采用碳纳米材料调控草坪堆肥基质真菌鉴定分析方法
【专利摘要】本发明公开了一种碳纳米材料调控草坪堆肥基质真菌鉴定分析方法，以生活垃圾堆肥和土壤混合物为草坪基质材料，以向其中混合四种不同碳纳米材料作为处理组，通过草坪植物培养，研究添加不同碳纳米材料一段时间后基质中可培养真菌类群的变化，并通过分子测序技术分析基质中可培养真菌的分类地位。通过将碳纳米材料添加进草坪建植体系后真菌类群的变化的认识，为碳纳米材料在垃圾堆肥草坪基质中真菌类群调控应用提供技术支撑。
【专利说明】
采用碳纳米材料调控草坪堆肥基质真菌鉴定分析方法
技术领域
[0001] 本发明属于环境保护技术领域，涉及一种采用碳纳米材料调控草坪堆肥基质真菌 鉴定分析方法。
【背景技术】
[0002] 碳纳米材料是三维结构中至少有一个小于100 nm的材料。碳纳米材料具有尺寸 小，比表面积大，表面能高，表面原子比例大的特点，在力学、光学、热学、电学等方面表现出 了优异性能。纳米颗粒存在很多微界面，各种界面反应可以通过其强化，在土壤重金属污 染以及污水净化方面发挥着显著的作用。
[0003] 碳元素在自然界含量非常高，对于有机物和生命体也非常重要。1985年，科学家发 现了由60个C原子组成的C6Q。随后碳纳米管和石墨烯等也相继被发现。2004年，Geim等人 成功制备出了单层石墨烯。之后随着石墨烯在光、电、热、磁上的特殊性质被陆续发现，有 关碳材料的研究又进入了一个全新的领域。
[0004] 随着科学技术、现代工业的快速发展以及人口的不断增加，世界上很多国家都呈 现出水体、土壤以及大气污染日益严重的趋势。报道指出，中国50%的河流以及80%以上的湖 泊已经遭受到了污染，地表水的m类水质标准中国的许多湖泊已经达不到了。全国的耕地 中有8000万hm 2以上受到了不同程度的污染，而其中最突出的问题就是有机污染物以及 重金属的污染，这一情况已经严重制约了中国可持续发展战略的实施，甚至威胁到了国人 的健康。
[0005] 传统的水体修复技术比如截污、底泥疏浚等虽然暂时能够起一些作用，但是都治 标不治本，而生物修复限制因素有很多，比如环境温度和酸碱性等，这就使得生物修复客 观上存在着很大的局限性。作为传统的污染土壤修复方法，客土法、淋滤法费时费力，并且 对于大面积的修复起不到很好的作用。与传统的环境修复方法相比较，将纳米材料用于重 金属修复，因其超强的吸附能力和超大的比表面积，不仅不存在传统方法的缺点，还表现出 极高的修复效率。另外大气污染方面形势也是十分严峻，空气中超标的S0 2、CO和NOx等时刻 威胁着我们的身体健康。纳米材料具有极佳的催化效率，甚至能够催化极不易发生的反应 为解决产生大气污染问题提供了新的方法和思路。因此，利用纳米材料解决水体和土壤以 及大气的污染问题越来越值得人们关注。而碳纳米材料的研究又是其中极有发展前景的领 域。
[0006] 近年来的研究发现碳纳米管能够有效的吸附水体中重金属离子。Li等的实验表 明碳纳米管能够吸附水体中的铅离子，并且与溶液的PH值有很大的相关性。随着溶液pH值 的增加，碳纳米管对铅离子的吸附能力也随之增大。Langmuir和Freundlich模型可以解 释这个吸附过程。随后，Li等还研究了不同氧化方式处理的碳纳米管对镉离子的吸附效果 比较，发现经过氧化处理后，碳纳米管的比表面积显著增加，表面官能团的数量也有明显增 多。具体来说，碳纳米管经KMnO 4氧化之后的吸附效果明显高于H2O2和HNO3的氧化效果。另 外，Li等人接下来又进行了碳纳米管吸附铜离子的实验、研究了不同形态的碳纳米管对铅 离子的吸附比较、碳纳米管对铅离子的吸附动力学性质以及解吸附的情况，并且讨论了碳 纳米管对铅离子、铜离子以及镉离子在相同溶液中的竞争吸附情况。研究发现，碳纳米管对 对溶液中以上三种不同离子的吸附顺序为Pb 2+>Cu2+>Cd2+，其中对铅离子(Pb2+)、铜离子 (Cu 2+)的吸附可以用Langmuir方程解释。
[0007] 李延辉等利用HNO3氧化处理的碳纳米管进行了对Pb2+的吸附实验。研究发现HNO3 氧化处理之后的碳纳米管表面积明显增大，另外-OH、-C0、-C00H等官能团被引入到了碳纳 米管的表面。这能够明显增强碳纳米管吸附Pb 2+的作用面积以及作用力，从而提高碳纳米管 对Pb2+的吸附量。结果表明，吸附量随着温度的升高而升高，这说明碳纳米管对Pb 2+的吸附 是一个放热过程。再生试验表明，吸附效果随PH值的增加而显著增加。当pH低至2时，碳纳米 管上吸附的Pb 2+脱附率到了 85%，从而为实现碳纳米管吸附材料的循环利用提供了理论依 据。
[0008] 除此之外，石墨烯和氧化石墨烯对于有机物污染以及由石油泄露造成的环境污染 也有很强的修复作用。石墨烯改性之后对环境中污染物的吸附效果更佳，并且吸附量增大、 性能更加稳定。Chen等人 ]制备出的三维多孔氧化石墨稀薄膜在选择吸附方面表现出了巨 大的潜力。它吸附机油的重量能够达到自身重量的37倍，吸附有机溶剂的重量则大于自身 重量的26倍，它的吸附效果相比片状石墨烯和泡沫石墨烯高很多。除此之外，该多孔氧化 石墨烯薄膜的性质十分稳定，可利用己烷去除表面的吸附物质之后循环利用。较高的吸附 量和较长的循环使用次数使得该三维多孔氧化石墨烯薄膜去除有机物以及清理石油污染 方面表现出了极大的应用前景。
[0009] 上述分析表明，石墨烯和碳纳米管等碳纳米材料在环境领域的应用主要在土壤、 水体以及大气污染修复方面，而作为生物调控剂进行应用，尤其碳纳米材料在堆肥草坪基 质中作为微生物调控剂，研究目前尚无文献报道。
[0010]随着我国经济增长和城市化速度的加快，城市生活和生产过程中产生的垃圾废物 呈现显著增加的趋势。与此同时，生活垃圾的配套处理却还不够完备，大量垃圾暴露在城市 中，对环境造成了很大的影响。堆肥化处理是城市生活垃圾处理及资源化比较便捷的方式， 这不仅能够消化城市中的生活垃圾，缓解了生活垃圾带来的城市环境压力，同时也生产出 了大量堆肥肥料供给农业生产。
[0011] 生活垃圾中含有大量植物生长所必需的营养元素，因此将生活垃圾堆肥化处理并 将堆肥用于农业生产是其资源化利用的有效途径。
[0012] 研究发现将适量垃圾堆肥添加到土壤当中能够有效增加作物产量。因土壤理化性 质以及作物类型不同，其增幅也存在显著差异。周德智等 ]研究了添加垃圾堆肥后，黄棕壤、 潮土以及红壤中种植的小麦产量变化。结果显示，添加适量垃圾堆肥后，作物均有增产效 果，其中红壤土效果最好(作物增产46%)。贺立源等 [43]研究发现，小白菜的产量随着垃圾堆 肥施用量的提高而增加，且与对照相比差异达到显著水平。此外，堆肥的施用不仅对作物产 量有影响，对作物的品质也有显著的提高效果。方亭等人的研究发现，将垃圾堆肥添加到棕 红壤土中，土壤作物油菜的籽粒中蛋白质的含量显著升高，大豆籽粒中所含的蛋白质明显 增加。
[0013] 然而，近些年来人们也开始意识到垃圾堆肥中不仅含有营养物质，同时还含有一 定量的重金属，如果长期施用会增加土壤中重金属的含量。因此，将堆肥用于农业生产可能 会带来一系列的食品安全问题。可见，避开食物链实现垃圾堆肥的资源化利用意义重大。不 仅如此，为防止堆肥利用导致土壤重金属污染，甚至给生态环境带来威胁，在应用的同时必 须考虑重金属修复的问题。
[0014] 传统的草皮生产通常是利用优质土壤。这会对土壤的物理性质产生很大的影响， 导致肥力下降。另外草皮生产时2 cm以上的耕层土壤会被带走，肥沃的耕层土壤进入城市 生态系统，而经过几次的草皮生产之后，农田土壤将变得越来越贫瘠，以致于最终无法再进 行农业生产，这是对国土资源极大的浪费。如果草坪建植以生活垃圾堆肥作为基本体系， 不仅能够消化城市垃圾，还能够减轻草坪生产带给耕层土壤的破坏作用。
[0015] 纳米技术近年来发展十分迅速，在材料、信息、环境等方面均表现出了广阔的应用 前景。虽然已经有一些研究理论研究，表明纳米材料会对微生物的生长产生不同程度的影 响，但应用其调控作用，还尚无相关技术报道。
[0016] 真菌属于真核微生物，在自然界中的分布非常广泛，真菌的多样性对于生物圈的 稳态和平衡发挥着重要的作用，同时真菌也为人类提供了大量的生物资源。在生物量方面， 土壤中的真菌占了重要的部分。其中有200多种为条件致病菌。真菌能够分解土壤当中的 有机质形成腐殖质，为植物提供养分，供给土壤动物的生长，并且真菌也是生态环境指标的 重要衡量标准。农田、草地、林地等等地方我们都能够轻易找到真菌的身影，但是由于其所 处的环境不同，在不同的环境因子影响下，土壤中真菌的菌落组成、分布都会出现不同的规 律。研究发现真菌在环境中发挥着各式各样的功能，比如讲解纤维素、螯合金属离子等等， 这些功能也使真菌生态环境中处于具足轻重的地位。
【发明内容】
[0017] 碳纳米材料因其特殊的结构具有很大的应用范围，吸附水体和土壤中的重金属就 是其中一项重要的应用。本技术从基质微生物角度出发，以生活垃圾堆肥和土壤混合物为 草坪基质材料，以向其中混合四种不同碳纳米材料作为处理组，通过草坪植物培养，研究添 加不同碳纳米材料一段时间后基质中可培养真菌类群的变化，并通过分子测序技术分析基 质中可培养真菌的分类地位。通过将碳纳米材料添加进草坪建植体系后真菌类群的变化的 认识，为碳纳米材料在垃圾堆肥草坪基质中真菌类群调控应用提供技术支撑。
[0018] 为实现上述目的本发明公开了如下的技术内容： 一种采用碳纳米材料调控草坪堆肥基质真菌鉴定分析的方法，其特征在于按如下的步 骤进行： (1)实验材料 实验用土壤取自天津师范大学校园0-20 cm表层土壤，基本性质为：含水量19.4%，pH 7.27，电导率2250的/〇11，有机质、全磷、全氮分别为52.3、3.75、2.15 8/1^。
[0019] 实验用生活垃圾堆肥来自天津市小淀垃圾处理厂。pH为7.49,电导率2300 ns/crn， 有机质、全磷、全氮分别为132、6.81、25.18/1^。重金属(^、〇1、？13、211、0(1含量分别为703、 341、217、677、5.01 mg/kg。
[0020] 供试纳米炭黑(CB)购于天津秋实炭黑厂，粒径为20~70 nm，比表面积为1200 m2/ g，pH值为7.0，实验前利用KMnO4对其改性处理。
[0021] 石墨烯(G)微片购于南京吉仓纳米科技有限公司，结构为黑色薄片状，微片尺寸 0.5-20 um，厚度5-25 nm，比表面积40-60 m2/g，密度约2.25 g/cm3,电导率 8000-10000 S/ m，含碳量>99.5%。
[0022]氧化石墨烯(GO)购于苏州恒球纳米公司，为黑色或褐黄色粉末，平均厚度3.4-7 nm，片层直径10-50 μπι，比表面积100-300 m2/g，纯度>90%〇
[0023]碳纳米管（CNT)购于北京博宇高科技新材料技术有限公司，直径20-40 nm，长度 10-30 um，_⑶OH含量 1.43%，纯度>90wt%，灰粉<8wt%，比表面积>110 m2/g，导电：>102 s/ cm 〇
[0024] (2)实验方法： 取土后立即测量土壤含水量，计算得到土壤干重与湿重的比例。按照比例算得干重 1500 g所对应的湿土重量。称得相应重量的湿土与30 g垃圾堆肥混合，搅拌均匀，装入内径 15 cm高20 cm的塑料花盆中，共装15盆。
[0025] 实验共设5个处理，石墨烯(G)、氧化石墨烯(GO)、碳纳米管（CNT)、改性纳米炭黑 (CB)按干土重1%的比例分别加入到混合基质中，以不添加碳纳米材料的处理为对照(CK)， 添加碳纳米材料后充分混匀，每盆播种高羊茅种子5g。培养期间温度为19~27 °C，相对湿 度为60~72%，每天给土壤补充水分，使土壤湿度保持在土壤持水量的70%。培养130d后，将 盆中0-5cm深度土壤取出混匀，过60目筛，冰箱-20°C保存，供微生物分离与计数分析。
[0026] 本发明进一步公开加了采用碳纳米材料调控草坪堆肥基质真菌鉴定分析方法在 确定真菌菌落的组成方面的应用。其中的所述真菌菌落的组成包括：青霉菌属 「Pe/jiciDit/?入木霉菌属入球毛壳菌属Mr入小球腔菌属 (^e jOiOSjOAaeriaA镰刀菌属(T^sariuW、曲霉菌属（JsjOergiDus)、浅色生赤壳菌属 (Bionectria ochroleuca)。
[0027] 本发明所述的纳米碳石墨稀(G)、氧化石墨稀(GO)、碳纳米管(CNT)、改性纳米炭黑 (CB)。改性纳米炭黑（CB)，实验前利用KMnO 4对其改性处理指的是：称取纳米碳10 g于250 mL锥形瓶中，加入100 mLO.03 mol .I/1的KMnO4溶液，静置10 min后，放于万用电热器上沸 腾回流I h。冷却后，用去离子水反复冲洗，使溶液不再浑浊且pH稳定。转移至烧杯，IKTC条 件下烘干至恒重。
[0028]本发明更加详细的描述如下： 1研制材料与方法 1.1实验材料 实验用土壤取自天津师范大学校园0-20 cm表层土壤，基本性质为：含水量19.4%，pH 7.27，电导率2250的/〇11，有机质、全磷、全氮分别为52.3、3.75、2.15 8/1^。
[0029] 实验用生活垃圾堆肥来自天津市小淀垃圾处理厂。pH为7.49,电导率2300 nS/crn， 有机质、全磷、全氮分别为132、6.81、25.18/1^。重金属(^、〇1、？13、211、0(1含量分别为703、 341、217、677、5.01 mg/kg。
[0030] 供试纳米炭黑(CB)购于天津秋实炭黑厂，粒径为20~70 nm，比表面积为1200 m2/ g，pH值为7.0，实验前利用KMnO4对其改性处理。
[0031] 石墨烯(G)微片购于南京吉仓纳米科技有限公司，结构为黑色薄片状，微片尺寸 0.5-20 um，厚度5-25 nm，比表面积40-60 m2/g，密度约2.25 g/cm3,电导率 8000-10000 S/ m，含碳量>99.5%。
[0032]氧化石墨烯(GO)购于苏州恒球纳米公司，为黑色或褐黄色粉末，平均厚度3.4-7 nm，片层直径10-50 μπι，比表面积100-300 m2/g，纯度>90%〇
[0033]碳纳米管（CNT)购于北京博宇高科技新材料技术有限公司，直径20-40 nm，长度 10-30 um，_⑶OH含量 1.43%，纯度>90wt%，灰粉<8wt%，比表面积>110 m2/g，导电：>102 s/ cm 〇
[0034]技术设计 取土后立即测量土壤含水量，计算得到土壤干重与湿重的比例。按照比例算得干重 1500 g所对应的湿土重量。称得相应重量的湿土与30 g垃圾堆肥混合，搅拌均匀，装入内径 15 cm高20 cm的塑料花盆中，共装15盆。
[0035] 实验共设5个处理，石墨烯(G)、氧化石墨烯(GO)、碳纳米管（CNT)、改性纳米炭黑 (CB)按干土重1%的比例分别加入到混合基质中，以不添加碳纳米材料的处理为对照(CK)， 每个处理三次重复。添加碳纳米材料后充分混匀，每盆播种高羊茅种子5g。培养期间温度为 19~27 °C，相对湿度为60~72%，每天给土壤补充水分，使土壤湿度保持在土壤持水量的 70%。培养130d后，将盆中0-5cm深度土壤取出混匀，过60目筛，冰箱-20 °C保存，供微生物分 离与计数分析。
[0036]研制方法 1.3.1真菌培养基配制方法 培养真菌用孟加拉红培养基，具体配方为蛋白胨5g、葡萄糖10g、磷酸二氢钾lg、硫 酸镁(MgS〇4*7H20) 0.5g、琼脂20g、l%的孟加拉红溶液3.3mL、蒸馏水100〇111匕121°(：灭菌 20分钟，室温晾至50-60°C时加入1%链霉素3ml，充分混匀，之后将其倒入培养皿，备用。链霉 素的加入能够有效地抑制培养基中真菌的生长。
[0037]真菌培养最适浓度的确定 根据微生物学实验指导以及以往培养经验初步确定真菌培养观察的最适浓度在HT2-10一3之间。取0.5g对照组中的基质土壤倒入装有50ml无菌水的锥形瓶中，制成HT 2浓度的土 壤浸出液，封口后置于摇床上，以150 rpm振荡20 min。振荡停止后静置10 S。吸取I mL 土壤浸出液移入试管中并添加9 mL无菌水，将其稀释10倍，制成KT3浓度的土壤浸出液，充 分混匀。分别取200ul 土壤浸出液均匀涂布到LB培养基上，将培养皿倒置放入28度的恒温培 养箱中，避光培养。连续观察真菌生长情况，待其大小适宜数量稳定后进行计数。预实验的 结果发现1〇_ 2这一浓度为草坪堆肥基质中真菌培养观察的最适浓度。培养时间为两天时最 适宜计数。
[0038]真菌平板计数方法 实验采用稀释平板涂布法分离基质中的真菌，具体操作过程为:称取0.5 g草坪堆肥基 质倒入装有50 mL无菌水的锥形瓶中，将锥形瓶封口后置于摇床上以150 rpm振荡20 min，得到HT2浓度的土壤悬浊液。取土壤悬浊液200ul注射到固体孟加拉红培养基上并涂 布均匀，之后将培养皿倒置于28 °C恒温培养箱内培养2d，选择菌落数在30-300个范围内 的平板进行分离计数，并按菌落特征归类、编号。用平板划线法对分离到的真菌进行纯化， 并置于4°C冰箱中保存备用。
[0039]真菌的分子生物学鉴定方法 对培养皿中每种纯培养得到的真菌利用Ezup柱式基因组DNA抽提试剂盒(上海生工)提 取真菌基因组DNA，按试剂盒操作流程进行实验。将所得DNA用于真菌18SrDNA PCR扩增实 验。扩增引物 ITSl(5 '-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3 '）、ITS4(5 '-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3 '）， PCR反应条件为:94°C预变性2min，94°C变性30s，59°C退火30s，72°C延伸90s，共35个循 环，最后72°C延伸7min_]。扩增体系如下（50 yL):引物1(27F) 2yL;引物2(1492R) 2yL; IOx Buffer(Mg2+) 5yL;dNTP lyL;Taq酶 lyL;DNA模板 10yL;ddH20 29yL。将扩增产物各 取7yL分别与2yL 6 XGlycerol DNA loading buffer混合均勾，取7yL混合液点样，进行 1.2%琼脂糖凝胶电泳，EB染色后，于紫外凝胶成像系统中观察，观察到明亮目标条带后将所 得PCR产物交由北京华大基因公司纯化与测序。
[0040] 真菌18SrDNA序列分析方法 测序结果经NCBI Blast( http: //www.ncbi.nlm.nih.gov)比对分析，获得相似度最 高的五个菌株的18SrDNA序列。运用ClustalX进行多重对比、用MEGA软件进行系统发育分 析，采用Neighbor-join法构建系统发育树，自展数(Bootstrap)为1000。根据序列的同源程 度初步确定待鉴定的菌株在分类学上的地位。将培养得到菌株与NCBI数据库中的模式菌株 进行比较，如果相似度达到96%以上，那么可将培养得到的菌株与模式菌株归为一个属，也 就将培养菌株鉴定到了属的水平。
[0041 ]研制结果分析 2.1基质中可培养真菌的18SrDNA分析 经过对草坪堆肥基质中真菌的培养计数以及种类划分归类，挑选出了不同特征的真菌 菌落。
[0042] 通过对不同真菌18SrDNA的PCR，得到了多条扩增片段，并且通过与DNA Marker的 位置对比，发现其条带符合真菌的特征，送测后的结果显示如下： 本实验共获得19条有效序列，将获得的序列通过Blast程序与Gen-Bank数据库中已 知序列进行相似性比对，其类别信息、相似性百分比及GenBank登录号见表1。
[0043]表1基质中可培养真菌的ISSrDNA序列相似性分析
通过序列相似性分析发现菌株1和菌株12为青霉菌属(PefliciDiUffi)，菌株2、7、9、10、 13、15、16、18为木霉菌属（TricAocZerffia)，菌株3为球毛壳菌属(driAroAacier)，菌株4为小 球腔菌属(IeptospAaeria)，菌株5、6、11为镰刀菌属(/7UsaritWff)，菌株8、14、17为曲霉菌属 (Js jOergiDus)，菌株19为浅色生赤壳菌属(BicMeciria ocAro_/euca)。以上菌株与模式菌 株的相似性均达到96%以上，可信度比较高。
[0044] 将分离出的19株形态不同的真菌菌株的测序结果进行Blast分析及多重比对，利 用MEGA5.1以18SrDNA同源性为基础构建系统进化树。
[0045] 研制结论 本技术结合分子测序技术对添加碳纳米材料后草坪堆肥基质中可培养真菌类群进行 鉴定分析，主要研究结果如下:共分离得到19株真菌，经18SrDNA测序结果表明这19株真菌 分别属于青霉菌属人木霉菌属〔rricAoc/ei-ffla人球毛壳菌属QriAroAacier入 小球腔菌属deptospAaeria人镰刀菌属(T 7UsaritWff人曲霉菌属(JsjOergiDus)、浅色生赤壳 菌属CMeciria 可培养真菌总数和多样性指数无显著差异，但是添加纳米 材料后真菌菌落的组成却发生了变化。
[0046]
【附图说明】： 图1是对其进行ISSrDNA扩增之后的电泳图；
【具体实施方式】： 下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为 本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范 围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发 明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属 于本发明的保护范围。本发明所用原料、试剂均有市售。
[0047] 实施例1 (1)实验材料 实验用土壤取自天津师范大学校园10 cm表层土壤，基本性质为：含水量19.4%，pH 7.27，电导率2250的/〇11，有机质、全磷、全氮分别为52.3、3.75、2.15 8/1^。
[0048] 实验用生活垃圾堆肥来自天津市小淀垃圾处理厂。pH为7.49,电导率2300 nS/crn， 有机质、全磷、全氮分别为132、6.81、25.18/1^。重金属(^、〇1、？13、211、0(1含量分别为703、 341、217、677、5.01 mg/kg。
[0049] 供试纳米炭黑（CB)购于天津秋实炭黑厂，粒径为20 nm，比表面积为1200 m2/g， pH值为7.0，实验前利用KMn〇4对其改性处理。
[0050] 石墨烯(G)微片购于南京吉仓纳米科技有限公司，结构为黑色薄片状，微片尺寸 0.5 um，厚度5 nm，比表面积40 m2/g，密度约2.25 g/cm3,电导率8000 S/m，含碳量>99.5%。
[0051] 氧化石墨烯(GO)购于苏州恒球纳米公司，为黑色或褐黄色粉末，平均厚度3.4-7 nm，片层直径ΙΟμπι，比表面积100 m2/g，纯度>90%〇
[0052]碳纳米管（CNT)购于北京博宇高科技新材料技术有限公司，直径20 nm，长度 10um，-C00H含量 1.43%，纯度>90wt%，灰粉<8wt%，比表面积>110 m2/g，导电：>102 s/cm〇 [0053] (2)实验方法： 取土后立即测量土壤含水量，计算得到土壤干重与湿重的比例。按照比例算得干重 1500 g所对应的湿土重量。称得相应重量的湿土与30 g垃圾堆肥混合，搅拌均匀，装入内径 15 cm高20 cm的塑料花盆中，共装15盆。
[0054] 实验共设5个处理，石墨烯(G)、氧化石墨烯(GO)、碳纳米管（CNT)、改性纳米炭黑 (CB)按干土重1%的比例分别加入到混合基质中，以不添加碳纳米材料的处理为对照(CK)， 添加碳纳米材料后充分混匀，每盆播种高羊茅种子5g。培养期间温度为19 °C，相对湿度为 60%，每天给土壤补充水分，使土壤湿度保持在土壤持水量的70%。培养130d后，将盆中Icm深 度土壤取出混匀，过60目筛，冰箱-20°C保存，供微生物分离与计数分析。
[0055] 实施例2 (1)实验材料 实验用土壤取自天津师范大学校园20 cm表层土壤，基本性质为：含水量19.4%，pH 7.27，电导率2250的/〇11，有机质、全磷、全氮分别为52.3、3.75、2.15 8/1^。
[0056] 实验用生活垃圾堆肥来自天津市小淀垃圾处理厂。pH为7.49,电导率2300 yS/cm， 有机质、全磷、全氮分别为132、6.81、25.18/1^。重金属(^、〇1、？13、211、0(1含量分别为703、 341、217、677、5.01 mg/kg。
[0057] 供试纳米炭黑（CB)购于天津秋实炭黑厂，粒径为70 nm，比表面积为1200 m2/g， pH值为7.0，实验前利用KMn〇4对其改性处理。
[0058]石墨烯(G)微片购于南京吉仓纳米科技有限公司，结构为黑色薄片状，微片尺寸20 um，厚度25 nm，比表面积60 m2/g，密度约2.25 g/cm3,电导率10000 S/m，含碳量>99.5%。
[0059]氧化石墨烯(GO)购于苏州恒球纳米公司，为黑色或褐黄色粉末，平均厚度7 nm，片 层直径50 μπι，比表面积100-300 m2/g，纯度>90%。
[0060]碳纳米管（CNT)购于北京博宇高科技新材料技术有限公司，直径40 nm，长度30 um，_C00H含量 1.43%，纯度>90wt%，灰粉<8wt%，比表面积>110 m2/g，导电：>102 s/cm。
[0061 ] (2)实验方法： 取土后立即测量土壤含水量，计算得到土壤干重与湿重的比例。按照比例算得干重 1500 g所对应的湿土重量。称得相应重量的湿土与30 g垃圾堆肥混合，搅拌均匀，装入内径 15 cm高20 cm的塑料花盆中，共装15盆。
[0062] 实验共设5个处理，石墨烯(G)、氧化石墨烯(GO)、碳纳米管（CNT)、改性纳米炭黑 (CB)按干土重1%的比例分别加入到混合基质中，以不添加碳纳米材料的处理为对照(CK)， 添加碳纳米材料后充分混匀，每盆播种高羊茅种子5g。培养期间温度为27 °C，相对湿度为 72%，每天给土壤补充水分，使土壤湿度保持在土壤持水量的70%。培养130d后，将盆中5cm深 度土壤取出混匀，过60目筛，冰箱-20°C保存，供微生物分离与计数分析。
【主权项】
1. 一种采用碳纳米材料调控草坪堆肥基质真菌鉴定分析的方法，其特征在于按如下的 步骤进行： (1) 实验材料 实验用土壤取0-20 cm表层土壤； 供试纳米炭黑粒径为20~70 nm，比表面积为1200 m2/g，pH值为7.0,实验前利用KMn〇4 对其改性处理； 石墨烯微片尺寸0.5-20 um，厚度5-25 nm，比表面积40-60 m2/g，密度约2.25 g/cm3,电 导率 8000-10000 S/m，含碳量>99.5%; 氧化石墨烯平均厚度3.4-7 nm，片层直径10-50 μπι，比表面积100-300 m2/g，纯度>90%; 碳纳米管直径20-40 nm，长度10-30 um，_⑶OH含量1.43%，纯度>90wt%，灰粉<8wt%，比 表面积>110 m2/g，导电：>102 s/cm; (2) 实验方法： 取土后立即测量土壤含水量，计算得到土壤干重与湿重的比例，按照比例算得干重 1500 g所对应的湿土重量，称得相应重量的湿土与30 g垃圾堆肥混合，搅拌均匀，装入内径 15 cm高20 cm的塑料花盆中，共装15盆； 实验共设5个处理:石墨烯(G)、氧化石墨烯(GO)、碳纳米管(CNT)、改性纳米炭黑(CB)按 干土重1%的比例分别加入，添加碳纳米材料后充分混匀，以不添加碳纳米材料的处理为对 照(CK)，每盆播种高羊茅种子5g，培养期间温度为19~27 °C，相对湿度为60~72%，每天给 土壤补充水分，使土壤湿度保持在土壤持水量的70%，培养130d后，将盆中0-5cm深度土壤取 出混匀，过60目筛，冰箱-20°C保存，供微生物分离与计数分析。2. 权利要求1所述的方法，其中土壤的基本性质为:含水量19.4%，pH 7.27，电导率2250 的/〇11，有机质、全磷、全氮分别为52.3、3.75、2.15 8/1^; 实验用生活垃圾堆肥来自天津市小淀垃圾处理厂，pH为7.49,电导率2300 uS/cm，有机 质、全磷、全氮分别为132、6.81、25.1&/1^; 重金属〇、&1、？13、211丄(1含量分别为703、341、217、677、5.0111^/1^; 纳米炭黑，粒径为20~70 nm，比表面积为1200 m2/g，pH值为7.0,实验前利用KMn〇4对 其改性处理； 石墨烯微片尺寸0.5-20 um，厚度5-25 nm，比表面积40-60 m2/g，密度约2.25 g/cm3,电 导率 8000-10000 S/m，含碳量>99.5%; 氧化石墨烯平均厚度3.4-7 nm，片层直径10-50 μπι，比表面积100-300 m2/g，纯度>90%; 碳纳米管，直径20-40 nm，长度10-30 um，-C00H含量1.43%，纯度>90wt%，灰粉<8wt%，比 表面积>110 m2/g，导电:>102 s/cm。3. 权利要求1所述采用碳纳米材料调控草坪堆肥基质真菌鉴定分析方法在确定真菌菌 落的组成方面的应用。4. 权利要求3所述的应用，其中所述真菌菌落的组成包括:青霉菌属入木 霉菌属人球毛壳菌属入小球腔菌属(^ejOioSjOAaei-ia)、镜刀菌 属人曲霉菌属、浅色生赤壳菌属 6?io/3eci_ria ocAro_/et/ca」。
【文档编号】C12Q1/04GK106086154SQ201610443330
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月21日
【发明人】多立安, 赵树兰, 郑亚南
【申请人】天津师范大学