利用油茶粕降解制还原糖的方法
【专利摘要】本发明是提供一种利用油茶粕降解制还原糖的方法，以油茶粕为原料，其是将油茶粕粉碎，然后将糙皮侧耳活化菌种的液体培养接种于粉碎的油茶粕中，控制糙皮侧耳活化菌种接种于油茶粕的降解反应温度为30?70℃，pH值为3.0?7.0，糙皮侧耳活化菌种的接种量为0.5?4.5mL/g，CuSO4添加浓度为1×10?5?1×10?1mol/L，MnSO4添加浓度为1×10?5?1×10?1mol/L。以油茶粕为原料,接种白腐真菌中的糙皮侧耳菌种,从而为将油茶粕中的木质纤维素降解转化为还原糖，进而为后续生产生物液体燃料提供了方法，也进一步的拓展了油茶粕的新用途。
【专利说明】
利用油茶粕降解制还原糖的方法
[0001 ]
技术领域： 本发明属于生物技术领域，涉及一种植物纤维转化为的还原糖方法，特别是一种利用 油茶柏降解制还原糖的方法。
[0002]
【背景技术】： 糙皮侧耳菌种是白腐真菌中的一种，俗称平茹，是世界第三大人工栽培食用菌，其主要 是作为菌种用于制备平茹等食用菌。但将糙皮侧耳菌种应用于其他方面还较少，或者是应 用不多。而真菌、细菌、放线菌及相应微生物群落共同作用可对木质纤维素进行降解。当今 世界对能源需求的与日倶增和人类环保意识的增强极大地加快了寻找新的、绿色的可替代 能源，特别是生物液体燃料。在一定条件下，纤维素是可以与水发生反应，造成氧桥的断裂， 同时加入水分子，纤维素长链断裂成短链，释放出葡萄糖。油茶柏是油茶籽被榨取食用油后 剩下的饼柏，一直以来，油茶柏大多皆以丢弃为主，利用率极低，且易造成对环境的污染。在 能源消耗方面来讲，油茶柏中某些含有的物质直接废弃是相当的一笔损耗，油茶柏中含有 大量的木质纤维素物质没有能得到实际的应用。
[0003] 如何将油茶柏中的木质纤维素转化为还原糖，进而进一步制备生物液体燃料?其 中，木质纤维素水解转化为还原糖的工艺亦是纤维素乙醇转化过程中至关重要的环节。木 质素的完全降解是真菌、细菌、放线菌及相应微生物群落共同作用的结果，其中真菌起着主 要作用，白腐真菌是一类丝状真菌，可分泌多种胞外酶，是目前已知的唯一可在纯培养过程 中将木质素降解为CO 2:和H2O的微生物。结合高效且专一的酶，降解廉价且量多的油茶柏，转 化为大量的还原糖，从而解决生物乙醇的原材料短缺的问题。
[0004] 如何来利用以油茶柏为原料，接种白腐真菌中的糙皮侧耳菌种，从而对油茶柏中 木质纤维素进行降解，测定降解木质纤维素的酶的活性，同时寻找糙皮侧耳菌种降解油茶 柏为还原糖的最佳工艺路线，为油茶柏中的植物纤维转化为生物燃料提供更多的还原糖的 工业化生产方法。
[0005]
【发明内容】
： 本发明是提供一种利用油茶柏降解制还原糖的方法，其克服了现有技术缺陷，以油茶 柏为原料，接种白腐真菌中的糙皮侧耳菌种，从而为将油茶柏中的木质纤维素降解转化为 还原糖，进而为后续生产生物液体燃料提供了方法，也进一步的拓展了油茶柏的新用途。
[0006] 为了实现本发明目的，一种利用油茶柏降解制还原糖的方法，以油茶柏为原料，其 是将油茶柏粉碎，然后将糙皮侧耳活化菌种的液体培养接种于粉碎的油茶柏中，控制糙皮 侧耳活化菌种接种于油茶柏的降解反应温度为30-70°C，pH值为3.0-7.0，糙皮侧耳活化菌 种的接种量为〇 · 5-4· 5mL/g，CuSO4添加浓度为I X 10-5_1 X 10-bol/L,MnSO4添加浓度为I X 10-5-lX10-W/Lo
[0007] 本发明所述利用油茶柏降解制还原糖的方法，优选控制所述糙皮侧耳活化菌种的 酶活力为28-35U/mL。
[0008] 本发明所述利用油茶柏降解制还原糖的方法，其优选是控制糙皮侧耳活化菌种的 液体培养接种于油茶柏的降解反应温度为50°C，糙皮侧耳活化菌种酶活力为33U/mL，接种 量为3.5mL/g，控制pH=4,控制CuS〇4添加浓度为I X l(T4mol/L，MnS〇4添加浓度为I X ΙΟΛιοΙ/ L0
[0009] 本发明进一步的优选是将糙皮侧耳菌种接种到HM固体培养基，放置25-28 °C恒温 培养箱中培养5-10天，直至培养皿表面长满白色菌丝;然后再将白色菌丝转接至PDA液体培 养基，搅拌均匀，分装于锥形瓶中，在转速为130-180r/min、培养温度为26-30°C的转速摇 床培养5-10天为糙皮侧耳活化菌种。
[0010] 本发明所述将糙皮侧耳活化菌种的液体培养接种于粉碎的油茶柏中包括对油茶 柏的预处理，是向IOg的油茶柏中加入体积为50-130mL，浓度为1.5-2.5 Wt%的ffiSOi溶液， 在温度为80-120°C的水浴锅中煮沸2h，冷却至常温，调节pH为中性，抽滤弃滤液得滤渣，再 加入50-130mL的PDA液体培养基，为预处理油茶柏。
[0011] 本发明是以油茶柏为原料，接种白腐真菌中的糙皮侧耳菌种，利用该真菌对油茶 柏木质纤维素的降解，对油茶柏中的纤维素进行降解制还原糖，本发明的方法公开了经测 定降解木质纤维素的酶的活性及还原糖含量的动态变化。将活化的糙皮侧耳菌种接种在土 豆培养基中培养15-20天，固体和液体培养基均培养7-10天，测定其酶活力；并将油茶柏粉 碎之后接种糙皮侧耳分别以温度、接种量、pH、Cu 2+(CuS〇4)浓度、Mn2+(MnSO4)浓度作为变量， 用DNS显色法测定生成的所还原糖含量，为植物纤维转化为生物燃料提供更多的还原糖，实 现了以糙皮侧耳菌种作为纤维素酶的来源将油茶柏降解为还原糖产品的新方法，并结合高 效且专一的酶，降解廉价且量多的油茶柏为大量的还原糖，从而解决生物乙醇的原材料短 缺的问题。为油茶柏的应用提供了广泛的空间，实现了对油茶柏的变废为宝。
[0012] 本发明技术方案中的各技术术语说明： 培养基是目前本行业内组织培养领域普遍使用的基本培养基，在组织培养方面的教科 书和实验指导手册中均可获得其配方。如所述HM培养基是指马玲薯、葡萄糖、琼脂培养基 简称。
【具体实施方式】 [0013] ：下面结合实施例对本发明方法作进一步的详细说明，下述实施方 案中使用质量份或质量百分比。本实施方式中的各原料均可通过市售获得。
[0014] 本发明一种利用油茶柏降解制还原糖的方法，以油茶柏为原料，并将油茶柏粉碎， 接着对粉碎后的油茶柏进行稀酸预处理，调节PH为中性取滤渣，然后将活化后的糙皮侧耳 菌种液体培养接种于稀酸预处理之后的滤渣油茶柏中，利用单因素试验法和正交试验法， 探讨温度、接种量、PH、Cu 2+浓度、Mn2+浓度五种因素在糙皮侧耳降解油茶柏为还原糖的过程 中的影响，筛选出最佳的因素组合，从而为植物纤维转化为生物燃料提供更多的还原糖。
[0015] 本发明中糙皮侧耳菌种的扩大培养即是糙皮侧耳菌种的活化处理，制糙皮侧耳活 化菌种:先将糙皮侧耳菌种接种到HM固体培养基，放置25-28 °C恒温培养箱中培养5-10天， 直至培养皿表面长满白色菌丝;然后再将白色菌丝转接至PDA液体培养基，搅拌均匀，分装 于锥形瓶中，在转速为130-180r/min、培养温度为26-30°C的转速摇床培养5-10天，备用。 [0016]本发明中活化后糙皮侧耳菌种即糙皮侧耳活化菌种的酶活力为28-35U/mL。
[0017]本发明中糙皮侧耳菌种的处理对象是经过了稀酸预处理的油茶柏滤渣:将IOg油 茶柏放置于于250mL的锤形瓶，加入50-130mL浓度为1.5-2.5 %的ft SQ?溶液，在温度为80-120 °C的水浴锅中煮沸2h，冷却至常温，调节pH为中性，抽滤弃滤液得滤渣，加入50-130mL的 PDA液体培养基，即为预处理油茶柏，备用。
[0018] 本发明控制糙皮侧耳活化菌种接种于油茶柏的降解反应温度为30-70°C，pH值为 3.0-7.0，糙皮侧耳活化菌种的接种量为0.5-4.5mL/g，在对油茶柏的降解反应过程中添加 CuS〇4和MnS〇4的溶液，控制CuS〇4添加浓度为I X 10-5_1 X 10-Vol/L，MnS〇4添加浓度为I X 10-5-lX10-W/L〇
[0019] 本发明进一步的优选是控制降解反应温度为50°C，糙皮侧耳活化菌种接种于油茶 柏中的接种量为3.5mL/g，pH为4.0，CuS〇4添加浓度为I X 10-4mol/L，MnS〇4添加浓度为I X 10 -3mol/L〇
[0020] 实施例1 本发明一种利用油茶柏降解制还原糖的方法，以油茶柏为原料，将油茶柏粉碎，油茶柏 粉碎后的大小按现有技术的用于接种菌种时所需要的目数大小，一般为200目左右，然后将 活化的糙皮侧耳菌种的液体培养接种于粉碎后的油茶柏中，所述的油茶柏为预处理油茶 柏，控制糙皮侧耳活化菌种的液体培养接种于油茶柏的降解反应温度为35-55°C，pH为4.0， 本实施例控制其降解反应温度为50°C，控制反应时的糙皮侧耳活化菌种酶活力为28-35U/ mL〇
[0021 ] 1、本发明制备方法过程中涉及的仪器，试剂等如下： 生化培养箱，SPX-250BS-Π ，上海某医疗器械制造有限公司，超净工作台，SW-CJ-2D，苏 州某净化设备有限公司，高压蒸汽灭菌锅，YX280B，上海某医疗器材有限公司，电子天平， JY1002，上海某科学有限公司，紫外可见分光光度计，T22100，上海某分析仪器有限公司，恒 温水浴锅，电磁炉，深圳某科技有限公司，摇床，上海某超声仪器有限公司 容声电冰箱，真空抽滤机，酶标仪，接种针，锥形瓶，培养皿，比色皿，移液枪，移液管，精 密pH试纸。
[0022]试剂：油茶柏，宜春某高科公司，糙皮侧耳菌种，广东省微生物菌种保藏中心，土 豆，葡萄糖，琼脂，KH2PO4，VB2，CMC-Na(羧甲基纤维素钠），葡萄糖标准液，2 %H2S〇4溶液， NaOH，CuS〇4.5H20，MnS〇4 · H2O，DNS试剂，二硝基水杨酸，酒石酸钾钠，重苯酚，亚硫酸钠；试 剂配制：？04固体培养基，马铃薯培养基，20%马铃薯汁：11^葡萄糖：2(^1(!1 2?〇4:38 MgS04*7H20 :1.5g硫胺素:8mg琼脂：20g pH自然;20%马铃薯汁取去皮马铃薯200g，切 成小块，加水1000 mL煮沸20min，四层纱布滤去马铃薯块，将滤液补足1000 mL。
[0023] PDA液体培养基：除不加琼脂外，其他同PDA固体培养基，另外再加2g油茶柏驯化 菌种。
[0024] DNS显色剂：将6.3g二硝基水杨酸(DNS)和262ml 2mol/L氢氧化钠，加到500ml含有 182g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加上5g重苯酸和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加水定容 到1000 ml，即制成3，5-二硝基水杨酸试剂，贮于棕色瓶中一周后备用。
[0025]糙皮侧耳菌种扩培：PDA固体培养基培养，按培养基配方配置250mL营养液，加热 溶解琼脂后与空培养皿等放置高压蒸汽灭菌锅中灭菌20min，营养液稍稍冷却后，在超净工 作台中以无菌操作倒15_20mL于每个培养皿中，凝固后用接种针接种购买的糙皮侧耳菌种， 最后放置25-28 °C丨旦温培养箱中培养7天，直至培养皿表面长满白色菌丝。
[0026] PDA液态培养基培养:PDA固体培养基培养七天后，转接至液体培养基;将蒸馏水、 锥形瓶、移液管、七个250mL锥形瓶于高压蒸汽灭菌锅中灭菌20min，将HM培养基上的所有 菌种用接种针转接至装有灭菌水的锥形瓶中，搅拌均匀，分装于锥形瓶中；150r/min 28°C 转速摇床培养7天备用。
[0027] 酶活力的测定:分别称取0.5，1.0，1.5,2.0,2.5,3.0,3.5,4.0mg的葡萄糖于8支比 色管中，加3.5-二硝基水杨酸显色剂(DNS试剂)2ml，在沸水浴中煮沸显色10分钟，冷却，加 蒸馏水定容至25mL，震荡摇匀；以ImL蒸馏水代替糖作空白管，用酶标仪在550nm测定其吸光 度。空白管的测定，取ImL酶液，沸水浴5分钟，冷却加3ml0.5%CMC，与样品管同时放入50 °C水 浴30分钟。其它操作同样品管；样品的测定，取0.5%羧甲基纤维素钠溶液3ml，酶液lml，于 50°C水浴中糖化30分钟，取出，立即于沸水浴中煮沸10分钟使酶失活，得糖化液，冷却加入 2ml显色液，再沸水浴10分钟，冷却后加水定容至25ml，混勾，550nm测OD值。在上述条件下， ImL酶每分钟催化纤维素水解生成葡萄糖微克数定为一个活力单位。
[0028] 预处理油茶柏，即为油茶柏的预处理，是采用稀酸处理法：分别称取34组IOg油茶 柏，于34组250mL的锤形瓶，加入100mL2 Wt%SOr，100°C水浴锅中煮沸2h，冷却至常温调节 PH为中性，抽滤弃滤液得滤渣，分别加入IOOmLPDA培养基，即得预处理油茶柏，备用。
[0029]单因素实验： pH变量:取五瓶预处理过的锥形瓶，分别加 IOmLl X 10_4mol/LCuS〇4溶液、IOmLl X 10一 3mol/LMnS〇4溶液，分别调节PH为3、4、5、6、7,高压蒸汽锅灭菌20min，冷却分别在超净工作台 以无菌操作接种25mL糙皮侧耳液体培养基，于50°C恒温水浴锅中培养7天。
[0030] 温度变量:取五瓶预处理过的锥形瓶，分别加 IOmLl X 10_4mol/LCuS〇4溶液、IOmLl 乂1(^3111〇1/111115〇4溶液，分别调节?11为5，高压蒸汽锅灭菌2〇1^11，冷却分别在超净工作台以 无菌操作接种25mL糙皮侧耳液体培养基，分别于30°C、40°C、50°C、60°C、70°C恒温水浴锅中 培养7天。
[0031] 接种量变量：取五瓶预处理过的锥形瓶，分别加 IOmLl X l(T4m〇l/LCuS〇4溶液、 IOmLl X 10-3mol/LMnS〇4溶液，分别调节PH为5,高压蒸汽锅灭菌20min，冷却分别在超净工作 台以无菌操作接种51^、151^、251^、351^、4511^糙皮侧耳液体培养基，于50°(：恒温水浴锅中 培养7天。
[0032] 2+(CuS〇4)浓度变量：取五瓶预处理过的锥形瓶，分别加入IOmL的浓度为1X10- 5mol/L、I X 10-4mol/L、I X 10-3mol/L、I X 10-2mol/L、I X 10-Vol/LCuS〇4溶液，分别调节PH为 5,高压蒸汽锅灭菌20min，冷却分别在超净工作台以无菌操作接种25mL糙皮侧耳液体培养 基，于50°C恒温水浴锅中培养7天。
[0033] 2+(MnS〇4)浓度变量：取五瓶预处理过的锥形瓶，分别加入IOmL的浓度为IX 10- 5mol/L、I X 10-4mol/L、I X 10-3mol/L、I X 10-2mol/L、I X 10-Vol/LMnS〇4溶液，分别调节PH为 5,高压蒸汽锅灭菌20min，冷却分别在超净工作台以无菌操作接种25mL糙皮侧耳液体培养 基，于50°C恒温水浴锅中培养7天。
[0034]酶标仪测定还原糖量:分别用移液枪在上述25组锥形瓶中吸取ImL样液于比色皿 中，再分别移取2mLDNS试剂，沸水浴加热显色lOmin，流水冷却，用蒸馏水补足到25ml刻度， 摇匀用移液枪吸取200uL样品于酶标仪微孔板中，25组分别加完之后，将酶标仪预热20min， 在540nm波长下测定其吸光度，记录数据，根据葡萄糖标准曲线得生成还原糖量。
[0035] 正交实验： 利用现有的正交实验，根据单因素的实验结果，选择接种量、pH、Cu2+浓度和Mn2+浓度 四个因素，做四因素三水平的正交实验，同单因素一样，将预处理过的油茶柏按正交实验设 计添加试剂及调pH，接种完后均放于50°C恒温水浴锅中培养7天。将以上九组培养按单因素 测还原糖方法测定还原糖量，记录数据，根据现有技术方案确定生成还原糖量。
[0036]结果分析： 酶活力的测定： 具有还原性末端的寡糖和有还原基团的单糖在沸水浴条件下可以与DNS试剂发生显色 反应，反应颜色的强度(分光度OD值）与产生的还原糖量成正比，而此处还原糖的生成量即 为葡萄糖量。依据葡萄糖量分光度值对应的数据，按现有技术进行测定， 经检测确定糙皮侧耳菌种纤维素酶的活力单位即为33U/mL。
[0037]单因素实验： pH变量： 还原糖产率随着PH值上升而增加，当pH为5时还原糖的产率最高，随着PH值继续上升， 糙皮侧耳菌种的生长受到抑制，降解能力也相应受到影响;而且粗酶液本身呈酸性，还原糖 产率出现下降趋势，故，还原糖产率最佳PH值为5。
[0038] 温度变量： 控制PH、接种量、Cu2+浓度、Mn2+浓度四个变量值不变，调节温度变化，依次记录其所对 应的分光度值，计算得出还原糖量产率，还原糖产率随着温度值上升而稍有所增加，当温度 达到50°C时还原糖的产率最高，温度过低，不利于菌体生长，发酵周期延长;发酵温度偏高， 不利于菌体纤维素酶的代谢积累和酶活稳定性。随着温度值继续上升，糙皮侧耳菌种的生 长受到抑制，酶解能力也相应受到影响，从而还原糖产率出现下降趋势，故，还原糖产率最 佳温度值为50°C。
[0039] 接种量变量： 控制温度、PH、Cu2+浓度、Mn2+浓度四个变量值不变，调节接种量变化，计算得出还原糖 量产率，还原糖产率随着接种量的上升而上升，当接种量达到35mL时还原糖的产率达到最 高，随着接种量继续上升，糙皮侧耳菌种的生长受到抑制，酶解能力也相应受到影响，从而 还原糖产率出现下降趋势，故，接种量并不是越高越好，故还原糖产率最佳接种量为35mL。
[0040] 2+浓度变量： 控制温度、pH、接种量、Mn2+浓度四个变量值不变，调节Cu2+浓度变化，计算得出还原糖 量产率，还原糖产率随着Cu2+浓度的上升而大致下降，当Cu2+浓度达到I X l(T4m〇l/L时还原 糖的产率达到最高，随着Cu2+浓度继续上升，糙皮侧耳菌种的生长受到抑制，酶解能力也相 应受到影响，从而还原糖产率一直出现下降趋势，故还原糖产率最佳Cu 2+浓度为IX 10-4mol/L〇
[0041 ] 2+浓度变量： 控制温度、PH、接种量、Cu2+浓度四个变量值不变，调节Mn2+浓度变化，计算得出还原糖 量产率，还原糖产率随着Mn2+浓度的上升而上升，当Mn2+浓度达到I X ΙθΛιοΙ/L时还原糖的 产率达到最高，随着Mn2+浓度继续上升，糙皮侧耳菌种的生长受到抑制，酶解能力也相应受 到影响，从而还原糖产率一直出现下降趋势，故还原糖产率最佳Mn 2+浓度为I X l(T3m〇l/L。
[0042]根据单因素结果分析，糙皮侧耳的最佳温度为50°C，本发明通过正交实验，将预处 理的样品按照四因素三水平表1同时进行实验。 表1糙皮侧耳降解油茶柏因素水平表1，
说明：结果分析，由以上表得知，对于还原糖产率影响程度大小排序为Cu2+浓度〉ΡΗΜ? 种量〉Mn2+浓度；即糙皮侧耳降解油茶柏为还原糖的最佳的降解工艺条件为:温度=50°C，接 种量=35mL，pH=4，Cu 2+=l X 10-4mol/L，Mn2+=l X 10-3mol/L。
[0043]本发明通过单因素实验确定温度、接种量、pH、Cu2+浓度、Mn2+浓度五种因素在糙皮 侧耳降解油茶柏为还原糖的过程中，以还原糖产率为指标，五种因素中，当其他因素不变， pH为5时，还原糖的产率是最佳的；当其他因素不变，温度为50°C时，还原糖的产率是最佳 的；当其他因素不变，接种量为35mL时，还原糖的产率是最佳的；当其他因素不变，Cu 2+浓度 为I X l(T4mol/L时，还原糖的产率是最佳的；当其他因素不变，Mn2+浓度为I X l(T3mol/L时， 还原糖的产率是最佳的，Cu2+浓度和Mn2+浓度是以CuSO 4溶液和MnSO4溶液体现。通过上述的 优化实验，得出本发明糙皮侧耳降解油茶柏为还原糖的工艺参数为，温度为50°C，接种量为 35mL，pH =4，Cu2+=l X 10-4mol/L，Mn2+=l X 10-3mol/L。
【主权项】
1. 一种利用油茶巧降解制还原糖的方法，W油茶巧为原料，其特征是将油茶巧粉碎，然 后将糖皮侧耳活化菌种的液体培养接种于粉碎的油茶巧中，控制糖皮侧耳活化菌种接种于 油茶巧的降解反应溫度为30-70°C，pH值为3.0-7.0，糖皮侧耳活化菌种的接种量为0.5- 4.5mL/g，CuS〇4添加浓度为 1 X 1〇-5-1 X l〇-Vol/L，MnS〇4添加浓度为 1 X 1〇-5-1 X lO-Vol/ L。2. 根据权利要求1所述利用油茶巧降解制还原糖的方法，其特征是控制所述糖皮侧耳 活化菌种的酶活力为28-3抓/mL。3. 根据权利要求1或2所述利用油茶巧降解制还原糖的方法，其特征是控制糖皮侧耳活 化菌种的液体培养接种于油茶巧的降解反应溫度为50°C，糖皮侧耳活化菌种酶活力为33U/ mL，接种量为3.5mL/g，控制抑=4，控制CuS〇4添加浓度为1 X ΙοΛιο 1/L，MnS〇4添加浓度为1 X ΙΟΛιοΙ/L。4. 根据权利要求1所述利用油茶巧降解制还原糖的方法，其特征是将糖皮侧耳菌种接 种到PDA固体培养基，放置25-28Γ恒溫培养箱中培养5-10天，直至培养皿表面长满白色菌 丝;然后再将白色菌丝转接至PDA液体培养基，揽拌均匀，分装于锥形瓶中，在转速为130- 18化/min、培养溫度为26-30 °C的转速摇床培养5-10天为糖皮侧耳活化菌种。5. 根据权利要求1所述利用油茶巧降解制还原糖的方法，其特征是所述将糖皮侧耳活 化菌种的液体培养接种于粉碎的油茶巧中包括对油茶巧的预处理，是向lOg的油茶巧中加 入体积为50-130血，浓度为1.5-2.5 Wt%的化S化溶液，在溫度为80-120°C的水浴锅中煮沸 2h，冷却至常溫，调节抑为中性，抽滤弃滤液得滤渣，再加入50-130mL的PDA液体培养基，为 预处理油茶巧。
【文档编号】C12P19/00GK106086105SQ201610724916
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年8月26日
【发明人】彭玲, 赵云, 郭孟萍, 叶文峰, 姜琼
【申请人】宜春学院