一种用于检测人源性bcl?2基因表达水平的引物组合及其应用
【专利摘要】本发明属基因技术领域，本发明涉及一种用于BCL?2基因表达水平的引物组合。本发明通过设计人源性BCL?2基因的特异性引物和核糖体蛋白RPL19基因的特异性引物，将其用于BCL?2基因表达水平的检测。本发明设计的引物，无非特异性扩增，以表达水平不受内质网应激影响的RPL19基因作为管家基因，可对BCL?2基因的表达水平进行准确相对定量。本发明的检测系统简单高效，使用方便，检测只需 1.2h即可完成。
【专利说明】一种用于检测人源性BCL-2基因表达水平的引物组合及其 应用
[0001]技术领域本发明属基因技术领域，本发明涉及一种用于检测人源性BCL-2基因表 达水平的引物组合。
【背景技术】 [0002] B细胞淋巴瘤_2(BCL2)家族蛋白质通过蛋白质之间的相互作用调节线 粒体外膜的通透性，从而控制线粒体凋亡通路。BCL2基因位于18q21染色体上，编码的蛋白 含有293个氨基酸残基，主要存在于细胞中的线粒体内膜、内质网膜及核膜上，主要功能是 通过抑制线粒体中细胞色素 M的释放，明显地抑制细胞凋亡。内质网中内源性的BCL2比较 少，但是其同样可影响内质网的稳态和凋亡，内质网应激时，CHOP可调节BCL2的表达，其通 过与cAMP反应元件结合蛋白形成二聚体抑制BCL2的表达。抗凋亡的Bcl-2与促凋亡的Bax的 比例在一定程度上决定了细胞是否发生凋亡，Bax/Bcl-2比值高的细胞较Bax/Bcl-2比值低 的细胞容易发生凋亡。此外，BCL2基因的过度表达，会导致细胞持续增殖，进而导致肿瘤发 生，已有研究证实，在未分化鼻咽癌、非小细胞肺癌、胃癌、直肠癌、B细胞淋巴癌、急性白血 病等多种肿瘤组织中，BCL2蛋白均呈高水平表达，由此可见BCL2在肿瘤发生发展中起了重 要作用。有研究表明BCL2在正常脑组织和低级别、高级别胶质瘤中表达有显著性差异，随肿 瘤恶性程度增高，BCL2表达量增高，在高级别胶质瘤中表达水平最高，与胶质瘤的恶性程度 相关。BCL2在胶质瘤的发生、发展过程中起重要作用，可能成为胶质瘤预后判断的潜在指标 之一。对乳腺癌的研究则表明BCL-2表达与乳腺癌临床病理分期及肿瘤大小呈负相关，而与 肿瘤细胞分化程度呈正相关，因此了解BCL-2表达水平有助于患者预后的判断。
[0003] 对BCL-2表达水平的研究除采用免疫组化和Western免疫印迹等方法从蛋白水平 进行研究外，也可从mRNA水平研究，包括半定量反转录PCR和荧光定量PCR方法等。以蛋白为 检测目标的方法通常操作比较繁琐，耗时。半定量反转录PCR需要电泳检测，准确度不够高。 荧光定量PCR方法是一种高灵敏度、简便快捷的检测方法，操作简单，可应用SYBR green染 料法检测，无需使用荧光探针，采用荧光定量PCR相对定量方法通过与表达水平相对稳定的 管家基因比较来反映目的基因的表达水平，能很好的辅助BCL-2表达水平的研究，整个PCR 反应过程只需1.2小时即可完成。管家基因需选择维持细胞最低限度功能所不可少的基因， 在所有细胞中均要表达的一类基因，且表达水平受环境因素影响较小。细胞在应激反应时 一些正常表达的基因会受到抑制，有研究表明比较常用的actin管家基因受内质网应激影 响，表达量会减少，因此不适宜用做内质网应激时的参考基因。核糖体蛋白基因产物是维持 细胞生命活动所必须的，表达于所有细胞中，其表达只受启动序列或启动子与RNA聚合酶相 互作用的影响，而不受其他机制调节，可用作内质网应激时的参考基因。
【发明内容】
[0004] 本发明通过设计人源性BCL-2基因的特异性引物和核糖体蛋白RPL19基因的特异 性引物，将其用于BCL-2基因表达水平的检测。本发明的工作原理是应用荧光定量PCR SYBR green荧光染料的方法根据相对定量原理，即2^^1去确定基因表达水平。
[0005] 本发明包含两对引物，一对引物是针对人源性BCL-2基因的特异性引物；另一对引 物是针对人的核糖体蛋白RPL19基因设计的特异性引物。
[0006] 根据NCBI公布的human BCL-2的mRNA序列（序列号:NM_000633.2)设计BCL-2引物 序列见表1: 表1.BCL-2引物设计
根据NCBI公布的human RPL19的mRNA序列(序列号:NM_000981.3)设计引物序列见表2: 表2.RPL19引物设计
本发明设计的两对引物可分别特异性检测BCL-2和RPL19基因的mRNA表达水平，无非特 异性扩增，所选择的管家基因表达水平不受内质网应激影响，可对BCL-2基因的表达水平进 行准确定量。本发明的检测系统采用SYBR green荧光染料方法，无需使用探针，试剂使用方 便，只需加入相关检测模板即可，不需要繁琐的操作步骤，整个检测过程只需1.2h即可完 成。
[0007] 附图与说明 附图1为本发明实施例一中BCL-2和RPL19基因扩增产物的融解曲线，其中A为BCL-2基 因扩增产物的融解曲线，B为RPLl 9基因扩增产物的融解曲线。
[0008] 附图2.为本发明实施例二中Manf蛋白对ro细胞模型BCL-2基因表达水平的影响。
【具体实施方式】
[0009]下面结合附图和实施例，对本发明的【具体实施方式】作进一步详细描述。以下实施 例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[00?0]本发明实施例中采用诺唯赞的Acetaq SYBR supermix，采用25微升反应体系。焚 光定量PCR仪采用ABI7500。
[0011]利用本发明的特异性引物组合和方法检测人源性BCL-2基因表达水平时，基本操 作为： 步骤1.细胞RNA提取 采用商品化试剂盒提取细胞RNA，紫外分光光度计测定RNA浓度，并控制提取质量 0D260/280~2.0。本发明实施例采用天根总RNA提取试剂盒提取细胞RNA，具体操作按说明 书进行； 步骤2.CDNA反转录 取大约500ng RNA采用商品化试剂盒进行cDNA反转录。本实施例采用Takara的商品化 试剂盒PrimeScript? RT Master Mix(Perfect Real Time)进行反转录，具体操作按说明 书进行； 步骤3.荧光定量PCR反应 实验中每种模板分别加入两种荧光定量PCR反应体系中分别进行BCL-2和RPL19基因检 测，一种反应体系包含组分如下： IXAcetaq SYBR supermix 上游引物(F-BCL-2) 各0.1~0·5μΜ 下游引物(R-BCL-2) 各0.1~0.5μΜ 模板（1:5稀释的cDNA) 5μ1 总体积 25μ1 另一种反应体系包含组分如下： IXAcetaq SYBR supermix 上游引物(F-rpl) 各0.1~0·5μΜ 下游引物(R_rpl) 各0.1~0·5μΜ 模板（1:5稀释的cDNA) 5μ1 总体积 25μ1 荧光定量PCR反应条件:95°C 5min，然后再运行40个循环(具体95°C 10s，60°C 34s)， 退火时检测荧光信号。可在运行结束后进行融解曲线分析，检测引物扩增的特异性； 步骤4.检测结果分析 根据系统自动基线和设置的对数期阈值获得各个反应的CT值，计算值，即实验组 BCL-2基因 mRNA表达水平与对照组比较的倍数，AACT=(CTbcd(实验组)_CTrpi19(实验组））-(CTbcd (对照组)_CTrpi19 (对组））。
[0012] 实施例一慢病毒感染细胞株BCL-2基因表达水平的检测 将含有GRP78基因干扰序列的慢病毒感染SH-SY5Y细胞:SH-SY5Y细胞用含10%FBS的高 糖DMEM培养基，置于37°C，5%C02培养箱内培养，取对数生长期的SH-SY5Y细胞进行消化、计 数，接种至96孔细胞培养板，5000个细胞/孔，次日使用不含FBS的DMEM培养基稀释RNAi慢病 毒浓缩液，每孔加入1〇μ1含RNA干扰序列的慢病毒浓缩液和90μ1不含FBS的DMEM培养基，在 37°C，5%C02培养箱内培养24h，更换新鲜的含10% FBS的高糖DMEM培养基继续培养48h，收集 细胞提取RNA，反转录后采用荧光定量PCR检测BCL-2基因表达水平。检测结果见表3: 表3.慢病毒感染细朐与对照细朐BCL-2表汰7k平的比较
表3结果表明慢病毒感染细胞BCL-2基因表达水平是对照组细胞的1.22倍，说明含有 GRP78基因干扰序列的慢病毒感染细胞可促进BCL-2基因的表达。BCL2和RPL19基因扩增产 物融解曲线均为单一融解曲线(见图1)说明引物扩增特异性好，无非特异性扩增。
[0013] 实施例二通过检测BCL-2表达水平研究Manf蛋白对细胞的保护作用 帕金森病(Parkinson Disease, PD)是一种椎体外系进行性神经退化性疾病，研究表 明氧化应激损伤和α-突触核蛋白神经免疫反应是导致帕金森病的主要原因，都能产生应激 反应。已证实MANF蛋白对多巴胺能神经元具有保护作用。通过采用6-羟基多巴胺(6-OHDA) 制作SH-SY5Y细胞损伤的帕金森病细胞模型可检测Manf蛋白的保护作用机制。将实验分为 对照组(DMEM)组、6-OHDA(50ymol/L)组以及 Manf+ 6-OHDA(50ymol/L)(4μg/ml)组。预先给 予Manf蛋白4h后加入6-OHDA分别作用Ih、7h和18h后收集细胞，提取RNA，反转录后采用荧光 定量PCR测定BCL-2基因的表达水平。通过与对照组比较，计算出各组BCL-2基因的相对表达 水平(见图2)，结果表明在Manf蛋白存在情况下经过1小时，细胞BCL-2表达水平较正常细胞 略有升高，7小时后明显升高，18小时后略有降低，但仍高于正常表达水平，而6-OHDA组仅在 18小时BCL-2表达水平升高，说明Manf蛋白对6-OHDA诱导的SH-SY5Y细胞损伤的保护作用， 可能通过诱导BCL-2基因表达水平的明显升高来实现。
[0014] 通过上述的实施例可以知道，本发明的特异性引物组合及相应的方法，可以特异 性检测人源性BCL-2基因的表达水平，避免同源性基因的干扰，并以不受内质网应激影响的 RPL19作为内参，提高了人源性BCL-2基因表达水平的检测准确性，检测过程简单、高效。
[0015] 以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限 制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和 替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和 修改，都应涵盖在本发明的范围内。
【主权项】
1. 一种用于检测人源性BCL-2基因表达水平的特异性引物组合，该组合包含以下引物 序列： BCL-2基因检测的引物组合： 上游引物 F-bc 1: AGATTGATGGGATCGTTGCCT 下游引物R-bc 1: ACTTCCTCTGTGATGTTGTATT RPL19内参基因检测的引物组合： 上游引物F-rpl: CGAGCGAGCTCTTTCCTTT 下游引物R-rp 1: AGACCTTCTTCTTGCCACAGC。2. -种检测人源性BCL-2基因表达水平的方法，其特征在于，使用如权利要求1所述的 特异性引物组合而进行。3. -种用于检测人源性BCL-2基因表达水平的试剂盒，其特征在于，包含有如权利要求 1所述的特异性引物组合。4. 根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括DNA聚合酶、dNTP和缓冲液。5. 根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述聚合酶为热稳定性DNA聚合酶。
【文档编号】C12N15/11GK106086163SQ201610259047
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年4月25日 公开号201610259047.9, CN 106086163 A, CN 106086163A, CN 201610259047, CN-A-106086163, CN106086163 A, CN106086163A, CN201610259047, CN201610259047.9
【发明人】蒋明, 于丽华, 郭佳, 刘敏亚
【申请人】同济大学苏州研究院