一种生产反式-4-羟基-l-脯氨酸的工程菌及其构建方法与应用

一种生产反式-4-羟基-l-脯氨酸的工程菌及其构建方法与应用
【专利摘要】本发明公开了一种生产反式?4?羟基?L?脯氨酸的工程菌及其构建方法与应用。本发明所提供的工程菌的构建方法，包括A1)和A2)：A1)向受体细胞中导入L?脯氨酸?4?羟化酶基因、谷氨酸?5?激酶基因和谷氨酸?5?半醛脱氢酶基因；A2)为将受体细胞的α－酮戊二酸脱氢酶基因、异柠檬酸裂解酶基因或脯氨酸脱氢酶基因敲除、或用乙酰辅酶A合成酶基因替换受体细胞的丙酮酸氧化酶基因；利用重组细胞与底物进行反应得到反式?4?羟基?L?脯氨酸。实验证明，可以利用本发明的反式?4?羟基?L?脯氨酸的生产方法生产反式?4?羟基?L?脯氨酸。
【专利说明】
_种生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的工程菌及其构建方法与 应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一种生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的工程菌及其构建方法与应用。
【背景技术】
[0002] 反式-4-羟基-L-脯氨酸(trans-4-Hydroxy-L-proline，Hyp)是广泛存在于动物胶 和骨胶原中的亚氨基酸，分子式如式1。
[0003]
[0004] 反式-4-羟基-L-脯氨酸可以作为胶原蛋白合成的增强剂而用于化妆品和医药产 品行业。也可以作为许多组织（如皮肤、骨骼和消化道）的补充营养物而用于食品行业。此 外，反式-4-羟基-L-脯氨酸带有手性分子，是合成药物时有用的手性元件。其有用的衍生品 包括MK-1220、聚胺-4-L-羟脯氨酸和N-乙酰-羟脯氨酸(奥沙西罗）。歷-1220被认为是一个 高活性的丙型肝炎病毒蛋白酶抑制剂;聚胺-4-L-羟脯氨酸被用作非降解性丙烯酸骨结合 剂;N-乙酰-羟脯氨酸可以抑制炎症和减少肿胀，是有用的治疗骨关节炎等影响结缔组织疾 病，奥沙西罗已经被确立为一种无毒副作用的治疗关节疾病的药物。
[0005] 目前，生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的主要方法是生物提取法:利用动物蛋白如明 胶、猪皮为原料，经酸、碱水解后提取反式-4-羟基-L-脯氨酸，该方法纯化步骤长，成本高， 且废弃物污染严重。随着脯氨酸-4-羟化酶的开发和生物技术的发展，利用微生物生产反 式-4-羟基-L-脯氨酸成为可能。
[0006] 国外，Shibasaki等人于2000发表文章称已构建可以工业化生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的微生物，即在含有葡萄糖和L-脯氨酸的培养基中，用大肠杆菌过量表达L-脯氨酸- 4-羟化酶来转化L-脯氨酸生成反式-4-羟基-L-脯氨酸。国内，刘合栋等人于2013年构建了 过量表达L-脯氨酸-4-羟化酶的大肠杆菌，利用葡萄糖做底物，发酵法生产反式-4-羟基-L-脯氨酸。以上方法的共同缺点是耗时较长，而且L-脯氨酸做底物，成本昂贵。

【发明内容】

[0007] 本发明所要解决的技术问题是如何低成本生产反式-4-羟基-L-脯氨酸。
[0008] 为解决上述技术问题，本发明首先提供了反式-4-羟基-L-脯氨酸的生产方法，该 方法以谷氨酸和/或可溶性谷氨酸盐为底物，葡糖糖作辅因子，利用工程菌全细胞转化生产 反式-4-羟基-L-脯氨酸，不但降低了生产成本，还缩短了生产周期。
[0009] 本发明所提供的反式-4-羟基-L-脯氨酸的生产方法，包括利用重组细胞与底物进 行反应得到反式-4-羟基-L-脯氨酸；
[0010] 所述重组细胞的构建方法，包括对受体细胞进行Al)、A2)、A3)和A4)的改造得到重 组细胞的步骤：
[0011] Al)向所述受体细胞中导入L-脯氨酸-4-轻化酶(P4H)基因；
[0012] A2)向所述受体细胞中导入谷氨酸-5-激酶(ProB)基因；
[0013] A3)向所述受体细胞中导入谷氨酸-5-半醛脱氢酶(ProA)基因；
[0014] A4)为如下BI)、B2)、B3)和B4)这四种中的任一种、任两种、任二种或四种：
[0015] BI)将所述受体细胞的α -酮戊二酸脱氢酶（SucA)基因敲除，该改造以"ASUCA"表 示；
[0016] B2)将所述受体细胞的异柠檬酸裂解酶(AceA)基因敲除，该改造以"AaceA"表示； [0017] B3)为如下B31)和B32)，该改造以"Δρ0ΧΒ: :acs"表示：
[0018] B31)将所述受体细胞的丙酮酸氧化酶(PoxB)基因敲除；
[0019] B32)向所述受体细胞中导入乙酰辅酶A合成酶(Acs)基因；
[0020] B4)将所述受体细胞的脯氨酸脱氢酶(PutA)基因敲除，该改造以" △ putA"表示； [0021 ]所述受体细胞为微生物细胞、非人动物细胞或植物细胞。
[0022] 上述方法中，所述受体细胞为大肠杆菌。所述受体细胞具体可为大肠杆菌K12。
[0023] 上述方法中，所述底物可为谷氨酸或/和可溶性谷氨酸盐。
[0024] 上述方法中，B3)可为用所述乙酰辅酶A合成酶基因替换所述受体细胞的所述丙酮 酸氧化酶基因。
[0025] 上述敲除和替换均可通过同源重组实现。
[0026]上述方法中，所述L-脯氨酸-4-轻化酶可为如下Gl)或G2)的蛋白质：
[0027] Gl)氨基酸序列是SEQ ID No. 1的蛋白质；
[0028] G2)在SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几 个氨基酸残基得到的具有所述L-脯氨酸-4-羟化酶功能的由Gl)衍生的蛋白质；
[0029]所述谷氨酸-5-激酶可为下述Hl)或H2)的蛋白质：
[0030] Hl)氨基酸序列为SEQ ID No.3的蛋白质；
[0031] H2)在SEQ ID No.3所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几 个氨基酸残基得到的具有所述谷氨酸-5-激酶功能的由Hl)衍生的蛋白质；
[0032]所述谷氨酸-5-半醛脱氢酶可为下述I 1)或12)的蛋白质：
[0033] II)氨基酸序列为SEQ ID No.5的蛋白质；
[0034] 12)在SEQ ID No.5所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几 个氨基酸残基得到的具有所述谷氨酸-5-半醛脱氢酶功能的由II)衍生的蛋白质；
[0035]所述α-酮戊二酸脱氢酶可为下述Jl)或J2)的蛋白质：
[0036] Jl)氨基酸序列为SEQ ID No.7的蛋白质；
[0037] J2)在SEQ ID No.7所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几 个氨基酸残基得到的具有所述α-酮戊二酸脱氢酶功能的由Jl)衍生的蛋白质；
[0038]所述脯氨酸脱氢酶可为下述Kl)或Κ2)的蛋白质：
[0039] Kl)氨基酸序列为SEQ ID No.8的蛋白质；
[0040] K2)在SEQ ID No.8所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几 个氨基酸残基得到的具有所述脯氨酸脱氢酶功能的由Kl)衍生的蛋白质；
[0041 ]所述异柠檬酸裂解酶可为下述LI)或L2)的蛋白质：
[0042] LI)氨基酸序列为SEQ ID No.9的蛋白质；
[0043] L2)在SEQ ID No.9所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几 个氨基酸残基得到的具有所述异柠檬酸裂解酶功能的由LI)衍生的蛋白质；
[0044]所述丙酮酸氧化酶可为下述Ml)或M2)的蛋白质：
[0045] Ml)氨基酸序列为SEQ ID No. 10的蛋白质；
[0046] M2)在SEQ ID No. 10所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几 个氨基酸残基得到的具有所述丙酮酸氧化酶功能的由Ml)衍生的蛋白质；
[0047]所述乙酰辅酶A合成酶可为下述NI)或N2)的蛋白质：
[0048] NI)氨基酸序列为SEQ ID No. 11的蛋白质；
[0049] N2)在SEQ ID No. 11所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几 个氨基酸残基得到的具有所述乙酰辅酶A合成酶功能的由NI)衍生的蛋白质。
[0050] 上述方法中，所述L-脯氨酸-4-羟化酶基因可为下述Gll)-G13)中的任一种DNA分 子：
[0051 ] G11)编码序列是SEQ ID No.2所示的CDNA分子或基因组DNA;
[0052] G12)在严格条件下与G11)限定的DNA分子杂交且编码所述L-脯氨酸-4-羟化酶的 cDNA分子或基因组DNA;
[0053] G13)与G11)或G12)限定的DNA分子具有75%以上的同一性且编码所述L-脯氨酸- 4-羟化酶的cDNA分子或基因组DNA;
[0054] 所述谷氨酸-5-激酶基因可为下述Hl I) -Hl 3)中的任一种DNA分子：
[0055] H11)编码序列是SEQ ID No.4所示的cDNA分子或基因组DNA;
[0056] H12)在严格条件下与Hll)限定的DNA分子杂交且编码所述谷氨酸-5-激酶的cDNA 分子或基因组DNA;
[0057] H13)与H11)或H12)限定的DNA分子具有75%以上的同一性且编码所述谷氨酸-5-激酶的cDNA分子或基因组DNA;
[0058] 所述谷氨酸-5-半醛脱氢酶基因可为下述111)-113)中的任一种DNA分子：
[0059] 111)编码序列是SEQ ID No.6所示的cDNA分子或基因组DNA;
[0060] 112)在严格条件下与111)限定的DNA分子杂交且编码所述谷氨酸-5-半醛脱氢酶 的cDNA分子或基因组DNA;
[00611 113)与111)或112)限定的DNA分子具有75%以上的同一性且编码所述谷氨酸-5- 半醛脱氢酶的cDNA分子或基因组DNA;
[0062] 所述乙酰辅酶A合成酶基因可为下述NI I)-Nl3)中的任一种DNA分子：
[0063] Nil)编码序列是SEQ ID No. 12所示的cDNA分子或基因组DNA;
[0064] N12)在严格条件下与Nil)限定的DNA分子杂交且编码所述乙酰辅酶A合成酶的 cDNA分子或基因组DNA;
[0065] N13)与Nil)或N12)限定的DNA分子具有75%以上的同一性且编码所述乙酰辅酶A 合成酶的cDNA分子或基因组DNA。
[0066] 上述严格条件可为如下：50°C，在7%十二烷基硫酸钠（SDS)、0.5M NaP〇4和ImM EDTA的混合溶液中杂交，在50 °C，2 X SSC，0.1 % SDS中漂洗；还可为：50 °C，在7 % SDS、0.5M NaP〇4和ImM EDTA的混合溶液中杂交，在50 °C，I X SSC，O. I % SDS中漂洗；还可为：50 °C，在 7 % SDS、0.5M NaP〇4和 ImM EDTA的混合溶液中杂交，在50 °C，0.5 X SSC，0.1 % SDS 中漂洗;还 可为：50 °C，在7 % SDS、0 · 5M NaP〇4和 ImM EDTA的混合溶液中杂交，在50 °C，0 · I X SSC，0 · 1 % SDS中漂洗；还可为：50 °C，在7 % SDS、0.5M NaP〇4和ImM EDTA的混合溶液中杂交，在65 °C， 0.1父33(：，0.1%303中漂洗;也可为:在6\33(：，0.5%303的溶液中，在65°(：下杂交，然后用2 X SSC，0 · 1 % SDS和 I X SSC，0 · 1 % SDS各洗膜一次。
[0067]上述"同一性"指与天然核酸序列的序列相似性。"同一性"可以用肉眼或计算机软 件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比（％ )表示，其可 以用来评价相关序列之间的同一性。
[0068] 上述方法中，所述L-脯氨酸-4-羟化酶基因可通过含有L-脯氨酸-4-羟化酶基因表 达盒的重组表达载体导入所述受体细胞中。
[0069]本发明中所述L-脯氨酸-4-羟化酶基因表达盒可含有所述L-脯氨酸-4-羟化酶基 因和启动所述L-脯氨酸-4-羟化酶基因转录的启动子。本发明中所述L-脯氨酸-4-羟化酶基 因表达盒指能够在宿主细胞中表达SEQ ID No. 1所示的L-脯氨酸-4-羟化酶的DNA，该DNA不 但可包括启动所述L-脯氨酸-4-羟化酶基因转录的启动子，还可包括终止所述L-脯氨酸-4-羟化酶基因转录的终止子。进一步，所述L-脯氨酸-4-羟化酶基因表达盒还可包括增强子序 列。
[0070] 上述方法中，所述谷氨酸-5-激酶基因可通过含有谷氨酸-5-激酶基因表达盒的重 组表达载体导入所述受体细胞中。
[0071] 本发明中所述谷氨酸-5-激酶基因表达盒可含有所述谷氨酸-5-激酶基因和启动 所述谷氨酸-5-激酶基因转录的启动子。本发明中所述谷氨酸-5-激酶基因表达盒指能够在 宿主细胞中表达SEQ ID No.3所示的谷氨酸-5-激酶的DNA，该DNA不但可包括启动所述谷氨 酸-5-激酶基因转录的启动子，还可包括终止所述谷氨酸-5-激酶基因转录的终止子。进一 步，所述谷氨酸-5-激酶基因表达盒还可包括增强子序列。
[0072] 上述方法中，所述谷氨酸-5-半醛脱氢酶基因可通过含有谷氨酸-5-半醛脱氢酶基 因表达盒的重组表达载体导入所述受体细胞中。
[0073] 本发明中所述谷氨酸-5-半醛脱氢酶基因表达盒可含有所述谷氨酸-5-半醛脱氢 酶基因和启动所述谷氨酸-5-半醛脱氢酶基因转录的启动子。本发明中所述谷氨酸-5-半醛 脱氢酶基因表达盒指能够在宿主细胞中表达SEQ ID No.5所示的谷氨酸-5-半醛脱氢酶的 DNA，该DNA不但可包括启动所述谷氨酸-5-半醛脱氢酶基因转录的启动子，还可包括终止所 述谷氨酸-5-半醛脱氢酶基因转录的终止子。进一步，所述谷氨酸-5-半醛脱氢酶基因表达 盒还可包括增强子序列。
[0074]所述L-脯氨酸-4-羟化酶基因表达盒、所述谷氨酸-5-激酶基因表达盒和所述谷氨 酸-5-半醛脱氢酶基因表达盒的启动子均可为ara启动子。
[0075] 在本发明中的一个实施例中，所述含有L-脯氨酸-4-羟化酶基因表达盒的重组表 达载体为将重组载体PYBlS的Bgl Π 和EcoR I识别序列间的DNA片段替换为序列表中SEQ IDNo.2所示的DNA分子得到的重组载体pYBls-p4h。所述重组载体pYBls-p4h表达SEQID No. 1所示的L-脯氨酸-4-羟化酶。
[0076] 所述重组载体p Y B I S的制备方法如下：以P 1 5 A S a I I _ F : GTCGACGTGCGTCAGCAGAATATGTG和StrSph I_R: ACCTACCAAGGCAACGCTAT为引物，以载体 pACY⑶uet-l(N〇Vagen公司）为模板扩增得到含有复制子和链霉素抗性基因的DNA片段，将 该DNA片段命名为ori-aadA;利用引 物araC-TrrnB_sphI_F : GCACATGCATGCAATGTGCCTGTCAAATG和araC-TrrnB_SalI_R: ATATACGCGTCGACGAAAGGCCCAGTCTTTC，从 pBAD-h i sB 扩增得到含有 pBAD 启动子、酶切位点和 终止子的DNA片段，将该DNA片段命名为araC-TrrnB。分别用SphI和Sail双酶切ori-aadA和 araC-TrrnB，将or i-aadA双酶切得到的大片段和araC-TrrnB双酶切得到的大片段连接，得 到重组载体PYB1S。重组载体pYBlS的核苷酸序列如SEQ ID No. 15所示。
[0077] 所述含有谷氨酸-5-激酶基因表达盒的重组表达载体和所述含有谷氨酸-5-半醛 脱氢酶基因表达盒的重组表达载体均可为将所述重组载体pYBls-p4h的EcoR I和SacI识别 序列间的DNA片段替换为序列表中SEQ ID No.4所示的DNA分子得到的重组载体ρΗΒΑ。所述 重组载体PHBA表达SEQ ID No. 1所示的L-脯氨酸-4-羟化酶、SEQ ID No.3所示的谷氨酸-5-激酶和SEQ ID No.5所示的谷氨酸-5-半醛脱氢酶。所述含有L-脯氨酸-4-羟化酶基因表达 盒的重组表达载体也可为所述重组载体ρΗΒΑ。
[0078] 其中，SEQ ID No.4的第1-6位核苷酸为RBS的序列，SEQ ID No.4的第12-1115位核 苷酸为ProB基因的序列，编码SEQ ID No.3所示的ProB，SEQ ID No.4的第1127-2380位核苷 酸为ProA基因的序列，编码SEQ ID No. 5所示的ProA。
[0079] 上述方法中，所述对受体细胞进行A1)、A2)、A3)和A4)的改造可为向α-酮戊二酸 脱氢酶基因缺失细胞、异柠檬酸裂解酶基因缺失细胞、脯氨酸脱氢酶缺失细胞或丙酮酸氧 化酶基因缺失的含有乙酰辅酶A合成酶基因的细胞中导入所述L-脯氨酸-4-羟化酶基因、所 述谷氨酸-5-激酶基因和所述谷氨酸-5-半醛脱氢酶基因。
[0080] 所述α-酮戊二酸脱氢酶基因缺失细胞具体可为国立遗传学研究所的Δ sucA菌 株。所述异柠檬酸裂解酶基因缺失细胞具体可为国立遗传学研究所的A aceA菌株。所述脯 氨酸脱氢酶缺失细胞具体可为国立遗传学研究所的A putA菌株。所述丙酮酸氧化酶基因缺 失的含有乙酰辅酶A合成酶基因的细胞具体可为将大肠杆菌K12的丙酮酸氧化酶基因替换 为乙酰辅酶A合成酶基因得到的重组细胞，该细胞的名称为△ poxB: : acs突变株。
[0081 ] 在本发明的一个实施例中，所述重组细胞为向所述Δ sucA菌株、所述Δ aceA菌株、 所述Δ putA菌株和所述Δ p〇xB: : acs突变株中导入所述重组载体pHBA得到的重组细胞
[0082]上述方法中，所述重组细胞与所述底物在体系R中进行反应；所述体系R由水、 Tris、FeS〇4、维生素 C和W组成，所述W为α-酮戊二酸(α-KG)、葡萄糖和聚乙二醇辛基苯基醚 (Triton Χ-100)这三种中的任一种、任两种或三种。
[0083] 上述方法中，所述体系R为下述体系R1-R8中任一种：
[0084]体系Rl:体系Rl由水和溶质组成;所述溶质及其浓度分别为IOOmM Tris、0.5-2g/ IOOmL葡萄糖、0.05-0.2g/100mL Triton X-100、4mM FeS〇4和8mM维生素 C，用盐酸调节pH至 pH7.0；
[0085] 体系R2:体系R2由水和溶质组成;所述溶质及其浓度分别为IOOmM Tris、0.5-2g/ IOOmL葡萄糖、4mM FeSCU和8mM维生素 C，用盐酸调节pH至pH7.0;
[0086] 体系R3:体系R3由水和溶质组成;所述溶质及其浓度分别为IOOmM Tris、5-100mM α-酮戊二酸、4mM FeS〇4和8mM维生素 C，用盐酸调节pH至pH7.0;
[0087] 体系R4:体系R4由水和溶质组成；所述溶质及其浓度分别为10011^1^8、0.05-0.2g/100mL Triton X-100、4mM FeS〇4和8mM维生素 C，用盐酸调节pH至ρΗ7·0;
[0088] 体系R5:体系R5由水和溶质组成；所述溶质及其浓度分别为IOOmM Tris、4mM FeS〇4和8mM维生素 C，用盐酸调节pH至pH7.0;
[0089] 体系R6:体系R6由水和溶质组成;所述溶质及其浓度分别为IOOmM Tris、5-100mM α_酮戊二酸、0.05-0.2g/100mL Triton X-100、4mM FeS〇4和8mM维生素 C，用盐酸调节pH至 pH7.0；
[0090] 体系R7:体系R7由水和溶质组成;所述溶质及其浓度分别为IOOmM Tris、0.5-2g/ IOOmL葡萄糖、5-100mMa-酮戊二酸、4mM FeSCU和8mM维生素 C，用盐酸调节pH至pH7.0;
[0091] 体系R8:体系R8由水和溶质组成;所述溶质及其浓度分别为IOOmM Tris、0.5-2g/ IOOmL葡萄糖、5-100mMa-酮戊二酸、0.05-0.2g/100mL Triton X-100、4mM FeS〇4和8mM维生 素 C，用盐酸调节pH至pH7.0。
[0092] 上述方法中，所述0.5-2g/100mL葡萄糖具体可为0.5-1.5g/100mL葡萄糖或lg/ IOOmL葡萄糖。
[0093] 所述5-100mMa-酮戊二酸具体可为25-100mMa-酮戊二酸或50mMa-酮戊二酸。
[0094] 所述0.05-0.2g/100mL Triton X-100具体可为0.1g/100mL Triton X-100。
[0095] 为解决上述技术问题，本发明还提供了所述重组细胞。
[0096] 本发明所要解决的另一个技术问题是如何提高反式-4-羟基-L-脯氨酸的产量。
[0097] 为解决上述技术问题，本发明提供了生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的成套试剂。 [0098]本发明所提供的生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的成套试剂，为Dl)或D2):
[0099] Dl)由所述重组细胞与a)组成的成套试剂；
[0100] 所述a)为α-酮戊二酸、葡萄糖和Triton x-100这三种中的任一种、任两种或三种；
[0101] D2)由用于构建所述的重组细胞的生物材料与所述a)组成的成套试剂；
[0102]所述用于构建所述重组细胞的生物材料，为Cl)或C2):
[0103] Cl)用于构建所述重组细胞的成套DNA分子，含有所述L-脯氨酸-4-羟化酶基因、所 述谷氨酸-5-激酶基因和所述谷氨酸-5-半醛脱氢酶基因这三个基因中的至少一个基因； [0104] C2)含有Cl)所述成套DNA分子中所述三个基因、或其中任两个基因的载体。
[0105] 上述成套试剂中，所述重组细胞和所述α-酮戊二酸的配比可为30mg(细胞湿重）：5 X HT6-IOO Xl(T6m〇l。所述重组细胞和所述α-酮戊二酸的配比具体可为30mg(细胞湿重）： 25 X 10-6-100 X 10-6mol或30mg(细胞湿重）：50 X 10-6mol。
[0106] 所述重组细胞和所述葡萄糖的配比可为30mg(细胞湿重）：0.005-0.02g。所述重组 细胞和所述葡萄糖的配比具体可为30mg(细胞湿重）：0.005-0.0158或3011^/11^细胞(细胞湿 重/体积）：〇.〇lg。
[0107] 所述重组细胞和所述Triton X-100的配比可为30mg(细胞湿重）：0.0005-0.002g。 所述重组细胞和所述Triton X-100的配比具体可为30mg(细胞湿重）：0.001g。
[0108] 在本发明的一个实施例中，C2)所述载体为所述重组载体ρΗΒΑ。
[0109] 上述成套试剂中，Cl)所述成套DNA分子由所述L-脯氨酸-4-羟化酶基因、所述谷氨 酸-5-激酶基因、所述谷氨酸-5-半醛脱氢酶基因和所述乙酰辅酶A合成酶基因组成，这四个 基因各自独立包装；
[0110] C2)所述载体为含有Cl)所述成套DNA分子中所述四个基因、或其中任三个基因、或 其中任两个基因的载体。
[0111] 为解决上述技术问题，本发明还提供了下述任一应用：
[0112] M1、所述重组细胞在制备反式-4-羟基-L-脯氨酸中的应用；
[0113] M2、所述重组细胞在生物转化谷氨酸或可溶性谷氨酸盐制备反式-4-羟基-L-脯氨 酸中的应用；
[0114] M3、所述成套试剂在制备反式-4-羟基-L-脯氨酸中的应用；
[0115] M4、所述成套试剂在生物转化谷氨酸或可溶性谷氨酸盐制备反式-4-羟基-L-脯氨 酸中的应用。
[0116] 为解决上述技术问题，本发明还提供了所述α-酮戊二酸脱氢酶基因和/或所述异 柠檬酸裂解酶基因和/或所述丙酮酸氧化酶基因和/或所述脯氨酸脱氢酶基因的敲除在生 产反式-4-羟基-L-脯氨酸中的应用。
[0117] 上文中，所述可溶性谷氨酸盐可为谷氨酸钠。
[0118] 实验证明，本发明的反式-4-羟基-L-脯氨酸的生产方法一一向将大肠杆菌Κ12的 sucA基因、aceA基因、putA基因敲除或将大肠杆菌Κ12的ροχΒ基因敲除并导入acs基因得到 的重组细胞中导入P4H基因、proB基因和proA基因，可以提高细胞转化谷氨酸钠得到的反 式-4-羟基-L-脯氨酸的产量:大肠杆菌K12菌体反应液中无反式-4-羟基-L-脯氨酸，pHBA/ BW菌体(将P4H基因、ProB基因和ProA基因的pHBA导入大肠杆菌Kl 2得到的工程菌)反应液中 反式-4-羟基-L-脯氨酸的含量为10.66 ±0.06mM，pHBA/ Δ putA菌体（向将大肠杆菌K12putA 基因缺失得到的A putA菌株中导入P4H基因、ProB基因和ProA基因得到的工程菌)反应液中 反式-4-羟基-L-脯氨酸的含量为18.13 ± 0.2 ImM，pHBA/ Δ sucA菌体(向将大肠杆菌Kl 2sucA 基因缺失得到的A sucA菌株中导入P4H基因、ProB基因和ProA基因得到的工程菌)反应液中 反式-4-羟基-L-脯氨酸的含量为20.94±0.57mM，pHBA/Δ aceA(向将大肠杆菌K12aceA基因 缺失得到的Δ aceA菌株中导入P4H基因、ProB基因和ProA基因得到的工程菌)菌体反应液中 反式-4-羟基-1^-脯氨酸的含量为14.74±0.6111^，？冊4/八 1)〇成：：&(^菌体（向将大肠杆菌 K12poxB基因敲除并导入acs基因得到的突变株ΔροχΒ: :acs中导入P4H基因、ProB基因和 ProA基因得到的工程菌)反应液中反式-4-羟基-L-脯氨酸的含量为13.67±0.4511^。？冊八/ 基-L-脯氨酸分别为pHBA/BW的1.70倍、1.96倍、1.38倍和1.28倍。
[0119] 实验证明，α-KG可以提高细胞转化谷氨酸钠得到的反式-4-羟基-L-脯氨酸的产 量：当转化液中α-KG浓度为OmM时，反式-4-羟基-L-脯氨酸的产量为5.94±0.14mM;当转化 液中α-KG浓度为5mM时，反式-4-羟基-L-脯氨酸的产量为9.10 ± 0.06mM，为OmMa-KG转化液 的1.53倍；当转化液中a-KG浓度为25mM时，反式-4-羟基-L-脯氨酸的产量为12.91 土 0.3411^，为〇1111€[-队转化液的2.17倍；当转化液中€ [-队浓度为5011^时，反式-4-羟基-1^-脯氨 酸的产量为18.51 ±0.87mM，为OmMa-KG转化液的3.12倍；当转化液中a-KG浓度为IOOmM时， 反式-4-羟基-L-脯氨酸的产量为15.18 ±0.32mM，为OmMa-KG转化液的2.56倍。
[0120] 实验证明，葡萄糖可以提高细胞转化谷氨酸钠得到的反式-4-羟基-L-脯氨酸的产 量:当转化液为中无葡萄糖时，反式-4-羟基-L-脯氨酸的产量为5.94±0.14mM;当转化液中 葡萄糖浓度为0.5g/100mL时，反式-4-羟基-L-脯氨酸的产量为13.5 ±0.47mM，为无葡萄糖 的2.27倍;当转化液中葡萄糖浓度为1.0g/100mL时，反式-4-羟基-L-脯氨酸的产量为15.22 ±0.30mM，为无葡萄糖的2.56倍；当转化液中葡萄糖浓度为1.5g/100mL时，反式-4-羟基-L-脯氨酸的产量为13.67 ± 0.35mM，为无葡萄糖的2.30倍；当转化液中葡萄糖浓度为2 . Og/ IOOmL时，反式-4-羟基-L-脯氨酸的产量为10.66 ±0.06mM，为无葡萄糖的1.79倍。
[0121]实验证明，Triton X-100可以提高细胞转化谷氨酸钠得到的反式-4-羟基-L-脯氨 酸的产量：当转化液中无 Tri ton X-100时，反式-4-羟基-L-脯氨酸的产量为13.67 土 0.35mM;当转化液中Triton X-100的浓度为为0. lg/100mL时，反式-4-羟基-L-脯氨酸的产 量为28·74±0· 13mM，为无 Triton X-100转化液的2· 10倍。
[0122] 实验证明，可以利用本发明的反式-4-羟基-L-脯氨酸的生产方法生产反式-4-羟 基-L-脯氨酸，并可以通过添加 α-KG、葡萄糖和/或Triton X-100提高反式-4-羟基-L-脯氨 酸的产量。
【附图说明】
[0123] 图1为重组质粒pHBA的示意图。
[0124] 图2为工程菌的蛋白表达SDS-PAGE图。其中，泳道M为蛋白分子量Marker;泳道1为 pYBl S/BW;泳道 2 为 pYBl S-p4h/BW;泳道 3 为 pHBA/BW。
[0125] 图3为基因改造过的工程菌株蛋白表达SDS-PAGE图。其中，泳道M为蛋白分子量 Marker;泳道 1 为pHBA/BW;泳道2为pHBA/ Δ sucA;泳道3为pHBA/ Δ aceA;泳道4为pHBA/ Δ poxB: :acs;泳道5为pHBA/AputA。
[0126] 图4为Hyp标准曲线。
[0127] 图5为不同工程菌株的反式-4-羟基-L-脯氨酸产量。其中，pYBls/BW表示pYBlS/ Bff0
[0128] 图6为α-酮戊二酸(α-KG)对反式-4-羟基-L-脯氨酸产量的影响。
[0129] 图7为葡萄糖对反式-4-羟基-L-脯氨酸产量的影响。
[0130] 图8为在最优条件下利用重组细胞制备反式-4-羟基-L-脯氨酸的结果。
【具体实施方式】
[0131]下面结合【具体实施方式】对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐 明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
[0132] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0133] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0134] 下述实施例中的大肠杆菌K12(Tomoya Baba,Takeshi Ara,Miki Hasegawa,Yuki Takai,Yoshiko Okumura,Miki Baba , Kiri 11 A Datsenko,Masaru Tomita, Barry L Wanner,and Hirotada Mori I. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants:the Keio collection.Molecular Systems Biology (2006) :1-11.)公众可从中国科学院微生物研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相 关实验所用，不可作为其它用途使用。
[0135] 下述实施例中的AputA菌株（JW0999)(国立遗传学研究所（NIG，Japan)产品） (Baba,Tomoya,et al·"Construction of Escherichia coli K-12 in-frame , single-gene knockout mutants : the Keio collection·"Molecular systems biology 2.1 (2006).)是大肠杆菌K12的putA基因缺失菌株，putA基因编码序列表中SEQ ID No.8所示的 脯氨酸脱氢酶。
[0136] 下述实施例中的AsucA菌株(为国立遗传学研究所(NIGJapan)产品，NIG编号为 JW0715)(Baba et al.，2006)是将大肠杆菌K12的α-酮戊二酸脱氢酶基因（sucA)替换为两 端带有FRT位点的卡那霉素抗性基因（约1300bp)从而将大肠杆菌Kl2的sucA敲除(缺失）的 大肠杆菌K12突变体，其基因型为AsucA: =Kanc3SucA编码SEQ ID Νο·7所示的蛋白质，sucA 的编码序列如SEQ ID No. 13所示。引物对sucA_up550F(AACCTCTTGTCCGTCTTTCTG)和sucA_ down353R(CGCATCGTTGTTTTGCTC)从Δ sucA菌株的基因组DNA中扩增得到一个约2200bp的片 段，从大肠杆菌K12的基因组DNA中扩增得到一个约3705bp的片段。其中，sucA_up550F和 sucA_down353R引物结合位置分别是大肠杆菌1(12的811〇六基因的上游55(^口和下游35(^卩附 近区域。测序分析结果表明A sucA菌株的基因组上没有sucA。
[0137] 下述实施例中的AaceA菌株(为国立遗传学研究所(NIG Japan)产品，NIG编号为 JW3975)(Baba et al.，2006)是将大肠杆菌K12的异柠檬酸裂合酶基因（aceA)替换为两端 带有FRT位点的卡那霉素抗性基因从而将大肠杆菌K12的异柠檬酸裂合酶基因（aceA)敲除 (缺失）的大肠杆菌K12突变体，其基因型为AaceA^Kan。异柠檬酸裂合酶基因（aceA)位于 大肠杆菌K12基因组4217109..4218413的位置，其编码序列为SEQ ID No. 14,编码SEQ ID No. 9 所示的异柠檬酸裂合酶。用引物对 aceA_up380_F: GTGAACGCACCGAAGAAGG 和 aceA_d700_ R:GTCAGATGGCGAATAATGTAATGGA从Δ aceA菌株的基因组DNA中扩增得到一个约2500bp的片 段，从大肠杆菌K12的基因组DNA中扩增得到一个约2429bp的片段。其中，引物结合位置分别 是大肠杆菌K12的aceA基因的上游和下游区域。测序分析结果表明AaceA菌株的基因组上 没有aceA。
[0138] 下述实施例中的5052自诱导培养基为无菌培养基，其配制方法如下：IOOmL A+2mL B+2mL C+200y-L D+lOOy-L E；
[0139] A为ZY溶液，ZY溶液由超纯水和溶质组成，溶质及其浓度分别为：I % (质量百分比 浓度)胰蛋白胨和〇. 5 % (质量百分比浓度)酵母粉；
[0140] B为50 X M溶液，50 X M溶液由超纯水和溶质组成，溶质及其浓度分别为：1.25M Na2HP〇4，1.25M KH2P〇4,2.5M NH4Cl和0.25M Na2S〇4;
[0141] C为50 X 5052溶液，50 X 5052溶液由超纯水和溶质组成，溶质及其浓度分别为： 25% (质量百分比浓度)甘油，2.5% (质量百分比浓度)葡萄糖，10% (质量百分比浓度)L-阿 拉伯糖；
[0142] D为IM MgS〇4水溶液；
[0143] E为1000X微量元素溶液，1000 X微量元素溶液由超纯水和溶质组成，溶质及其浓 度分别为：50mM FeCl3，20mM CaCl2，IOmM MnCl2, IOmM ZnS〇4,2mM CoCl2，2mM NiCl2，2mM Na2M〇4,2mM Na2Se〇3,2mM H3BO3D
[0144] 实施例1、重组细胞的制备
[0145] 1、重组载体pHBA的构建
[0146] 构建表达L-脯氨酸-4-羟化酶(P4H)、谷氨酸-5-激酶(ProB)和谷氨酸-5-半醛脱氢 酶(ProA)的重组载体，P4H的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No. 1所示，P4H由SEQ ID No.2 所示的P4H基因编码，ProB的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.3所示，ProA的氨基酸序列 如序列表中SEQ ID No.5所示，ProB由SEQ ID No.4的第12-1115位核苷酸所示的ProB基因 编码，ProA由SEQ ID No.4的第1127-2380位核苷酸所示的ProA基因编码。具体方法如下：
[0147] 制备名称为pYBIS的载体：以P15ASal I_F:GTCGACGTGCGTCAGCAGAATATGTG和 StrSph I_R: ACCTACCAAGGCAACGCTAT为引物，以载体pACYCDuet-1 (Novagen公司）为模板扩 增得到含有复制子和链霉素抗性基因的DNA片段，将该DNA片段命名为ori-aadA;利用引物 araC-TrrnB_sphI_F:GCACATGCATGCAATGTGCCTGTCAAATG和araC-TrrnB_SalI_R: ATATACGCGTCGACGAAAGGCCCAGTCTTTC，从pBAD-hisB(invitrogen公司，货号：V430-01)扩增 得到含有PBAD启动子、酶切位点和终止子的DNA片段，将该DNA片段命名为araC-TrrnB。分别 用SphI和Sal I双酶切ori-aadA和araC-TrrnB，将or i-aadA双酶切得到的大片段和araC-TrrnB双酶切得到的大片段连接，得到重组载体PYBlSt3PYBlS的核苷酸序列如SEQ ID No. 15 所示。SEQ ID No. 15中，第1667-3450位为复制子和链霉素抗性基因，第86-1660位为pBAD启 动子、多克隆位点和终止子。
[0148] 将重组载体pYBIS的Bgin和EcoR I识别序列间的DNA片段替换为序列表中SEQ ID No. 2所示的DNA分子（即P4H基因），得到重组载体pYBI s-p4h。重组载体pYBl s-p4h表达SEQ ID No. 1所示的Pfflt3PYBls-Ptt和pYBIS的差别仅在于：pYBls-p4h为将pYBls的Bgl Π 和 EcoR I识别序列间的DNA片段替换为序列表中SEQ ID No.2所示的DNA分子得到的重组载 体。
[0149] 将重组载体pYBls_p4h的EcoR I和SacI识别序列间的DNA片段替换为序列表中SEQ 10如.4所示的0嫩分子，得到重组载体?耶4(图1)。？耶4和?￥818-?411的差别仅在于:？冊八为 将pYBls-p4h的EcoR I和SacI识别序列间的DNA片段替换为序列表中SEQ ID No.4所示的 DNA分子得到的重组载体。重组载体pHBA表达SEQ ID No. 1所示的P4H、SEQ ID No. 3所示的 ProB和SEQ ID No .5所示的ProA。
[0150] 其中，SEQ ID No.4的第2-6位核苷酸为RBS的序列，SEQ ID No.4的第12-1115位核 苷酸为ProB基因的序列，编码SEQ ID No.3所示的ProB，SEQ ID No.4的第1127-2380位核苷 酸为ProA基因的序列，编码SEQ ID No. 5所示的ProA。
[0151] 2、重组细胞的构建
[0152] 2.1 突变株 Δρ0ΧΒ: :acs的构建
[0153]首先构建大肠杆菌K12的突变株Δ p〇xB: :acs，Δ p〇xB: :acs突变株为将大肠杆菌 K12的丙酮酸氧化酶(PoxB)编码基因替换为乙酰辅酶A合成酶(Acs)编码基因的菌株。Δ poxB: :acs突变株的构建如下：
[0154] (1)宿主菌的制备：
[0155]将pKD46质粒(Clontech公司产品）通过氯化钙转化法转化至大肠杆菌K12,得到含 有质粒PKD46的重组大肠杆菌K12/pKD46。重组大肠杆菌K12/pKD46在阿拉伯糖诱导后，表达 λ噬菌体的3个重组蛋白，宿主菌就具有了同源重组的能力。
[0156] (2)poxBup-FumA-acs_kan-poxBdown 片段的制备：
[0157] poxBup-FumA-acs-kan-poxBdown片段的核苷酸序列如SEQIDNo·6，由3970个核 苷酸组成，含有(a)大肠杆菌FumA启动子(SEQ ID No.6第62-195位）、（b)大肠杆菌乙酰CoA 合成酶基因（acs) (SEQ ID No. 6第216至2177位（由1962个核苷酸组成））、（C)TrrnB终止子 (SEQ ID如.6第2184-2440位）、（(1)带?1?1'侧翼的卡那霉素抗性基因 $1?1'-1?11141?1')(卡那霉 素抗性基因如SEQ ID Νο·6第2858-3652位，FRT序列为： gaagttcctatactttctagagaataggaacttcg，FRT-kan_FRT的核苷酸序列如SEQ ID No · 6第 2450 - 3877位）、（e)poxB的上游同源臂poxBup(SEQ ID 如.6第1-61位）、（〇?(?8的下游同 源臂poxBdown(SEQ ID 吣.6第3907-3970位）。
[0158] (3)同源重组：
[0159] 将SEQ ID 1^〇.6所不的口(《13卯-?1111^-&〇8-1^11-口(《13(1〇￥11片段电转入重组大肠杆菌 K12/pKD46的感受态细胞，利用卡那霉素平板(卡那霉素的浓度为50μg/ml)筛选到阳性转化 体一将poxBup-FumA-acs-kan-poxBdown转入重组大肠杆菌K12/pKD46得到的重组大肠杆 菌，命名为 Δ p〇xB: :acs突变株。用poxB_up_480_F(TGGGTAGAGCAGGAAGTGAAA)和poxB_down_ 410_r (TGCGGGCGAAATGGA)进行PCR验证，从Δ ρ〇χΒ: : acs突变株的基因组DNA中扩增得到一 个约4500bp的片段，从大肠杆菌K12的基因组DNA中扩增得到一个约2600bp的片段。其中，弓丨 物结合位置分别是大肠杆菌K12的poxB基因的上游和下游区域。测序分析结果表明Δ poxB: :acs突变株的基因组上没有丙酮酸氧化酶基因（ροχΒ)，Δ p〇xB: :acs突变株的基因组 上含有SEQ ID吣.6所示的?1111^-3〇8-1?111片段。
[0160] 2.2突变株 AsucA AputA的构建
[0161] 具体采用如下Pl噬菌体介导的转染法构建：
[0162] (1)将Δ sucA的FRT位点之间的卡那霉素抗性基因删除，消除Δ sucA的卡那霉素抗 性，得到大肠杆菌突变体Δ sucAAkan(简称Δ sucAAkan)。具体如下:首先，利用表达Flp重 组酶的质粒pCP20(Clontech公司）化学转化Δ sucA，将Δ sucA的FRT位点之间的卡那霉素抗 性基因删除，消除A sucA的卡那霉素抗性，得到大肠杆菌突变体△ sucAAkan(简称△ sucA Akan)。以Δ sucAAkan的基因组DNA为模板，用弓丨物对sucA_up550F (AACCTCTTGTCCGTCTTTCTG)和 sucA_down353R(CGCATCGTTGTTTTGCTC)进行 PCR 验证，扩增得 到一个约1000 bp的片段，结果表明卡那霉素抗性已经消除。△ sucAAkan在涂有卡那霉素的 LB平板(卡那霉素的浓度为50μg/ml)上不生长，表明已经消除Δ sucA的卡那抗性。
[0163] (2)将AsucAAkan的脯氨酸脱氢酶(PutA)替换为卡那霉素抗性基因得到的突变 体Δ sucA Δ putA。具体如下：（a)获得供体菌的Pl:将供体菌Δ putA接种于含IOmmo 1/L MgCl2、5mmol/L CaCl2和0.1%葡萄糖的LB培养基中，培养lh，加入野生型Pl噬菌体，培养l-3h。加几滴氯仿再摇几分钟，离心取上清即得到噬菌体Pl VirΛputA。（b)利用Pl噬菌体转导 技术构建大肠杆菌敲除株PG03，具体步骤如下:过夜培养△ sucAAkan(受体菌），1.5mL菌液 1000 Og离心2分钟后，用0.75mL的Pl盐溶液(溶剂为水，溶质为IOmM CaCl2和5mM MgS〇4)重悬 厶8此4厶1?111细胞，将10(^1^噬菌体？1￥化厶口此4与10(^1^ 8此4厶1?111细胞悬浮液混合，孵育 30min，用Iml LB和200yL柠檬酸钠，37°C继续培养Ih，离心收集，用IOOyL LB重悬后，涂布含 卡那霉素的LB平板(卡那霉素的浓度为50μg/ml)上，筛选阳性克隆（能在该含卡那霉素的平 板上生长的克隆）即PG03，以阳性克隆Δ sucA Δ putA的基因组DNA为模板，用putA_up604_f putA的基因组DNA中扩增得到一个约1000 bp的片段。测序结果表明Δ sucA Δ putA是将Δ sucAAkan的脯氨酸脱氢酶(PutA)替换为卡那霉素抗性基因得到的突变体。
[0164] 2.2重组细胞的构建
[0165] 将步骤1的重组载体pHBA分别导入大肠杆菌K12及Λ putA菌株、Λ sucA菌株、Λ aceA菌株、Δ ρ〇χΒ: :acs和Δ sucA Δ putA突变株中，分别得到含有重组载体ρΗΒΑ的工程菌株 Λ sucA Λ putA〇
[0166] 将步骤1中的重组载体pYBIS和pYBls-p4h分别导入大肠杆菌K12中，得到含有目的 载体的重组细胞pYBIS/BW和pYBls-p4h/BW。
[0167] 分别将 pYBlS/BW、pYBls-p4h/BW、pHBA/BW、pHBA/AputA、pHBA/ASucA、pHBA/A aceA和ρΗΒΑ/Δρ 0ΧΒ: :acs于5052自诱导培养基中、在30°C下进行培养，并用SDS-PAGE电泳 分析各重组细胞中蛋白的表达，结果如图2和图3所示。结果显示，pYBl S/BW不表达P4H、Pr〇B 和ProA;pYBls_p4h/BW表达P4H，不表达ProB和ProA;pHBA/BW、pHBA/AputA、pHBA/A sucA、 pHBA/AaceA和ρΗΒΑ/Δρ〇χΒ: :acs均表达P4H、ProB和ProA。
[0168] 实施例2、利用实施例1的重组细胞制备反式-4-羟基-L-脯氨酸
[0169] 利用实施例1的重组细胞制备反式-4-羟基-L-脯氨酸，实验重复三次，每次重复实 验的具体步骤如下：
[0170] 从平板上挑取pHBA/BW的单菌落于LB培养基中，于37 °C、220rpm下培养IOh，得到 pHBA/BW菌液；按照1 %接种量将pHBA/BW菌液接种于5052自诱导培养基中，于30°C、220rpm 下培养16h，得到pHBA/BW培养液;将pHBA/BW培养液于4°C、4200rpm下离心10min，弃上清液， 得到pHBA/BW粗菌体。用氯化钠质量百分浓度为0.85%的氯化钠水溶液洗涤pHBA/BW粗菌体 2次，每次均在4 °C、420Or pm下离心10m i η，收集菌体，得到pHBA/BW菌体。
[0171] 将pHBA/BW菌体重悬于ImL转化液(转化液由超纯水和溶质组成，溶质及其浓度分 别为IOOmM Tris、50mM谷氨酸钠（生工生物工程（上海）股份有限公司，货号：A602012)、 1.5g/100mL葡萄糖、4mM FeS〇4和8mM维生素 C，用盐酸调节pH至pH7.0)中，得到反式-4-羟 基-L-脯氨酸的制备体系，反式-4-羟基-L-脯氨酸的制备体系pHBA/BW的浓度为300D/mL (30mg/mL细胞(细胞湿重/体积））；将反式-4-羟基-L-脯氨酸的制备体系于30°C、250rpm下 孵育12h，得到pHBA/BW菌体反应液，用氯胺T法测定pHBA/BW菌体反应液中反式-4-羟基-L-脯氨酸的含量。
[0172] 按照如下氯胺T法制备标准曲线、测定反式-4-羟基-L-脯氨酸含量，用到的标准品 为反式-4-羟基-L-脯氨酸(阿拉丁公司，产品编号Hll100 5):
[0173] (1)将样品按照一定比例稀释后，取100μ 1于2mL离心管中，向离心管中加入200μ 1 异丙醇和100μ1氧化剂溶液(氧化剂溶液为将7% (质量百分比浓度)氯胺T水溶液与醋酸-柠 檬酸缓冲液(pH 6.0)按照1:4的体积比混合得到的溶液，其中，醋酸-柠檬酸缓冲液(ρΗ6.0) 由水与溶质组成，溶质及其浓度分别为34.4g/L无水醋酸钠、37.5g/L二水合柠檬酸钠、 5.5g/L-水合梓檬酸和385mL/L异丙醇）。
[0174] (2)摇匀，室温放置4分钟；向离心管中加入200μ1新配制的艾氏试剂(艾氏试剂由 对二甲氨基苯甲醛、高氯酸与异丙醇组成，艾氏试剂中各物质的比例关系为:二甲氨基苯甲 醛:高氯酸：异丙醇=Img: 4mL: 6mL)，摇匀，置于60 °C水浴中20分钟，自来水冷却至室温;于 560nm处检测吸光值。
[0175] Hyp标准曲线的结果如表1，标准曲线为y = 10.6x+0.0845，R2 = 0.9988_4)。
[0176] 表l、Hyp标准曲线
[0178] 按照上述方法，将pHBA/BW分别替换为大肠杆菌K12、pYBlS/BW、pYBls-p4h/BW、 pHBA/AputA、pHBA/A sucA、pHBA/AaceA和ρΗΒΑ/Δρ〇χΒ: :acs，其他步骤均不变，分别检测 大肠杆菌K12菌体反应液、pYBIS/BW菌体反应液、pYBI s_p4h/BW菌体反应液、ρΗΒΑ/ Δ putA菌 体反应液、pHBA/AsucA菌体反应液、pHBA/AaceA菌体反应液和ρΗΒΑ/Δρ〇χΒ: :acs菌体反 应液中反式-4-羟基-L-脯氨酸的含量。
[0179] 结果（图5)显示，大肠杆菌Kl 2菌体反应液中无反式-4-羟基-L-脯氨酸，pHBA/BW菌 体反应液中反式-4-羟基-L-脯氨酸的含量为10.66 ± 0.06mM，pYBl S/BW菌体反应液中反式- 4-羟基-L-脯氨酸的含量为0.06 ± 0.02mM，pYBl s-p4h/BW菌体反应液中反式-4-羟基-L-脯 氨酸的含量为〇. 79 ± 0.07mM，ρΗΒΑ/Δ putA菌体反应液中反式-4-羟基-L-脯氨酸的含量为 18.13±0.211111，口冊厶/&811〇厶菌体反应液中反式-4-羟基-1^-脯氨酸的含量为20.94± 0.57mM，ρΗΒΑ/ Δ aceA菌体反应液中反式-4-羟基-L-脯氨酸的含量为14.74 ± 0.6 ImM，ρΗΒΑ/ 八卩(《13::3〇8菌体反应液中反式-4-羟基-1^-脯氨酸的含量为13.67±0.4511^[。表明4￥1315/ BW转化谷氨酸钠几乎不产生反式-4-羟基-L-脯氨酸，pYBls-p4h/BW转化谷氨酸钠可产生极 少量的反式-4-羟基-L-脯氨酸，pHBA/BW转化谷氨酸钠产生的反式-4-羟基-L-脯氨酸分别 为pYB I s/BW和pYB I s-p4h/BW的178倍和13.43倍，表明，P4H、ProB和ProA可以大幅度提高大 肠杆菌K12转化谷氨酸钠得到的反式-4-羟基-L-脯氨酸的产量；pHBA/AputA、ρΗΒΑ/Δ 81^4冊4/八3064和口冊4/八口0113::308转化谷氨酸钠产生的反式-4-羟基-]^-脯氨酸分别 为pHBA/BW的1.70倍、1.96倍、1.38倍和1.28倍，表明，SUcA基因、aceA基因和PUtA基因的缺 失可以提高大肠杆菌K12转化谷氨酸钠得到的反式-4-羟基-L-脯氨酸的产量，poxB基因的 缺失与acs基因的导入也可以提高大肠杆菌K12转化谷氨酸钠得到的反式-4-羟基-L-脯氨 酸的产量。
[0180] 实施例3、利用重组细胞制备反式-4-羟基-L-脯氨酸条件的优化
[0181] 1、α-酮戊二酸(a-KG)对反式-4-羟基-L-脯氨酸产量的影响
[0182] 根据实施例2的利用重组细胞制备反式-4-羟基-L-脯氨酸的方法，将pHBA/BW替换 为ρΗΒΑ/ △ putA，并将转化液分别替换为OmMa-KG转化液(OmMa-KG转化液由超纯水和溶质组 成，溶质及其浓度分别为IOOmM Tris、50mM谷氨酸钠、4mM FeSO4和8mM维生素 C，用盐酸调节 pH至pH7.0)、5mMa-KG转化液(5mMa-KG转化液由超纯水和溶质组成，溶质及其浓度分别为 5mMa-KG、IOOmM Tris、50mM谷氨酸钠、4mM FeS〇4和8mM维生素 C，用盐酸调节pH至pH7 · 0)、 2 5mMa -KG转化液（2 5mMa -KG转化液由超纯水和溶质组成，溶质及其浓度分别为2 5mMa -KG、 IOOmM Tris、50mM谷氨酸钠、4mM FeS〇4和8mM维生素 C，用盐酸调节pH至pH7 · 0)、50mMa-KG转 化液(50mMa-KG转化液由超纯水和溶质组成，溶质及其浓度分别为50mMa-KG、IOOmM Tris、 50mM谷氨酸钠、4mM FeS〇4和8mM维生素 C，用盐酸调节pH至pH7 · 0)、IOOmMa-KG转化液（IOOmM 〇-队转化液由超纯水和溶质组成，溶质及其浓度分别为10011^€[-1^、10011^1^8、5011^谷氨 酸钠、4mM FeS04和8mM维生素 C，用盐酸调节pH至pH7.0)，其他步骤均不变，分别检测不同浓 度的α-KG对反式-4-羟基-L-脯氨酸产量的影响，结果如图6所示。
[0183] 结果显示，当转化液为OmMa-KG转化液时，反式-4-羟基-L-脯氨酸的产量为5.94 土 0.14mM;当转化液为5mMa-KG转化液时，反式-4-羟基-L-脯氨酸的产量为9.10 ± 0.06mM，为 OmMa-KG转化液的1.53倍;当转化液为25mMa-KG转化液时，反式-4-羟基-L-脯氨酸的产量为 12.91±0.34禮，为〇!111€1-1?转化液的2.17倍 ；当转化液为5〇1111€1-队转化液时，反式-4-羟基-L-脯氨酸的产量为18.51 ± 0.87mM，为OmMa-KG转化液的3.12倍；当转化液为IOOmMa-KG转化 液时，反式-4-羟基-L-脯氨酸的产量为15.18± 0.32mM，为OmMa-KG转化液的2.56倍。结果表 明，当向转化液中加入a-KG时，可以提高反式-4-羟基-L-脯氨酸的产量，当转化液中a-KG的 浓度为50mM时，反式-4-羟基-L-脯氨酸的产量最高。
[0184] 2、葡萄糖对反式-4-羟基-L-脯氨酸产量的影响
[0185] 根据实施例2的利用重组细胞制备反式-4-羟基-L-脯氨酸的方法，将pHBA/BW替换 为pHBA/ △ putA，并将转化液分别替换为0葡萄糖转化液(0葡萄糖转化液由超纯水和溶质组 成，溶质及其浓度分别为IOOmM Tris、50mM谷氨酸钠、4mM FeSO4和8mM维生素 C，用盐酸调节 pH至pH7.0)、0.5g/100mL葡萄糖转化液(0.5g/100mL葡萄糖转化液由超纯水和溶质组成，溶 质及其浓度分别为〇.5g/100mL葡萄糖、IOOmM Tris、50mM谷氨酸钠、4mM FeSCU和8mM维生素 C，用盐酸调节pH至pH7.0)、1.0g/100mL葡萄糖转化液（I.0g/100mL葡萄糖转化液由超纯水 和溶质组成，溶质及其浓度分别为l.〇g/l〇〇mL葡萄糖、IOOmM Tris、50mM谷氨酸钠、4mM FeS〇4和8mM维生素 C，用盐酸调节pH至pH7 ·0)、1 · 5g/100mL葡萄糖转化液（1 · 5g/100mL葡萄 糖转化液由超纯水和溶质组成，溶质及其浓度分别为1.5g/100mL葡萄糖、IOOmM Tris、50mM 谷氨酸钠、4mM FeS〇4和8mM维生素 C，用盐酸调节pH至pH7.0)、2.0g/100mL葡萄糖转化液 (2.0g/100mL葡萄糖转化液由超纯水和溶质组成，溶质及其浓度分别为2.0g/100mL葡萄糖、 IOOmM Tris、50mM谷氨酸钠、4mM FeS〇4和8mM维生素 C，用盐酸调节pH至pH7.0)，其他步骤均 不变，分别检测不同浓度的葡萄糖对反式-4-羟基-L-脯氨酸产量的影响，结果如图7所示。
[0186] 结果显示，当转化液为0葡萄糖转化液时，反式-4-羟基-L-脯氨酸的产量为5.94 土 0 · 14mM;当转化液为0 · 5g/100mL葡萄糖转化液时，反式-4-羟基-L-脯氨酸的产量为13 · 5 土 0.47mM，为0葡萄糖转化液的2.27倍；当转化液为1.0g/100mL葡萄糖转化液时，反式-4-羟 基-L-脯氨酸的产量为15.22±0.3mM，为0葡萄糖转化液的2.56倍；当转化液为1.5g/100mL 葡萄糖转化液时，反式-4-羟基-L-脯氨酸的产量为13.67 ±0.35mM，为0葡萄糖转化液的 2.30倍；当转化液为2.0g/100mL葡萄糖转化液时，反式-4-羟基-L-脯氨酸的产量为10.66 土 0.06mM，为0葡萄糖转化液的1.79倍。结果表明，当向转化液中加入葡萄糖时，可以提高反 式-4-羟基-L-脯氨酸的产量，当转化液中葡萄糖的浓度为1.0g/100mL时，反式-4-羟基-L-腫氣酸的广量最尚。
[0187] 3、聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)对反式-4-羟基-L-脯氨酸产量的影响
[0188] 根据实施例2的利用重组细胞制备反式-4-羟基-L-脯氨酸的方法，将pHBA/BW替换 为pHBA/ Δ putA，并将转化液分别替换为OTriton X-100转化液(OTriton X-100转化液由超 纯水和溶质组成，溶质及其浓度分别为1.5g/100mL葡萄糖、IOOmM Tris、50mM谷氨酸钠、4mM FeS〇4和8mM维生素 C，用盐酸调节pH至pH7 · 0)、0 · lg/100mL Triton X-100转化液（0 · lg/ IOOmL Triton X-IOO转化液由超纯水和溶质组成，溶质及其浓度分别为O.lg/lOOmL Triton X-100、l .5g/100mL葡萄糖、IOOmM Tris、50mM谷氨酸钠、4mM FeS〇4和8mM维生素 C， 用盐酸调节pH至pH7.0)，其他步骤均不变，分别检测不同浓度的Triton X-100对反式-4-羟 基-L-腫氨酸广量的影响。
[0189] 结果显示，当转化液为OTriton X-100转化液时，反式-4-羟基-L-脯氨酸的产量为 13.67 ±0.35mM;当转化液为0. lg/100mL Triton X-100转化液时，反式-4-羟基-L-脯氨酸 的产量为28.74 ±0.13mM，为OTriton X-100转化液的2.10倍。结果表明，当向转化液中加入 Triton X-100时，可以提高反式-4-羟基-L-脯氨酸的产量，当转化液中Triton X-100的质 量百分比浓度为0.1 gAOOmL时，反式-4-羟基-L-脯氨酸的产量最高。
[0190] 4、优化后的反应液的反式-4-羟基-L-脯氨酸的产量
[0191] 从平板上挑取ρΗΒΑ/ Δ putA的单菌落于LB培养基中，于37°C、220rpm下培养10h，得 到pHBA/ Δ putA菌液;按照1 %接种量将pHBA/ Δ putA菌液接种于5052自诱导培养基中，于30 °C、220rpm下培养16h，得到ρΗΒΑ/ Δ putA培养液;将ρΗΒΑ/ Δ putA培养液冰浴IOmin后于4°C、 4200rpm下离心10min，弃上清液，得到ρΗΒΑ/ Δ putA粗菌体。用氯化钠质量百分浓度为 0.85%的氯化钠水溶液洗涤ρΗΒΑ/ Δ putA粗菌体2次，每次均在4°C、4200rpm下离心10min， 收集菌体，得到ρΗΒΑ/Δ putA菌体。
[0192] 将ρΗΒΑ/ Δ putA菌体重悬于ImL转化液1 (转化液1由超纯水和溶质组成，溶质及其 浓度分别为IOOmM Tris、50mM谷氨酸钠、1.5g/100mL葡萄糖、O.lg/lOOmL Triton X-100、 4mM FeS〇4和8mM维生素 C，用盐酸调节pH至pH7.0)中，得到反式-4-羟基-L-脯氨酸的制备体 系，反式-4-羟基-L-脯氨酸的制备体系中pHBA/AputA的浓度为300D/mL(即30mg/mL细胞 (细胞湿重/体积））；将反式-4-羟基-L-脯氨酸的制备体系于30°C、250rpm下孵育12h，得到 ρΗΒΑ/ Δ putA菌体反应液1，用氯胺T法测定ρΗΒΑ/ Δ 口此4菌体反应液1中反式-4-羟基-1^-脯 氨酸的含量。
[0193] 结果显示，ρΗΒΑ/ Δ putA菌体反应液1中反式-4-羟基-L-脯氨酸的含量为28.7mM， 为转化液为I .〇g/l〇〇mL葡萄糖转化液时，反式-4-羟基-L-脯氨酸的产量的1.89倍，为转化 液为〇. IgAOOmL Triton X-100转化液时，反式-4-羟基-L-脯氨酸的产量的1.025倍。
[0194] 实施例4、在最优条件下利用重组细胞制备反式-4-羟基-L-脯氨酸
[0195] 根据实施例2的利用重组细胞制备反式-4-羟基-L-脯氨酸的方法，将pHBA/BW分别 替换为ρΗΒΑ/ Δ SUcA、pHBA/ Δ putA和ρΗΒΑ/ Δ sucA Δ putA。转化液由超纯水和溶质组成，溶 质及其浓度分别为IOOmM Tris、50mM谷氨酸钠、4mM FeS〇4、8mM维生素 C、1.0g/100mL葡萄糖 和0. lg/100mL Triton X-100，用盐酸调节pH至pH7.0。其他步骤均不变，分别检测反式-4-羟基-L-脯氨酸产量(图8)。
[0196] 结果显示，最优转化液条件下，pHBA/BW菌体反应液中反式-4-羟基-L-脯氨酸的含 量为16.74±0.37mM，ρΗΒΑ/ Δ sucA菌体反应液中反式-4-羟基-L-脯氨酸的含量为22.35 土 0.99mM，为pHBA/BW菌体反应液产量的1.34倍。ρΗΒΑ/ Δ putA菌体反应液中反式-4-羟基-L-脯氨酸的含量为39.80 ± 0.53mM，为pHBA/BW菌体反应液产量的2.38倍。ρΗΒΑ/ Δ sucA Δ putA 菌体反应液中反式-4-羟基-L-脯氨酸的含量为17.79 ± 0.47mM，为pHBA/BW菌体反应液产量 的1.06倍。
【主权项】
1. 反式-4-羟基-L-脯氨酸的生产方法，包括利用重组细胞与底物进行反应得到反式-4_羟基-L-脯氨酸； 所述重组细胞的构建方法，包括对受体细胞进行Al)、A2)、A3)和A4)的改造得到重组细 胞的步骤： A1)向所述受体细胞中导入L-脯氨酸-4-羟化酶基因； A2)向所述受体细胞中导入谷氨酸-5-激酶基因； A3)向所述受体细胞中导入谷氨酸-5-半醛脱氢酶基因； 八4)为如下131)、132)、133)和134)这四种中的任一种、任两种、任二种或四种： B1)将所述受体细胞的α -酮戊二酸脱氢酶基因敲除； Β2)将所述受体细胞的异柠檬酸裂解酶基因敲除； Β3)为如下Β31)和Β32): Β31)将所述受体细胞的丙酮酸氧化酶基因敲除； Β32)向所述受体细胞中导入乙酰辅酶Α合成酶基因； B4)将所述受体细胞的脯氨酸脱氢酶基因敲除； 所述受体细胞为微生物细胞、非人动物细胞或植物细胞。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述受体细胞为大肠杆菌。3. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述底物为谷氨酸或/和可溶性谷氨酸 盐。4. 根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于:所述L-脯氨酸-4-羟化酶是如下G1) 或G2)的蛋白质： G1)氨基酸序列是SEQ ID No.l的蛋白质； G2)在SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨 基酸残基得到的具有所述L-脯氨酸-4-羟化酶功能的由G1)衍生的蛋白质； 所述谷氨酸-5-激酶是下述H1)或H2)的蛋白质： H1)氨基酸序列为SEQ ID No.3的蛋白质； H2)在SEQ ID No.3所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨 基酸残基得到的具有所述谷氨酸-5-激酶功能的由H1)衍生的蛋白质； 所述谷氨酸-5-半醛脱氢酶是下述I 1)或12)的蛋白质： 11) 氨基酸序列为SEQ ID No.5的蛋白质； 12) 在SEQ ID No.5所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨 基酸残基得到的具有所述谷氨酸-5-半醛脱氢酶功能的由I 1)衍生的蛋白质； 所述α -酮戊二酸脱氢酶是下述J1)或J2)的蛋白质： J1)氨基酸序列为SEQ ID No.7的蛋白质； J2)在SEQ ID No.7所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨 基酸残基得到的具有所述α-酮戊二酸脱氢酶功能的由J1)衍生的蛋白质； 所述脯氨酸脱氢酶是下述Κ1)或Κ2)的蛋白质： Κ1)氨基酸序列为SEQ ID No.8的蛋白质； K2)在SEQ ID No.8所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨 基酸残基得到的具有所述脯氨酸脱氢酶功能的由K1)衍生的蛋白质； 所述异柠檬酸裂解酶是下述LI)或L2)的蛋白质： L1)氨基酸序列为SEQ ID No.9的蛋白质； L2)在SEQ ID No.9所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨 基酸残基得到的具有所述异柠檬酸裂解酶功能的由L1)衍生的蛋白质； 所述丙酮酸氧化酶是下述Ml)或M2)的蛋白质： Ml)氨基酸序列为SEQ ID No. 10的蛋白质； M2)在SEQ ID No. 10所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨 基酸残基得到的具有所述丙酮酸氧化酶功能的由Ml)衍生的蛋白质； 所述乙酰辅酶A合成酶是下述N1)或N2)的蛋白质： N1)氨基酸序列为SEQ ID No. 11的蛋白质； N2)在SEQ ID No. 11所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨 基酸残基得到的具有所述乙酰辅酶A合成酶功能的由N1)衍生的蛋白质。5. 根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于:所述L-脯氨酸-4-羟化酶基因为 下述G11) -G13)中的任一种DNA分子： G11)编码序列是SEQ ID如.2所示的〇0嫩分子或基因组0嫩； G12)在严格条件下与G11)限定的DNA分子杂交且编码所述L-脯氨酸-4-羟化酶的cDNA 分子或基因组DNA; G13)与G11)或G12)限定的DNA分子具有75%以上的同一性且编码所述L-脯氨酸-4-羟 化酶的cDNA分子或基因组DNA; 所述谷氨酸-5-激酶基因为下述Hll)-H13)中的任一种DNA分子： H11)编码序列是SEQ ID如.4所示的〇0嫩分子或基因组0嫩； H12)在严格条件下与H11)限定的DNA分子杂交且编码所述谷氨酸-5-激酶的cDNA分子 或基因组DNA; H13)与H11)或H12)限定的DNA分子具有75%以上的同一性且编码所述谷氨酸-5-激酶 的cDNA分子或基因组DNA; 所述谷氨酸-5-半醛脱氢酶基因为下述I 11)-1 13)中的任一种DNA分子： 111) 编码序列是SEQ ID No.6所示的cDNA分子或基因组DNA; 112) 在严格条件下与I 11)限定的DNA分子杂交且编码所述谷氨酸-5-半醛脱氢酶的 cDNA分子或基因组DNA; 113) 与111)或112)限定的DNA分子具有75%以上的同一性且编码所述谷氨酸-5-半醛 脱氢酶的cDNA分子或基因组DNA; 所述乙酰辅酶A合成酶基因为下述N11 )-N13)中的任一种DNA分子： Nil)编码序列是SEQ ID No. 12所示的cDNA分子或基因组DNA; N12)在严格条件下与Nil)限定的DNA分子杂交且编码所述乙酰辅酶A合成酶的cDNA分 子或基因组DNA; N13)与Nil)或N12)限定的DNA分子具有75%以上的同一性且编码所述乙酰辅酶A合成 酶的cDNA分子或基因组DNA。6. 根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于:所述重组细胞与所述底物在体系 R中进行反应;所述体系R由水、Tris、FeS〇4、维生素 C和W组成，所述W为α-酮戊二酸、葡萄糖 和Triton X-100这三种中的任一种、任两种或三种。7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于:所述体系R为下述体系R1-R8中任一种： 体系R1:体系R1由水和溶质组成;所述溶质及其浓度分别为lOOmM Tris、0.5-2g/100mL 葡萄糖、0.05-0.2g/100mL Triton X-100、4mM FeS〇4和8mM维生素C，pH7.0; 体系R2:体系R2由水和溶质组成;所述溶质及其浓度分别为lOOmM Tris、0.5-2g/100mL 葡萄糖、4mM FeSCU和8mM维生素C，pH7.0; 体系R3:体系R3由水和溶质组成;所述溶质及其浓度分别为lOOmM Tris、5-100mMa-酮 戊二酸、4mM FeS〇4和8mM维生素C，pH7.0; 体系R4:体系R4由水和溶质组成；所述溶质及其浓度分别为lOOmM Tris、0.05-0.2g/ 100mL Triton X-100、4mM FeS〇4和8mM维生素C，pH7.0; 体系R5:体系R5由水和溶质组成；所述溶质及其浓度分别为lOOmM Tris、4mM FeS〇4和 8mM 维生素 C，pH7.0; 体系R6:体系R6由水和溶质组成；所述溶质及其浓度分别为lOOmM Tris、5-100mMa-酮 戊二酸、0.05-0.2g/100mL Triton X-100、4mM FeS〇4和8mM维生素C，pH7.0; 体系R7:体系R7由水和溶质组成;所述溶质及其浓度分别为lOOmM Tris、0.5-2g/100mL 葡萄糖、5-100mMa-酬戊二酸、4mM FeSCU和8mM维生素C，pH7.0; 体系R8:体系R8由水和溶质组成;所述溶质及其浓度分别为lOOmM Tris、0.5-2g/100mL 葡萄糖、5-100mMa-酮戊二酸、0.05-0.2g/100mL Triton X-100、4mM FeS〇4和8mM维生素 C， ρΗ7·0〇8. 权利要求1-5中任一所述重组细胞。9. 生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的成套试剂，为D1)或D2): D1)由权利要求8所述重组细胞与a)组成的成套试剂； 所述a)为α-酮戊二酸、葡萄糖和Triton X-100这三种中的任一种、任两种或三种； D2)由用于构建权利要求8所述的重组细胞的生物材料与所述a)组成的成套试剂； 所述用于构建权利要求8所述的重组细胞的生物材料，为C1)或C2): C1)用于构建权利要求8所述的重组细胞的成套DNA分子，含有权利要求1-5中任一所述 方法中的所述L-脯氨酸-4-羟化酶基因、所述谷氨酸-5-激酶基因和所述谷氨酸-5-半醛脱 氢酶基因这三个基因中的至少一个基因； C2)含有C1)所述成套DNA分子中所述三个基因、或其中任两个基因的载体。10. 根据权利要求9所述的成套试剂，其特征在于:C1)所述成套DNA分子由权利要求1-5 中任一所述方法中的所述L-脯氨酸-4-羟化酶基因、所述谷氨酸-5-激酶基因、所述谷氨酸-5-半醛脱氢酶基因和所述乙酰辅酶A合成酶基因组成，这四个基因各自独立包装； C2)所述载体为含有C1)所述成套DNA分子中所述四个基因、或其中任三个基因、或其中 任两个基因的载体。11. 下述任一应用： M1、权利要求8所述重组细胞在制备反式-4-羟基-L-脯氨酸中的应用； M2、权利要求8所述重组细胞在生物转化谷氨酸或可溶性谷氨酸盐制备反式-4-羟基-L-脯氨酸中的应用； M3、权利要求9或10所述成套试剂在制备反式-4-羟基-L-脯氨酸中的应用； M4、权利要求9或10所述成套试剂在生物转化谷氨酸或可溶性谷氨酸盐制备反式-4-羟 基-L-脯氨酸中的应用； M5、权利要求1或4所述α-酮戊二酸脱氢酶基因和/或所述异柠檬酸裂解酶基因和/或 所述丙酮酸氧化酶基因和/或所述脯氨酸脱氢酶基因的敲除在生产反式-4-羟基-L-脯氨酸 中的应用。
【文档编号】C12N1/21GK106086102SQ201610248615
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年4月20日 公开号201610248615.5, CN 106086102 A, CN 106086102A, CN 201610248615, CN-A-106086102, CN106086102 A, CN106086102A, CN201610248615, CN201610248615.5
【发明人】林白雪, 崔丽, 袁慎键, 陶勇
【申请人】中国科学院微生物研究所