一种检测葡萄风信子基因转录表达的内参基因及应用
【专利摘要】本发明公开了一种检测葡萄风信子基因转录表达的内参基因，所述内参基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，该内参基因能够满足qRT?PCR检测葡萄风信子基因转录表达水平要求，提高qRT?PCR方法检葡萄风信子基因转录表达水平的准确性。本发明还公开了上述内参基因在葡萄风信子总RNA的qRT?PCR检测中的应用。同时，应用本发明提供的引物对ACT T1?5077?s?2可获得高度稳定表达的内参基因，避免了由内参基因mRNA表达稳定性差造成的葡萄风信子基因mRNA表达定量检测精确度低的问题。
【专利说明】
一种检测葡萄风信子基因转录表达的内参基因及应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测葡萄风信子基因转录表达的内参基 因及应用。
【背景技术】
[0002] 合适的内参基因，是实时荧光定量PCR(qRT-PCR)中识别目的基因准确表达模式的 关键因素。理想的内参基因应具备以下特征:在所有组织及细胞类型中均有表达，且不受外 界条件影响;在不同环境和试验条件下稳定表达，且不受任何内外因素的影响;与目的基因 表达水平相似。将内参基因应用于目的基因转录表达的定量检测，对研究目的基因的表达 具有重要意义。
[0003]葡萄风信子花期早、开花时间较长，常作疏林下的地面覆盖或用于花境、草坪的成 片、成带与镶边种植。获得葡萄风信子基因转录表达的内参基因，对qRT-PCR检测不同葡萄 风信子品种、及葡萄风信子不同发育时期的基因表达水平具有重要意义，可以提高qRT-PCR 方法检测该植物基因转录表达水平的准确性。
[0004] 然而现有技术中，缺乏一种能满足qRT-PCR检测葡萄风信子基因转录表达水平要 求的内参基因。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种检测葡萄风信子基因转录表达的内参基因及应用，能够 满足qRT-PCR检测葡萄风信子基因转录表达水平要求，提高qRT-PCR方法检测葡萄风信子基 因转录表达水平的准确性。
[0006] 本发明的目的是提供一种检测葡萄风信子基因转录表达的内参基因，所述内参基 因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0007] 本发明还提供了一种检测葡萄风信子基因转录表达的内参基因在葡萄风信子总 RNA的qRT-PCR检测中的应用。
[0008] 优选的，上述内参基因在葡萄风信子总RNA的qRT-PCR检测中应用时，使用引物对 ACT T 1 -507 7-S-2,并且所述引物对ACT T 1 -50 77-S-2包括上游引物5'_ aacattcagaaagagtccaccc-3 ' 和下游弓丨物5 ' -gcttaccagcaaagatcaaccg-3 '。
[0009] 本发明提供一种检测葡萄风信子基因转录表达的内参基因，能够满足qRT-PCR检 测葡萄风信子基因转录表达水平要求，提高qRT-PCR方法检葡萄风信子基因转录表达水平 的准确性;应用本发明提供的引物对ACT T1-5077-S-2可获得高度稳定表达的内参基因，避 免了由内参基因 mRNA表达稳定性差造成的葡萄风信子基因 mRNA表达定量检测精确度低的 问题。
【附图说明】
[0010] 图1是本发明利用Genorm软件分析12个候选内参基因在"亚美尼亚"品种中的mRNA 平均相对表达量；
[0011] 图2是本发明利用Genorm软件分析12个候选内参基因在"白色丽人"品种中的mRNA 平均相对表达量；
[0012] 图3是本发明的内参基因 ACT-Tl 5077在"亚美尼亚"品种中的不同花发育时期的 mRNA相对表达量；
[0013]图4是本发明的内参基因 ACT-Tl 5077在"白色丽人"品种中的不同花发育时期的 mRNA相对表达量。
【具体实施方式】
[0014] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明进行详细说明。
[0015] 本发明提供了一种检测葡萄风信子基因转录表达的内参基因 ACT-TI 5077,内参 基因 ACT-TI 5077的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。内参基因 ACT-TI 5077在qRT-PCR检测 中应用时，使用的引物对为ACT-T15077-S-2，其中引物对ACT-T15077-S-2包括:如SEQ ID NO · 2所示的上游引物5 ' -aacattcagaaagagtccaccc-3 '和如SEQ ID NO · 3所示的下游引物 S^gcttaccagcaaagatcaaccg-S? 〇
[0016] 一、mRNA相对表达量Qi的测定
[0017] 获取葡萄风信子的代表品种"亚美尼亚(Muscari armeniacum)"的六个不同花期 的样品，六个不同花期的样品包括完全未着色的花蕾SA0、开始着色的花蕾SA1、刚开始转色 的花蕾SA2、完全着色未开放的花蕾SA3、完全开放的花SA4、衰败的花SA5;
[0018] 获取葡萄风信子的代表品种"白色丽人(Muscari aucheri/White Beauty')"的六 个不同花期的样品，六个不同花期的样品包括完全未着色的花蕾SW0、开始着色的花蕾SW1、 刚开始转色的花蕾SW2、完全着色未开放的花蕾SW3、完全开放的花SW4、衰败的花SW5;
[0019] 将上述12个样品进行mRNA相对表达量Qi测定，样品SA0、SA1、SA2、SA3、SA4、SA5、 SWO、SWl、SW2、SW3、SW4、SW5分别对应实施例1 -12，下面以样品SAO对应的实施例1为例，说明 mRNA相对表达量Qi测定的具体步骤。
[0020] 实施例1
[0021] 步骤1，将SAO样品置于液氮中进行液氮研磨，获得冷冻植物组织，然后采用Omega 总RNA提取试剂盒，并按Omega总RNA提取试剂盒的操作说明提取总RNA，具体按照以下步骤 实施：
[0022] 步骤1.1，取研磨好的冷冻植物组织IOOmg加入到1.5mL的离心管中，然后加入500μ L的含有β_巯基乙醇的BufferRCL，混匀后得到第一混合液。
[0023] 步骤1.2,将步骤1.1的第一混合液于55°C孵育3min，然后于室温下HOOOg离心 5min；
[0024] 步骤1.3,吸取上清液至gDNA过滤吸附柱中，然后将gDNA过滤吸附柱置于第一收集 管内，并于室温下HOOOg离心2min;
[0025] 步骤1.4,弃gDNA过滤吸附柱，在第一收集管中加入等体积的Buffer RCB，吸打5-6 次，混匀，得到混合液；
[0026] 步骤1.5,吸取步骤1.4中混合液的一半至HiBind RNA吸附柱中，然后将HiBind RNA吸附柱置于第二收集管内，并于室温下1000 g离心Imin，倒掉第二收集管中的液体；
[0027] 步骤1.6,将步骤1.4中混合液的剩余液体再次加入HiBind RNA吸附柱中，重复步 骤1.5;
[0028] 步骤1.7,向步骤1.6的HiBind RNA吸附柱中加入400yLRWC Wash Bufier，室温下 1000 g离心Imin，弃第二收集管；
[0029] 步骤1.8,将HiBind RNA吸附柱放入新的2mL的第三收集管中，加入500yLRNA Wash Buffer 11，于室温I OOOg离心Imin，弃废液；
[0030] 步骤1 · 9，重复步骤1 · 8，后于1000 g离心2min甩空柱使其干燥；
[0031] 步骤1.10,将HiBind RNA吸附柱放入新的1.5mL离心管中，加入30-50yL的DEPC水， 室温静置2min，1000 g离心2min，获得总RNA。
[0032] 需要说明的是，步骤1中所有的试剂均是Omega总RNA提取试剂盒中自带的试剂。
[0033] 步骤2,合成cDNA
[0034] 以步骤1中提取的总RNA为模板，使用反转录试剂盒合成cDNA，其中反转录试剂盒 为TaKaRa公司的PrimeScript TM RT reagent kit with gDNA Eraser，具体按照以下步骤 实施：
[0035] 步骤2.1，去除基因组DNA反应
[0036]按表1所示的成分于冰上配制反应混合液，为了保证反应液配制的准确性，进行各 项反应时，应先按反应数+2的量配制Master Mix，然后再分装到每个反应管中，最后加入总 RNA样品，然后于42°C孵育2min，或者于室温放置5min*2,最后将反应后的混合液于4°C保 存，备用。
[0037]表1去除基因组DNA反应所需要的成分及用量
[0040] 步骤2.2,反转录反应。
[0041] 按表2所示的成分于冰上配制反应混合液，为了保证反应液配制的准确性，进行各 项反应时，应先按反应数+2的量配制Master Mix，然后再分装IOyL到每个反应管中，轻柔混 匀后立即在PCR仪上进行反转录反应，反转录反应条件为，先37 °C反应15min，然后85 °C反应 5s，获得cDNA，最后于4°C保存备用。
[0042]表2反转录反应所需要的成分及用量
[0044]步骤3,设计特异引物，引物送北京奥科合成
[0045] 步骤3. 1，根据葡萄风信子转录组数据库（NCBI Accession:SRR999309、 SRR998575、SRR998808、SRR998853)，筛选出12个表达量较为稳定的基因作为候选内参基 因，包括1^丁2-23555、1^12-26100、1]2八卩丁4-23918』卩-1丁4-17127、八(：1'-丁3-13229、1^丁2-31202、18ST1-15917、ACT-TI 5077、CYP T4-25962、F-B0X T1-20848、18ST3-13835和ACT; [0046] 步骤3.2，按照定量引物设计原则，利用Primer 5.0软件，针对步骤3.1中所述12个 表达量较为稳定的候选内参基因，分别设计特异引物，结果如表3所示。
[0047]表3 12个候选内参基因的特异引物
[0050]步骤4,分别采用表3中所述的12个候选内参基因各自对应的引物，对步骤2中获得 cDNA进行qRT-PCR检测及其mRNA相对表达量Qi的测定，具体按照以下步骤实施：
[00511 步骤4.1，用博日科技公司的2 X SYBR Green Mix反应试剂盒，并按试剂盒的说明 书进行21yL体系的qRT-PCR。
[0052] 利用BIORAD公司的CFX-96实时荧光定量PCR仪，观察qRT-PCR的扩增曲线，发现12 个候选内参基因各自对应的qRT-PCR产物均在40个循环内达到平台期，且熔解曲线均呈单 峰，说明12个候选内参基因的扩增特异性均很强；
[0053]步骤4.2,利用比较Ct值法，并根据公式Qi=EAet1，分别计算12个候选内参基因各 自对应的mRNA相对表达量Qi ;
[0054]其中，E为特异引物扩增效率(一般情况下将特异引物扩增设为较理想的扩增，扩 增效率E默认为2 )，Δ Ct i = Ctmin-Ct i，CtminS 12个候选内参基因的最低Ct值，Ct i样品为每 个样品的Ct值，其中i取1-12中的正整数，且i = l-12时，依次对应候选内参基因1^丁2-23555、RPT2-26100、U2AFT4-23918、EF-1T4-17127、ACT-T3-13229、RPT2-31202、18ST1-15917、ACT-TI 5077、CYP T4-25962、F-B0XT1-20848、18ST3-13835和ACT各自的Qi、Acti、 Cti 值。
[0055] 需要说明的是，由于实施例2-12与实施例1所采用的步骤是一样的，只是将出发样 品 SAO分别替换为样品 SAl、SA2、SA3、SA4、SA5、SWO、SWl、SW2、SW3、SW4、SW5，并利用表3 中的 12 个候选内参基因分别测定样品 SAO、SAl、SA2、SA3、SA4、SA5、SWO、SWl、SW2、SW3、SW4、SW5 各 自对应的mRNA相对表达量Qi，故在此对实施例2-12的详细步骤不做赘述。
[0056] 二、最佳内参基因的确定
[0057]为了确定最佳的内参基因，对于"亚美尼亚"品种，以每个候选内参基因的mRNA平 均相对表达量作为参考因素，分别评价12个候选内参基因的mRNA表达稳定性，此处mRNA平 均相对表达量取SAO、SAl、SA2、SA3、SA4、SA5各自对应的mRNA相对表达量Qi的平均值；
[0058]对于"白色丽人"品种，也是以每个候选内参基因的mRNA平均相对表达量作为参考 因素，分别评价12个候选内参基因的mRNA表达稳定性，此处mRNA平均相对表达量取SWO、 SWl、SW2、SW3、SW4、SW5各自对应的mRNA相对表达量Qi的平均值。
[0059]应用6611〇1'111(￥61'.3.5)、1368七1^6卩61'(￥61'.1.0)和1^〇1'11^；[11(161'(￥61'.0.953)3种分析 软件，分别对样品"亚美尼亚"品种和"白色丽人"品种各自的mRNA平均相对表达量进行分 析，并分别评价12个候选内参基因的mRNA表达稳定性，选择mRNA表达稳定性最好的作为本 发明的内参基因。
[0000] Genorm统计模型基于两个mRNA表达稳定性最好的基因，因其mRNA表达稳定性相同 的假设，根据基因之间的配对变异（Pairwi se var iat ion)计算其mRNA表达稳定性M值 (Average expression stabilityvalues)，逐步排除稳定性最差的基因，使得基因依照稳 定性进行排序。M值越大，基因的mRNA表达稳定性越差，反之稳定性越好。该软件默认的取舍 值M=I. 5,若内参基因 M值小于1.5,就可以考虑将其作为内参基因。
[0061 ] 利用Genorm软件对12个候选内参基因在"亚美尼亚"品种中的mRNA平均相对表达 量进行分析，结果如图1所示，由图1可知，12个候选内参基因中，ACT-TI 5077和CYP T4-25962显示最低的M值，表现了最高的mRNA表达稳定性。
[0062] 利用Genorm软件对12个候选内参基因在"白色丽人"品种中的mRNA平均相对表达 量进行分析，结果如图2所示，由图2可知，12个候选内参基因中4(：1'-1'1 5077、1]24?了4-23918、RP T2-26HKKF-B0XT1-20848显示较低的M值，表现了较高的mRNA表达稳定性。
[0063] NormFinder软件主要基于方差分析的结果对候选内参基因 mRNA表达稳定性进行 分析，并直接根据他们的稳定值进行排序，稳定值越小说明候选内参mRNA表达稳定性越好。 [0064] 表4为NormFinder软件分析候选内参基因在"亚美尼亚"品种中的mRNA表达稳定 性，根据稳定值排序可知，CYP T4-25962、ACT-TI5077在"亚美尼亚"品种中的mRNA表达稳定 性较高;表5为NormFinder软件分析候选内参基因在"白色丽人"品种中的mRNA表达稳定性， 根据稳定值排序可知EF-1T4-17127、18ST1-15917、ACT-TI 5077在"白色丽人"品种中的 mRNA表达稳定性较高。
[0065] Bestkeeper软件是对样品进行配对相关分析，计算其标准差(SD)和变异系数(CV) 以及各基因间的配对相关系数(泊松相关系数)来判定稳定内参基因，SD小于1的内参基因 被认为是稳定表达的基因，SD越小，CV越小，说明该内参基因越稳定，反之，不稳定。因为 Bestkeeper最多只能分析10个候选基因的相互关系，根据Genorm和NormFinder两个软件的 分析结果，把"亚美尼亚"品种中最不稳定的3个候选内参基因？-8(^11-20848、1]24?丁4-23918、ACTT3-13229舍去，分析剩于10个选定内参基因的mRNA表达稳定性，并将"白色丽人" 品种中最不稳定的3个候选内参基因 CYP T4-25962、ACT-T3-13229、RP T2-23555舍去，分析 剩于10个选定内参基因的mRNA表达稳定性。
[0066] 表6为BestKeeper软件分析选定内参基因在"亚美尼亚"品种中的mRNA表达稳定 性；由表6可知，ACT-TI5077的mRNA表达稳定性最高;表7为BestKeeper软件分析选定内参基 因在"白色丽人"品种中的mRNA表达稳定性，RP T2-31202、18ST1-15917、RP T2-23555、EF-1T4-17127、ACT-TI 5077均较呈现较高的mRNA表达稳定性。
[0067] 根据NormFinder分析可得（表2,表4)，CYP T4-25962，ACT-TI5077在"亚美尼亚"品 种不同花期中表达最为稳定，为最适内参基因，其次表现较好的是ACT和1^12-23555 4?_ 1T4-17127，RP T2-26100。而EF-1T4-17127，18ST1-15917在"白色丽人"品种不同花期中表 达最为稳定，为合适内参基因，其次表现较好的是ACT-TI 5077，F-B0XTI-20848，U2AFT4-23918〇
[0068] 综合分析三个软件的结果，"亚美尼亚"品种中三个软件分析结果较为一致，推荐 使用ACT-TI 5077作为最佳内参基因；"白色丽人"品种中Genorm和NormFinder两个软件分 析的结果较为一致，推荐使用ACT-T15077作为最佳内参基因。综合评价得出ACT-TI 5077为 最佳内参基因。
[0069] 对内参基因 ACT-Tl 5077在"亚美尼亚"和"白色丽人"两个不同品种，以及各品种 的不同花发育时期mRNA相对表达量进行分析，结果如图3和图4所示，图3是本发明的内参基 因 ACT-T1 5077在"亚美尼亚"品种的不同花发育时期的mRNA相对表达量，图4是本发明的内 参基因 ACT-T1 5 0 7 7在"白色丽人"品种的不同花发育时期的mRNA相对表达量，结果表明， ACT-Tl 5077在葡萄凤信子不同品种和花发育不同阶段中的表达量均不存在显著差异，是 检测葡萄风信子mRNA表达水平的理想内参基因。
[0070] 本发明利用葡萄风信子花瓣转录组数据库快速筛选稳定表达的候选基因，根据基 因序列片段设计特异引物。利用qRT-PCR技术检测候选基因在葡萄风信子不同品种和花发 育不同阶段中的表达量，通过统计分析确定该基因在葡萄风信子中的mRNA表达稳定性。本 发明提供的ACT-Tl 5077内参基因为准确检测葡萄风信子基因 mRNA表达量提供序列信息和 分子工具。
[0071] 在葡萄风信子qRT-PCR检测中，应用本发明的特异引物对ACT T1-5077-S-2可获得 高度稳定表达的内参，从而避免了由内参基因 mRNA表达稳定性差造成的葡萄风信子基因 mRNA表达定量检测精确度低的问题。
[0072] 表4NormFinder软件分析候选内参基因在"亚美尼亚"品种中的mRNA表达稳定性
[0077] 表6BestKeeper软件分析选定内参基因在"亚美尼亚"品种中的mRNA表达稳定性
【主权项】
1. 一种用于检测葡萄风信子基因转录表达的内参基因，其特征在于，所述内参基因的 核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。2. 如权利要求1所述的内参基因在葡萄风信子总RNA的qRT-PCR检测中的应用。3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述内参基因在葡萄风信子总RNA的qRT-PCR检测中应用时，使用引物对ACT-T1 5077-S-2,并且所述引物对ACT-T1 5077-S-2包括上 游弓丨物5' -aacattcagaaagagtccaccc-3' 和下游弓丨物5' -gcttaccagcaaagatcaaccg-3'。
【文档编号】C12N15/11GK106086165SQ201610365099
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年5月20日
【发明人】刘雅莉, 刘红利, 娄倩
【申请人】西北农林科技大学