaac tagagatccc tcagaccctt ttagtcagtg 3 600 tggaaaatct ctageagtag tagttxatgt catettatta ttcagtattt ataacttgca 3 660 aagaaatgaa tatcagagag tgagaggcct tgacattgct agcgtttacc gtcgacctct 3 720 agctagagct tggegtaatc atggtcatag ctgtttcctg tgtgaaattg ttatccgctc 3 7^0 acaattccac acaacatacg agccggaagc ataaagtgta aagcctgggg tgcctaatga 3 840 gtgagctaac tcacattaat tgcgttgcgc tcactgcccg ctttccagtc gggaaacctg 3900 tcgtgccagc Tgcattaatg aatcggcqaa cgcgcgggga gaggcggttt gcgtatiggg 3960 cgctcttccg Gttcctegct c-aGtgaetcg Ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg 4020 gtatcagctc actcaaciggc ggtaatacgg iratccaca^ aarcagggga taacucagga 4080 aagaacatgt gagcaaaagg ecagcaaaag gccaggaaec gtaaaaagge egcgttgctg 4140 gcgtttttpc nraggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgiicg crcaagtcag 4200 aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttGGccctgg aagctccctc 4260 gtgcgctctc cfgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg 4320 ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc tgtaggt:atc tcagttcggt gtaggtcgtt 438Θ cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaecc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc 4440 ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgaet tatcgccact ggcagcagcc 4500 actggrnaca ggattagcag ngCLUiggrat gtaggcggtg ctacagagtr cttgaagtgg 45 60 tggcctaact ncggctacac t a g a n g a a c a gtatttggra tctgcgcrcr gctgaagccn "
[0168] gttaccttCg. gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc 4680 ggtggttttt ttgtttgcaa geageagatt acgegcagaa aaaaaggate tcaagaagat 4740 cctttgatct tttctacggg gtctgacget cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt 4800 ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc aectagatcc ttttaaatta aaaatgaagt 4860 tttaaatca珠 tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg acagttacca atgcttaatc 4920 ag t g a g g c a ο ct at etc age gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc ctgactcccc 4980 gtcgtgtaga taactacgat acgggagggG ttaecatctg gc-c-c-c;agtg:c· tgcaatgata 5040 CGgGgagaGG Gacgctcacc ggctccagat ttatcagcaa taaacoagcc agccggaagg 5100 gccgagcgca gaagtggtec tgcaacttta tccgcctcca tccagtctat taattgttgc 5160 cgggaagcta gagtaagtag ttcgccagtt aatagtttgc gcaacgttgt tgccattgct 5.2.20- acaggcatcg tg.gtgtca.cg ctcgtcgtn ggtatggctt eatteagetc cggttGccaa 5280 cgateaaggG g a g 11 a c at g at c c c c G a tg; 11 g:t:g;c a a a a aageggttag ctcctteggt 53 40 cctccgatcg: ttgtcagaag taagttggGe gGagtgttat cactcafggt latggcagca: 5400 ctgeataatt ctettactgt eatgceatee gtaagatget tttctgtgac tg:gtga:g;tae 5460 tcaaccaagt cattctgaga atagtgtatg Qggcgac.ega gttgctcttg c.ccggcgtca 5520 ataegggata ataccgcgcc acatagpaga actttaaaag tgctcatcat tggaaaa.egt 5580 tcttcggggc gaaaactctc aaggatctta ccgctgttga gatccagttc gatgtaaccc 5fi40 actcgtgcac ccaactgatc ttcagcatct tttactttca cca.gcgtttc tgggtgagca 5700 aaaacaggaa ggcaaaatgc cgcaaaaaag ggaataaggg cgacacggaa atgttgaata j 760 ctcatactct tcctttttca atattattga agcatttatc agggttattg tctcatgagc 58,0
[0169] ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc 5S80 cgaaaagtgc cacctgacgt cgacggatcg ggagaicaac ttgtttattg cagcttataa 5940 tggitacaaa taaagcaata gcatcacaaa tttcacaaat aaagcatttt tttcactgca 6000 ttctagttgt ggtttgtcca aactcatcaa tgtatcttat catgtctgga tcaactggat 6060 aactcaagct aaccaaaatc atcccaaact tcccacccca Iaccctatta ccactgccaa 6120 ttacctgtgg tttcatttac tetaaaeetg tgattcctct gaattatttt eattttaaag 61 8 0 aaattgtatt tgttaaatat gtactacaaa cttagtagtt tttayagaaa ttgtatttgt 6°40 taaatatgta ctacaaactt agtagt 6266 <210> 2 <211> 383 <'212> DNA <213>人工合成 <400> 2 gttctttttc gcaacgggtt tgeegccaga aCacagctga agcttcgagg ggctcg-catc 6Q tetGctteac gegcecgceg cectacctga ggccgecatc eacgGCggtt gagtcgcgtt 12D ctgccgcetc ccgcctgtgg tgcctGCtga actgcgtccg ccgtctaggt aagtttaaag 18:0 ctcaggtcga gaccgggcct ttgtceggeg efeGcttgga gGctacetag aetcageGgg 140 ctctccacgc tttgectgaG cctgcttgct caactctacg tcUlgtttc gttttGtgtt 3 00 ctgcgecgtt acagatecaa gctgtgaecg gcgcctacgc tagacgaatt cctcgagact 360 agttctagag cggccgcgua toe 383
[0170] <210> 3 <211> 8140 <212> DNA <2]3>人工合成 <400> 3 tggaagggct aattcactGC caaagaagac aagatatcct tgatctgtgg atctaecaca 60 caca n ggcta cttcc: c:tgat trnzcngaa ct acacnccagg gcc^ggggtc ajzatntcciic 12D IgaGGtttgg atggtgctac aagctagtac cagttgagcc agataaggta gaagaggcca 180 ataaaggaga gaacaccagc ttgttacacc ctgtgagcet gcatgggatg gatgacccgg 240 agagagaagt gttagagtgg aggtttgaca gccgcctagc atttcatcac gtggcccgag 300 agctgcnrcc ggagracrtc aagaactuct i]atatcgagc trgctncaag gyactttccg '()() ctggggdctt tecdgggdgg cgtggcctgg gcgggactgg ggagtggcga gccctcagat 420 cctgcatata agcagctgct ttttgoctgt aetgggtctc tctggttaga oeagatotga 48G gcctgggagc tctetggGta actagggaac ccactgetta agcctcaata aagcttgcct 54Q tgagtgcttc aag:t:ag.tgtg ';t.g,cecg:t.etg ttgtgtgaGt ctggtaacta gagatGCetc 600 agaecctttt ag:te:ag:tgtg gaaaatctct agca:gtg;geg ecegaacagg gacttgaaag 060 egaaagggaa aceagaggag ctetctcgae gcaggaetpg gcttgetgaa g.cgc-gcacgg 720 Gaagaggcga ggggcggcga etggtgagta cgccaaaaat tttgactagc ggaggctaga 780 tgggrgcg:ig agcgtcagta ttaniiciiggg gamuUtagn tcucgntggg 840 aaaaaattcg gttaaggcca gggggaaaga aaaaatataa attaaaacat atagtatggg 900 ca ag c a g g g a g c t a g a a e g a ttegeagtta atectggcct gttagaaaca tcagaaggct 960 gtagacaaat actgggacag ctacaaccat cccttcagac aggatcagaa gaacttagat 1020
[0171] cartatataa tacagtagca accctcratt grgtgcatca aaggatagag ataaaagaca 108U ccaaggaagc tttagacaag atagaggaag agcaaaacaa aagtaagacc accgcacagc 1140 aagcggcegg ccgctgatet tcagacctgg aggaggagat atgagggaca attggagaag :1200 tgaattatat aaatataaag tagtaaaaat tgaaccatta ggagtagcac ccaccaaggc I 26:0 aaagagaaga gtggxgcag-.a gagaaaaaag ageagtggga ataggagctt tgttccttgg 132U gttcttggga gcagcaggaa gcactatggg cgcagcgtca atgacgctga cggtacaggc [3 80 cagacaatta ttgtctggta tagtgcagca gcagaacaat ttgctgaggg ctattgaggc 1440 gcaacagcat ctgttgcaac tcacagtctg gggcatcaag cagctccagg caagaatcct 1500 ggctgtggaa agatacctaa aggatcaaca gctcctgggg atttggggtt gctctggaaa 1560 aotcatttgc accactgctg tgccttggaa tgctagttgg agtaataaat ctetggaaea 1620 gatttggaat cacacgacct ggatggagtg ggacagagaa attaacaatt aGacaagett 1680 aataeaetec ttaattgaag aatcgcaaaa ceagcaagaa a^gaaigaae aa^aaiiatt 1740 g g a a t ? ag at an atgggcaa gtttgtgga a rtggtrtnac ataacaaatt ggctL'tggta 1800 tataaaatta ttcataatga tagtaggagg cttggtaggt ttaagaatag tttttgctgt 1860 acttictata gtgaatagag ttaggcaggg atattcacca ttatcgtttc agacccacct 1920 ccciinccccg ^ggggacccg ncaggcccgn itggitatng;in gniignHggtg gngiigngii^a 1980 CMgiigacaga tccattcgnt tagtgaacgg atctcgacgg tatcgccttt a a m Mga a a ag 2040 gggggattgg ggggtacagt gcaggggn a a gnara graga cataatagcii acagacatac 2100 aaactaaag:a attacaaaaa caaattataa aaatteaaaa ttttcgggtt tattacaggg 2160
[0172] acagcagaga tccagttiat cgataagett gggagttccg cgttacataa cttacggtaa 2.220 atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg 2280 ttcccatagt aaGgccaata gggactttcc attgacgtca atgggtggag tatttacggt 2340 aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcG aagtaGgccc cctattgacg 2400 teaatgacgg taaatggcee gcctggcatt at:g;cccagt:a catgacctta tgggactttc 2460 ctaettggca gtacatetac g t a t ? a g t c a t:c g c t a 11 a c catggtgatg cggttttgge 2520 agtaeatcaa tgggcgtgga tageggtttg actcacgggg; atttecaagt ctceaeeeea 25 80 ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaaeg g.gaetttcCa aaatgtegta %640 acaactcGgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa 2700 gcagagctcg tttagtgaac cgtcagatcg cctggagacg ceatecacgc tgttttgacc 2760 tceatagaag acaccgactc taetagagga tctatttccg gtg a attest cgagactagt 2B20 tctagagcgg CCgCggatGC cgecGCtctc eetcee.ccGC ecctaacgtt actggccgaa 2§ SG gcegattgga ataaggccgg tgtgGgirtg tetaMt'gtt attttGcacc atattgecgt 294 O ettttggcaa tgtgagg:gCe cggaaaeetg gecctgtctt ettgacgagc attcetaggg 3U00 gt;ctttc:e;ec: tctcgccaaa ggaatgcaag gtctgttgaa tgtcgtgaag gaagoagttc J060 ctctggaagc ttcttgaaga caaacaacgt ctgtagcgac cctttgcagg cagcggaacc 3 120 ccccacctgg cgacaggtgc ctctgcggcc aaaagccacg tgtataagat acacctgcaa 3 ISO aggcggcaca accceagtgc eacgttgtga gttggatagt tgtggaaaga gtcaaatggc 3240 tctcctcaag cgtattcaac aaggggctga aggatgecca gaaggtacce Gattgtatgg 3300 gatctgatct ggggcctcgg tgcacatgct ttaeatgtgt ttagtcgagg ttaaaaaaac 33i>0
[0173] gtcraggccc cccgaaccac ggggacgtgg ttttcctttg aaaaacacga tgataagctt 1420 gccacaaccc acaaggagac: gaccttccat gaccgagtac aagcccacgg tgcgcctcgc 3480 cacccgcgac gacgtccccc gggccgtacg caccctcgcc gccgcgttcg ccgactaccc 35:40 cgccacgcgc cacaccgtcg acccggaccg ccacatcgag cgggtcaccg agctgcaaga 360:0 actcttcctc acgcgcgtcg ggotcgaeat :eggcaaggtg tgggtcgcgg acgacggcge 3660 cgcggtggcg gtctggacca cgccggagag cgtcgaagcg ggggcggtgt tcgccgagat 37^0 cggcccgcgc atggccgagt tgagcggttc ccggctggcc gcgcagcaac agatggaagg 3780 cctectggcg ccgcaccggc ccaaggagcc cgcgtggtic ctggccaccg tcggcgtctc 3 840 gcccgaccac cagggcaagg gtctgggcag cgccgtcgtg ctccccggag tggaggcggc 3900 cgagcgcgcc ggggtgcccg octtcctgga gacctccgcg ccccgcaaec tccccttcta 3960 ggcttcacGg tc;acegG€ga cgtcgaggtg cccgaaggae cgcgeaGCtg 4020 gtgcatgacc cgcaagcccg gtgcctagac gcgtctggaa caattaacct ctggattaca 4080 aaatttgtga aagattgaet ggtattctta actatgttgc tccttttacg ctatgtggat 4140 acgctgcttt aatgcctttg tatcatgcta ttgcttcccg tatggctttc attttctcct 4200 ccttgtataa atcctggttg ctgtctcttt atgaggagtt gtggcccgtt gtcaggcaac 426Θ gtggcgtggt gtgcactgtg tttgctgacg caacccccac tggttggggc attgccacca 4320 cctgtcagct cctttccggg actttcgctt tccccctccc tattgccacg gcggaactca 4380 tcgccgcctg ccttgcccgc tgctggacag gggctcggct gttgggcact gacaattccg 4440 tggtgttgtc ggggaagctg acgtcctttc catggctgct cgcctgtgtt gccacctgga 4500
[0174] ttctgcgcgg. gacgtccttc tgctacgtcc ettcggccct caatccagcg gaccttectt 4560 cccgcggcct gctgccggct ctgcggcctc ttccgcgtct tcgccttcge cctcagacga 4620 gtcggatctc cctttgggcc gcctccccgc ctggaattaa ttctgcagtc gagacctaga 4680 aaaacatgga gcaatcacaa gtagoaatac agcagctacc aatgctgat.t gtgcctggct 4740 agaagcacaa gaggaggagg ^ggtgggttt tGcagt;cae:a cctcaggtac ctttaagaeG 4800 aatgacttae aaggGagctg tagatcttag CGaGttttta aaagaaaaga ggggactgga 4860 agggetaatt cactcccaac g a a: g a: c a a g a t at e e 11: g a t etgtggatct aecacacaca 492.0 aggetaettc cctgattagc agaactacac aGcagggcca ggggrcagat atccactgac 4980 Ctttggatgg tgetaeaagG tagtaccagt tgagccagat aaggtagaag aggccaataa 5040 aggagagaac accagcttgt tacaccctgt gagcctgcat gggatggatg acccggagag 5100 agaagtgtta gagtggaggt ttgacagecg cctagcattt catcaegtgg eccgagagct 516:0 gcatc:G:ggag t:aettcaaga actgctgata tGgagcttgc tacaagggac tttccgctgg 5220 ggaetttcca gggaggcgtg gcetgggegg gaetggggag tggcgageco tcagatcctg 5280 eatataagea getgcttttt gcctgtactg ggtctctctg gttagaccag atct.gagect 5340 ggg.ag:ct.ctc tgg.etaaqta gggaacccac tgettaagce tcaataaage ttgcGttgag 5400 tgcttcaagt agtgtgtgcc cgtctgttgt gtgactctgg taactagaga tccctcagac 5460 ccttttagtc agtgtggaaa atctctagca gtagtagttc atgteatett attattcagt 5520 Rtttaraact tgcaaagaaa tgaatatcag agagtgagag gccttgacat tgctagcgtt 5580 taccgtcgac etctagctag agcttggegt aatcatggtc ata-gctgttt cctgtgtgaa 5640 attgttatcc gctcacaatt ccacacaaca tacgagccgg aagcataaag tgtaaagcct 5700
[0175] ggggtgccta atgagtgagc taacrcacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc 5760 agtcgggaaa cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg 5820 gtttgcgtat tgggcgctet tecgcrtcct cgcteactga cfGgGtg:cg:e tcggtcgttc 5 8 80 ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc acagaatcag 5940 gggaiaacge aggaaagaac atgigagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa 6000 aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc 6060 gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc 6120 ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg 6180 cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt 6240 cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc 6300 :gGtg;Ggcctt atGGggtaac tatcgtettg agtccaaccc ggiaagacac 孩acttategci 6360 eactggcagc agccactggt aacaggatta ^cagagcgag gtatgtagg::e: ggt<r ctacag 6420 agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag aacagtattt ggtatctgcg 6480 ctctgctgaa gccagttacc trcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc gucaaiiiCLUiia 6540 ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag 6600 gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact 6660 cacgttaagg gattttggtc atgagattat caaaaaggat cttcacctag atccttttaa 6720 attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt 67 80 accaatgctt aatcagtgag gcacctatct eagcgatctg tctatttcgt tcatccatag 6840
[0176] ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga gggcttacca tctggcccca 6900 gtgctgcai\t gataccgcga gacccacgct caccggctcc agatrtatca gcaataaacc 6960 agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt 7020 etattaattg ttgccgggaa getagagtaa giagttc:gce agttaatagt ttgcgcaacg 7080 ttgttgceait tgctacaggc atcgtggtgt cacgctcgtc gtttggtat.g gcttcattca 7140 geteeggttc ccaacgatca aggcgagtta catgatccec catgttgtgc aaaaaagegg 7200 ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtea gaagtaagtt g gccg c a gt g tt ate a etc a 7260 tggttatggc agcactgcat aattctctta ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg 7320 tgactggtga giactcaacc aagtcaitct gagaatagtg t.atgeggcga ccgagttgct 7380 cttgcccggc gtcaatacgg gataataccg cgccacatag cagaacttta aaagtgctca 7440 teattggaaa acgttctteg ggg.cgaaaaG tctcaaggat cttaeegetg ttgagatoca 7500 gttcgatgta acccactcgt gcacce:aact gatgHqage atcttttact ttcaccagcg 7560 tttGtgggtg agcaaaaaGa g;gaagg:eaaa atgGcgqaaa aaagggaata ag:ggegacae 7620 ggaaatgttg aaiacUrata Qtcttcettt tteaatatta it g a age art tatcag'ggtt 7680 attgtctcat gag e g g a t ac a t a t t:t g a a t gtatttagaa aaataaacaa ataggggtte 7740 CgCgCacatt tGceegaaaa gtgeeapctg aegtegaegg: ateg容gagai eaacttgtit: 7800 attgcagctt ataatggtta etaataaagG aatageatea eaaattteaG aaataaagca 7860 tttttttcac tgeattctag ttgtg:gtttg tccaaaetca teaatgtatc ttatcatgtc 7920 tggatcaact ggataactca agctaaecaa aatcatccca aaettccGaG cGcatacect 7980 attaccaetg ccaattac:£;t gtggtttcat ttactctaaa cctgtgattc Gtctgaatta 8040
[0177] 、 ttttcatttt aaagaaattg tatttgttaa atatgtacta eaaaettagt agtttttaaa 810 0 gaaattgtat ttgttaaata tgtactacaa acttagtagt 8140 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213>人工合成 <400> 4 gggtncagrg cagggg;u<ag 20 <210> 5 <211> 1623 <:12> DNA <213>人工含成 <400> 5 gccaccatge ctctgqtget: getgctgcea: ctgctgtggg GaggagGact ggctc.aggtg 60 cagctgcagc agtecggagc agagcttgtg aggccaggca getccgtcaa aatcagctgc 120 aaggcttccg gctatgcatt ctctagttae tggatgaact gggtgaaaca gGg:accag:g:a 180 cagggaetgg agtggatcgg :gcagatttgg cctggagaeg gcgataGtaa ct往taatg:ge 24:0 aagttcaaag ggaaggccac tctgacGgct gacgaatcaa gctccacagc ttatatgcag 300 e:tgtctagt€ t:ggcatcGga ggattGtgcc gtgtacttti gcgctcggag agaaaccaca 160 actgtcggcc ggtactatta Ggceatggac Iaciggggge agggaaccae agigaccgtc 420 tfiaagcggag gaggaggetc aggaugagga gggtecggag gcgggggatc tgatatceag 480 ctgacGcaga gtcctgcate actggccgtg agtctgggce age gage a ac aatttcctgt 540
[0178] aaagcctcc.c: agtctgtcga ctatgatggg gactcttatc tgaactggta eeag'cagatc 600 Ocaggacagc cccctaagct gctgatttac gacgcctcta atettgtgag tggcatccca 660 oeeagattea gtggctGagg gagcg;g:aaca gattttactc tgaatattca cccagtggaa 720 aaggtegaeg ecgctaecta tc:attg:t:ca:g cagagcaeeg aggacecctg gacatttgge 780 gg^ggaacta aacrggaaat taagagiact ccagcgaagc ccaccncgac gccngcgccg 840 cgaccaccaa caccggcgcc caccatcgcg rcgcagcccc tgtccctgcg cccagaggcg 900 tgccggGcag cggcgggggg cgcagtgcac acgagggggc tggacttcgc cGcacgcaaa 960 attgaagtta tgtatcctce tccttaccta gacaatgaga agagcaatgg aaccattatc 1020 catgigaaag ggaaacacct ttgtccaagt cccctatttc ccggaccttc taagcccttt 1080 tgggtgctgg tggtggttgg tggagtcctg gcttgctata gcttgctagt aacagtggcc 1140 tttattattt tetgggtgag gagtaagagg agcaggetcc tgeacagtga ctaeatgaac 1200 atgactccec gccgccccgg gcccacGCgc aagcattacc agccciat;g:c cccaccacge 1260 gaettcgcag CetategGtc eagagtgaag tteagcagga gcgeagacg.c ceccgegtac 1320 cagcagggGG agaaceagct ctataaegag cteaatetag gacgaagaga ggagtacgat 13 SO gttttggaca agagacgtgg cegggaccet gagatggggg gaaagccgca gagaaggaag H4U aaccctcagg aaggcctgta caatgaactg cagaaagata agatggcgga ggqetacagt 1500 gagattggga tgaaaggcga gcgccggagg ggcaaggggc acgatggcct ttaccagggt 1560 etcagtacag ccaccaagga cacctacgac gcccttcaca tgcaggccct :gccecCtcgc 1620 taa 1623
[0179] <210> 6 <211> 29 <212> DNA <213>人工合成 <400> 6 cggaattcgc caccatgcct ctgctgctg 29 <210> 7 <211> 29 <212> DNA <213>人工合成 <400 7 cgggatcctt agcgaggggg cagggcetg 29 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213>人工合成 <400> 8 ggagcc tacc titga etc itgc 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213>人工合成 <400> 9 caaccaggat ttatacaagg 20
[0180] <2i0> IO <211> 20 <212> DNA <213>人工合成 H 10 ggggaaagcc gcagagaagg 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213>人工合成 <40Q> 11 ggtaaagg.ee atcgtgcc.cc 2.0
【主权项】
1. 用于CAR-T制备的慢病毒载体,其特征在于,所述慢病毒载体为Pre-Lenti-EFl-MCS, 其核苷酸序列如SEQ ID 1所示。2. 如权利要求1所述的慢病毒载体的制备方法,包括以下步骤: 步骤1:基因合成EF1-MCS序列,两端设置Clal和Mlul限制性内切酶位点,所述EF1-MCS 序列如SEQ ID 2所示; 步骤2:用限制性内切酶Cla I和Mlul双酶切pLVX-IRES-Puro载体和所述EF1-MCS序列, 分别回收酶切后目的产物; 步骤3:连接步骤2回收获得的酶切后目的产物获得慢病毒表达载体Pre-Lenti-EFl-MCS〇3. 如权利要求1所述慢病毒载体的使用方法,包括下述步骤: 步骤1:将目的基因克隆入Pre-Lenti-EFl-MCS载体获得重组慢病毒载体; 步骤2:将步骤1获得的重组慢病毒载体和psPAX2和pMD2.0G共同转染宿主细胞; 步骤3:培养宿主细胞; 步骤4:分离获得重组慢病毒。4. 如权利要求3所述慢病毒载体的使用方法,其特征在于,所述宿主细胞为:293或293T 细胞。5. -种重组慢病毒载体,所述重组慢病毒载体由如下方法制备得到:将针对肿瘤相关 抗原(TAA)的CAR基因克隆入如权利要求1所述Pr e-Lent i -EF1-MCS的多克隆位点处。6. 如权利要求5所述的重组慢病毒载体,其特征在于,其中所述CAR基因识别的肿瘤相 关抗原(TAA)选自 0)19丄020、0)22丄033、0)138、801^、0)38、疆620、1?01?1、间皮蛋白、(3-]^七、 EGFR、ERBB2、ERBB3、ERBB4、PDGFR、GPC3、PSCA、EpCAM、PSMA、EGFRvIII、⑶-2 或其任意组合。7. 如权利要求1所述的慢病毒载体在制备抗肿瘤药物中的应用。8. 如权利要求5或6所述的重组慢病毒载体在制备抗肿瘤药物中的应用。9. 一种测定重组病毒滴度的方法,包括如下步骤: 步骤1:慢病毒包装:用如权利要求5所述慢病毒载体和提供病毒膜蛋白和结构蛋白的 包装质粒共转染宿主细胞,收获重组病毒; 步骤2:制备梯度浓度的DNA样品:按照5-15倍比例梯度浓度稀释步骤1制备得到的重组 病毒,制成3-10组等梯度浓度的重组病毒稀释液,用稀释后的等梯度浓度的重组病毒稀释 液分别感染相同浓度的宿主细胞并培养,收集等体积经感染和培养的293或293T细胞分别 提取DNA,制3-10组梯度浓度的DNA样品; 步骤3:设计荧光定量PCR引物:设计靶向CAR基因胞内段CD3G基因的引物; 步骤4:荧光定量PCR方法测定重组病毒滴度:分别取等量步骤2提取的梯度浓度的DNA 样品和步骤3获得的荧光定量PCR引物构建荧光定量PCR扩增体系,相同条件下进行扩增,分 析实验结果,用绝对定量的方法测定重组病毒滴度。10. 如权利要求9所述的测定重组病毒滴度的方法,其特征在于所述提供病毒膜蛋白和 结构蛋白的包装质粒为psPAX2和pMD2.0G,所述宿主细胞为293或293T细胞。
【文档编号】A61P35/00GK106086077SQ201610526284
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年7月5日
【发明人】何昱
【申请人】北京普瑞金科技有限公司, 普瑞金(天津)生物技术有限公司
网友询问留言 已有0条留言
  • 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞!
1