一种微波辅助与膜过滤制备淡水鱼血肽的方法
【专利摘要】本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种微波辅助与膜过滤制备淡水鱼血肽的方法。一种微波辅助与膜过滤制备淡水鱼血肽的方法，包括以下步骤：抗凝处理、沉淀、酶解、破壁、微波辅助分段酶解、酶解1、酶解2、灭酶活、过滤和喷雾干燥。本发明的微波辅助与膜过滤制备淡水鱼血肽的方法具有收率高、纯度高、溶剂消耗少、成本低和易于工业化生产的优点。本发明整个工艺流程短、时间短，能耗低、污染少、不使用有毒试剂、无污染物排放，达到清洁生产目标。
【专利说明】
一种微波辅助与膜过滤制备淡水鱼血肽的方法
技术领域
[0001] 本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种微波辅助与膜过滤制备淡水鱼血肽 的方法。
【背景技术】
[0002] 淡水鱼血中红细胞的蛋白含量高达38 %，占全血蛋白总量的75 %以上，其中92 % 以上是血红蛋白，因此淡水鱼血球是一种优良的动物蛋白源。但由于血球粉中含有血红素， 使得血球粉为黑红色，并且带有很重的血腥味，感官不好难以接受，其经济附加值不高
[0003] 血红素是以卟啉铁的形式与四个珠蛋白结合形成血红蛋白，存在于红细胞中。在 食品工业中，血红素可替代肉制品中的发色剂硝酸盐及人工合成色素，使用血红素可减少 亚硝酸盐的致癌作用。在制药工业中，血红素可作为半合成胆红素原料，而且是抗癌的特效 药。血红素在临床上作为补铁剂，可治疗由缺铁引起的贫血症，这种血红素补铁剂可以直接 被人体吸收，吸收率高达10~20%，具有无体内铁蓄积中毒及胃肠刺激等不良反应等优点。
[0004] 由蛋白质酶解获得的活性肽，是目前功能性动物营养研究最活跃的领域之一。充 分利用淡水鱼血中的丰富蛋白质资源，利用现代生物酶解技术可以将淡水鱼血中的珠蛋白 转化为小分子的蛋白质片段和具有生物活性的小肽。小分子血红蛋白肽不仅有很好的溶解 性、低粘度、抗凝胶形成性，而且在体内消化吸收快，蛋白质利用率高，具有低抗原性，不会 产生过敏反应。生物酶解技术反应条件温和、易操作、能耗低，可避免因剧烈操作所造成营 养成分的损失，并且提高了必需氨基酸及呈味氨基酸的含量，改善了蛋白质的适口性，提高 了消化率。
[0005] 因此，将鱼血细胞中的血红蛋白酶解成具有生物活性的肽类物质，将极大满足人 对功能性提高蛋白质资源的利用率。
[0006] 公开于该【背景技术】部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应 当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
【发明内容】
[0007] 为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种微波辅助与膜过滤制备淡水鱼血肽 的方法。
[0008] 为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
[0009] -种微波辅助与膜过滤制备淡水鱼血肽的方法，包括如下步骤：
[0010] (1)抗凝淡水鱼血的制备:先将抗凝剂溶液放入容器1中，然后取新鲜淡水鱼血放 入该容器中，搅拌均匀，低温静置，得到抗凝淡水鱼血；
[0011] (2)血浆、血球分离:抗凝淡水鱼血上层为血浆，下层为血球，用虹吸法将血浆吸到 容器2中；余下的血球经离心后，将上层血浆合并到容器2中低温冷冻备用，血球则冷冻贮藏 至容器3中过夜待用；
[0012] (3)血浆沉淀收集凝血酶原：容器2中的血浆解冻后，滤除上层漂浮的白色絮状物 后，用2-8倍生理盐水稀释后再用2mol/L醋酸调pH至5.1-5.2，低温静置过夜，收集沉淀，即 得凝血酶原；
[0013] (4)凝血粗酶液制备:将收集的凝血酶原沉淀溶解于生理盐水中，启动微波装置加 热保温至37°C，用1.0%CaCl 2溶液，搅拌20-30min，激活凝血酶原，过滤收集滤液，即得凝血 酶粗酶液；
[0014] (5)凝血酶的制备：向凝血酶粗酶液中加入冷生理盐水，用超滤膜处理，浓缩至原 体积的1/20-1/25后，收集截留液，该截留液即为精制凝血酶液，将截留液冷冻干燥，即得粉 状凝血酶；
[0015] (6)血球破壁、溶血：向容器3中加入生理盐水，得到血球溶液，升温至10-15°C，搅 拌20-30min;
[0016] (7)血球蛋白分段酶解：用4.0m〇L/L NaOH调节pH至7.5,启动微波装置，将温度升 至37-40 °C，按底物质量2-2.5 %加入复合蛋白酶I，保温2h后，再升温至55-60°C，保温1.5-2h;调节pH至9.0，按底物质量3-4.5%加入复合蛋白酶II，再启动微波提取装置，保温2h，使 血球蛋白充分水解；
[0017] (8)淡水鱼血肽制备:酶解结束后，冷却至常温，用0.22um的滤膜过滤除菌，喷雾干 燥，即得到淡水鱼血肽粉末。
[0018] 作为优选，步骤（1)中所述的抗凝剂溶液是将抗凝剂柠檬酸三钠溶解至去离子水 得到的，所述是抗凝剂溶液的质量百分比为〇. 5-5%。
[0019] 作为优选，步骤(2)中离心的转速为3000-3500r/min。
[0020] 作为优选，步骤(4)中搅拌的转速为500-800r/min。
[0021] 作为优选，步骤(5)中冷生理盐水的加入量为凝血酶粗酶液体积的8-10倍。
[0022]作为优选，步骤(5)中超滤膜为截留相对分子量为6000的超滤膜。
[0023]作为优选，步骤(6)中生理盐水的加入量为使血球溶液中蛋白质含量为8-10%。 [0024] 作为优选，步骤(6)中搅拌的转速为1000-5000r/min。
[0025]作为优选，步骤(7)中复合蛋白酶I为碱性酶;复合蛋白酶II为中性酶。
[0026]作为优选，步骤(4)和(7)中所述的微波装置的频率为2450mHZ，功率为20KW。
[0027] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0028] 1.本发明的方法改进淡水鱼血蛋白的酶解工艺与技术，通过釆用微波辅助酶解技 术制备具有生物活性的寡肽，扩大淡水鱼鳍蛋白应用领域，变废为宝，使从单纯养鱼拓展 到畜禽饲料、饲料添加剂到人类食品、医药、保健品等多种行业和领域，无疑对延长养鱼产 业链，全面提高养鱼产业综合效益，实现农业增效农民增收农村繁荣，对推动一带一路建设 有重大意义。
[0029] 2.本发明微波辅助与膜过滤制备淡水鱼血肽的方法具有收率高、纯度高、溶剂消 耗少、成本低和易于工业化生产的优点。
[0030] 3.本发明整个工艺流程短、时间短，能耗低、污染少、不使用有毒试剂、无污染物排 放，达到清洁生产目标。
【附图说明】
[0031] 图1为本发明微波辅助与膜过滤制备淡水鱼血肽的工艺流程图。
【具体实施方式】
[0032] 下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，但本发明的实施方式并不 局限于实施例表示的范围。这些实施例仅用于说明本发明，而非用于限制本发明的范围。此 外，在阅读本发明的内容后，本领域的技术人员可以对本发明作各种修改，这些等价变化同 样落于本发明所附权利要求书所限定的范围。
[0033] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所 使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0034] 实施例1:
[0035] -种微波辅助与膜过滤制备淡水鱼血肽的方法，包括如下步骤：
[0036] (1)抗凝淡水鱼血的制备:先将抗凝剂溶液放入容器1中，然后取新鲜淡水鱼血放 入该容器中，搅拌均匀，低温静置，得到抗凝淡水鱼血;所述的抗凝剂溶液是将抗凝剂柠檬 酸三钠溶解至去离子水得到的，所述是抗凝剂溶液的质量百分比为0.5%;
[0037] (2)血浆、血球分离:抗凝淡水鱼血上层为血浆，下层为血球，用虹吸法将血浆吸到 容器2中；余下的血球经离心后，将上层血浆合并到容器2中低温冷冻备用，血球则冷冻贮藏 至容器3中过夜待用;离心的转速为3000r/min;
[0038] (3)血浆沉淀收集凝血酶原：容器2中的血浆解冻后，滤除上层漂浮的白色絮状物 后，用2倍生理盐水稀释后再用2mol/L醋酸调pH至5.1，低温静置过夜，收集沉淀，即得凝血 酶原；
[0039] (4)凝血粗酶液制备:将收集的凝血酶原沉淀溶解于生理盐水中，启动微波装置加 热保温至37°C，用I.O^CaCl2溶液，搅拌20min，激活凝血酶原，过滤收集滤液，即得凝血酶 粗酶液;搅拌的转速为500r/min;所述的微波装置的频率为2450mHZ，功率为20KW;
[0040] (5)凝血酶的制备：向凝血酶粗酶液中加入冷生理盐水，用超滤膜处理，浓缩至原 体积的1/20后，收集截留液，该截留液即为精制凝血酶液，将截留液冷冻干燥，即得粉状凝 血酶;冷生理盐水的加入量为凝血酶粗酶液体积的8倍;超滤膜为截留相对分子量为6000的 超滤月吴；
[0041 ] (6)血球破壁、溶血：向容器3中加入生理盐水，得到血球溶液，升温至10 °C，搅拌 2〇11^11;搅拌的转速为100(^/1^11;生理盐水的加入量为使血球溶液中蛋白质含量为8%; [0042] (7)血球蛋白分段酶解：用4.0m〇L/L NaOH调节pH至7.5,启动微波装置，将温度升 至37 °C，按底物质量2 %加入复合蛋白酶I，保温2h后，再升温至55 °C，保温1.5h;调节pH至 9.0，按底物质量3%加入复合蛋白酶II，再启动微波提取装置，保温2h，使血球蛋白充分水 解;复合蛋白酶I为碱性酶;复合蛋白酶II为中性酶;所述的微波装置的频率为2450mHZ，功 率为20KW;
[0043] (8)淡水鱼血肽制备:酶解结束后，冷却至常温，用0.22um的滤膜过滤除菌，喷雾干 燥，即得到淡水鱼血肽粉末。
[0044] 实施例2:
[0045] -种微波辅助与膜过滤制备淡水鱼血肽的方法，包括如下步骤：
[0046] (1)抗凝淡水鱼血的制备:先将抗凝剂溶液放入容器1中，然后取新鲜淡水鱼血放 入该容器中，搅拌均匀，低温静置，得到抗凝淡水鱼血;所述的抗凝剂溶液是将抗凝剂柠檬 酸三钠溶解至去离子水得到的，所述是抗凝剂溶液的质量百分比为5% ;
[0047] (2)血浆、血球分离:抗凝淡水鱼血上层为血浆，下层为血球，用虹吸法将血浆吸到 容器2中；余下的血球经离心后，将上层血浆合并到容器2中低温冷冻备用，血球则冷冻贮藏 至容器3中过夜待用;离心的转速为3500r/min;
[0048] (3)血浆沉淀收集凝血酶原：容器2中的血浆解冻后，滤除上层漂浮的白色絮状物 后，用8倍生理盐水稀释后再用2mol/L醋酸调pH至5.2，低温静置过夜，收集沉淀，即得凝血 酶原；
[0049] (4)凝血粗酶液制备:将收集的凝血酶原沉淀溶解于生理盐水中，启动微波装置加 热保温至37°C，用I.O^CaCl2溶液，搅拌30min，激活凝血酶原，过滤收集滤液，即得凝血酶 粗酶液;搅拌的转速为800r/min;所述的微波装置的频率为2450mHZ，功率为20KW;
[0050] (5)凝血酶的制备：向凝血酶粗酶液中加入冷生理盐水，用超滤膜处理，浓缩至原 体积的1/25后，收集截留液，该截留液即为精制凝血酶液，将截留液冷冻干燥，即得粉状凝 血酶;冷生理盐水的加入量为凝血酶粗酶液体积的8-10倍;超滤膜为截留相对分子量为 6000的超滤膜；
[00511 (6)血球破壁、溶血：向容器3中加入生理盐水，得到血球溶液，升温至15 °C，搅拌 3011^11;搅拌的转速为500(^/1^11;生理盐水的加入量为使血球溶液中蛋白质含量为10%; [0052] (7)血球蛋白分段酶解:用4.0m〇L/L NaOH调节pH至7.5,启动微波装置，将温度升 至40 °C，按底物质量2.5 %加入复合蛋白酶I，保温2h后，再升温至60°C，保温2h;调节pH至 9.0，按底物质量4.5%加入复合蛋白酶II，再启动微波提取装置，保温2h，使血球蛋白充分 水解;复合蛋白酶I为碱性酶;复合蛋白酶Π 为中性酶;所述的微波装置的频率为2450mHZ， 功率为20KW;
[0053] (8)淡水鱼血肽制备:酶解结束后，冷却至常温，用0.22um的滤膜过滤除菌，喷雾干 燥，即得到淡水鱼血肽粉末。
[0054] 实施例3:
[0055] -种微波辅助与膜过滤制备淡水鱼血肽的方法，包括如下步骤：
[0056] (1)抗凝淡水鱼血的制备:先将抗凝剂溶液放入容器1中，然后取新鲜淡水鱼血放 入该容器中，搅拌均匀，低温静置，得到抗凝淡水鱼血;所述的抗凝剂溶液是将抗凝剂柠檬 酸三钠溶解至去离子水得到的，所述是抗凝剂溶液的质量百分比为3.0%;
[0057] (2)血浆、血球分离:抗凝淡水鱼血上层为血浆，下层为血球，用虹吸法将血浆吸到 容器2中；余下的血球经离心后，将上层血浆合并到容器2中低温冷冻备用，血球则冷冻贮藏 至容器3中过夜待用;离心的转速为3200r/min;
[0058] (3)血浆沉淀收集凝血酶原：容器2中的血浆解冻后，滤除上层漂浮的白色絮状物 后，用5倍生理盐水稀释后再用2mol/L醋酸调pH至5.1，低温静置过夜，收集沉淀，即得凝血 酶原；
[0059] (4)凝血粗酶液制备:将收集的凝血酶原沉淀溶解于生理盐水中，启动微波装置加 热保温至37°C，用I.O^CaCl2溶液，搅拌25min，激活凝血酶原，过滤收集滤液，即得凝血酶 粗酶液;搅拌的转速为700r/min;所述的微波装置的频率为2450mHZ，功率为20KW;
[0060] (5)凝血酶的制备：向凝血酶粗酶液中加入冷生理盐水，用超滤膜处理，浓缩至原 体积的1/22后，收集截留液，该截留液即为精制凝血酶液，将截留液冷冻干燥，即得粉状凝 血酶;冷生理盐水的加入量为凝血酶粗酶液体积的9倍;超滤膜为截留相对分子量为6000的 超滤月吴；
[0061 ] (6)血球破壁、溶血：向容器3中加入生理盐水，得到血球溶液，升温至12 °C，搅拌 2511^11;搅拌的转速为300(^/1^11;生理盐水的加入量为使血球溶液中蛋白质含量为9%; [0062] (7)血球蛋白分段酶解：用4.0m〇L/L NaOH调节pH至7.5,启动微波装置，将温度升 至38°C，按底物质量2.2 %加入复合蛋白酶I，保温2h后，再升温至58°C，保温1.8h;调节pH至 9.0，按底物质量4.0%加入复合蛋白酶II，再启动微波提取装置，保温2h，使血球蛋白充分 水解;复合蛋白酶I为碱性酶;复合蛋白酶Π 为中性酶;所述的微波装置的频率为2450mHZ， 功率为20KW;
[0063] (8)淡水鱼血肽制备:酶解结束后，冷却至常温，用0.22um的滤膜过滤除菌，喷雾干 燥，即得到淡水鱼血肽粉末。
[0064] MM:参照申请号为201510162420 · 4专利中的方法。
[0065] -种錤鳅鱼角料胶原蛋白的提取方法，其特征在于，提取步骤如下：
[0066] a、錤鳅鱼中鱼皮、鱼骨及鱼鳍为原料，将原料采用专用设备粉碎;对粉碎后的原料 兑水，使之变成浆液;b、对浆液内加入酸性物料实施酸解;兑入粉碎原料中的水与粉碎原料 的比例为3-8:1 ;c、对酸解后的浆液实施超声波处理;超声波处理的时间为2h;浸提的时间 为4h; d、浆液经过超声波处理后实施浸提;酸性物料为柠檬酸;e、过滤;过滤采用过滤器，将 浆液中的上层油脂层和沉淀物质实施过滤，形成含胶原蛋白的酸溶液;f、脱盐:是将含胶原 蛋白的酸溶液，分别通过陶瓷膜过滤器和纳滤膜脱盐;g、冷冻，冷冻温度为零下30°C;h、干 燥，干燥的温度为8-15 °C。
[0067]表1本发明提取方法的有益效果
[0069] 从表1可知，与对照方法相比，本发明釆用微波辅助与膜过滤技术，不需溶剂，酸碱 用量少，酶解时间短，转化率高，且为下一步制备多肽创造更好条件。
[0070] 前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述 并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变 和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应 用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及 各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
【主权项】
1. 一种微波辅助与膜过滤制备淡水鱼血肽的方法，其特征在于，包括如下步骤： (1) 抗凝淡水鱼血的制备：先将抗凝剂溶液放入容器1中，然后取新鲜淡水鱼血放入该 容器中，搅拌均匀，低温静置，得到抗凝淡水鱼血； (2) 血浆、血球分离:抗凝淡水鱼血上层为血浆，下层为血球，用虹吸法将血浆吸到容器 2中；余下的血球经离心后，将上层血浆合并到容器2中低温冷冻备用，血球则冷冻贮藏至容 器3中过夜待用； (3) 血浆沉淀收集凝血酶原：容器2中的血浆解冻后，滤除上层漂浮的白色絮状物后，用 2-8倍生理盐水稀释后再用2mol/L醋酸调pH至5.1-5.2，低温静置过夜，收集沉淀，即得凝血 酶原； (4) 凝血粗酶液制备:将收集的凝血酶原沉淀溶解于生理盐水中，启动微波装置加热保 温至37°C，用1.0%CaCl2溶液，搅拌20-30min，激活凝血酶原，过滤收集滤液，即得凝血酶粗 酶液； (5) 凝血酶的制备：向凝血酶粗酶液中加入冷生理盐水，用超滤膜处理，浓缩至原体积 的1/20-1/25后，收集截留液，该截留液即为精制凝血酶液，将截留液冷冻干燥，即得粉状凝 血酶； (6) 血球破壁、溶血：向容器3中加入生理盐水，得到血球溶液，升温至10-15°C，搅拌20-30min； (7) 血球蛋白分段酶解：用4.0m〇L/L NaOH调节pH至7.5，启动微波装置，将温度升至37-40°C，按底物质量2-2.5 %加入复合蛋白酶I，保温2h后，再升温至55-60°C，保温1.5-2h;调 节pH至9.0，按底物质量3-4.5%加入复合蛋白酶II，再启动微波提取装置，保温2h，使血球 蛋白充分水解； (8) 淡水鱼血肽制备:酶解结束后，冷却至常温，用0.22um的滤膜过滤除菌，喷雾干燥， 即得到淡水鱼血肽粉末。2. 根据权利要求1所述的微波辅助与膜过滤制备淡水鱼血肽的方法，其特征在于，步骤 (1) 中所述的抗凝剂溶液是将抗凝剂柠檬酸三钠溶解至去离子水得到的，所述是抗凝剂溶 液的质量百分比为0.5-5%。3. 根据权利要求1所述的微波辅助与膜过滤制备淡水鱼血肽的方法，其特征在于，步骤 (2) 中离心的转速为3000-3500r/min。4. 根据权利要求1所述的微波辅助与膜过滤制备淡水鱼血肽的方法，其特征在于，步骤 (4) 中搅拌的转速为500-800r/min。5. 根据权利要求1所述的微波辅助与膜过滤制备淡水鱼血肽的方法，其特征在于，步骤 (5) 中冷生理盐水的加入量为凝血酶粗酶液体积的8-10倍。6. 根据权利要求1所述的微波辅助与膜过滤制备淡水鱼血肽的方法，其特征在于，步骤 (5) 中超滤膜为截留相对分子量为6000的超滤膜。7. 根据权利要求1所述的微波辅助与膜过滤制备淡水鱼血肽的方法，其特征在于，步骤 (6) 中生理盐水的加入量为使血球溶液中蛋白质含量为8-10%。8. 根据权利要求1所述的微波辅助与膜过滤制备淡水鱼血肽的方法，其特征在于，步骤 (6)中搅拌的转速为1000_5000r/min。9. 根据权利要求1所述的微波辅助与膜过滤制备淡水鱼血肽的方法，其特征在于，步骤 (7)中复合蛋白酶I为碱性酶;复合蛋白酶II为中性酶。10.根据权利要求1所述的微波辅助与膜过滤制备淡水鱼血肽的方法，其特征在于，步 骤(4)和(7)中所述的微波装置的频率为2450mHZ，功率为20KW。
【文档编号】C07K1/34GK106086140SQ201610652842
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年8月10日 公开号201610652842.4, CN 106086140 A, CN 106086140A, CN 201610652842, CN-A-106086140, CN106086140 A, CN106086140A, CN201610652842, CN201610652842.4
【发明人】郭凤兰, 刘计汕, 梁尚文
【申请人】柳江县渡庄生物科技有限公司