一种快速鉴定大黄鱼、小黄鱼及棘头梅童鱼的引物序列及方法
【专利摘要】本发明涉及一种快速鉴定大黄鱼、小黄鱼及棘头梅童鱼的引物序列及方法。引物序列为：1F:5’?GGAAAGAGCCAGGAAAGC?3’；1R:5’?GGCGGAACTCTGAGCAAA?3’。方法包括：(1)个体基因组DNA的提取；(2)序列扩增的特异性引物合成与PCR扩增；(3)取PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测、拍照及记录，根据扩增产物的不同迁移距离获得3种鱼各自的特异性DNA片段图谱，参照附图进行判别。本发明能简单、准确区分出3种鱼的个体样品，为外形相近3种经济鱼类的种质鉴定提供一种新型快速研究方法。
【专利说明】
一种快速鉴定大黄鱼、小黄鱼及棘头梅童鱼的引物序列及 方法
技术领域
[0001] 本发明属于分子标记鉴定领域，特别涉及一种快速鉴定大黄鱼、小黄鱼及棘头梅 童鱼的引物序列及方法。
【背景技术】
[0002] 大黄鱼（Pseudosciaena crocea Richardson 1846)、隶属鱼卢形目（Perciformes)、 石首鱼科(3(^36111(^6)、黄鱼属(]^11'；[111；[0111：1178)，俗称黄鱼、黄花鱼等，主要分布于我国黄 海南部、东海和南海，为暖温性近海集群洄游鱼类，一般体长20~40cm，最大可达75cm。大黄 鱼含有丰富的蛋白质、微量元素和维生素，具有很高经济价值，曾经为我国四大海产经济鱼 类之一。
[0003] 小黄鱼（Lar imi chthy s po Iyac t i s )味道鲜美，棘头梅童鱼（Co 11 i chthy s Iucidus，俗称梅童鱼）肉嫩刺软，这两种营养丰富的鱼类也隶属f卢形目（Perciformes)、石 首鱼科(Sciaenidae)，为近海底层结群性洄游鱼类，栖息于泥质或泥沙底质的近海区，均于 东海、黄海有较大产量，也为主要经济鱼类之一。
[0004] 目前，由于自然资源急剧下降，野生大黄鱼极为稀少，市场所销售的绝大部分为人 工养殖产品；而小黄鱼及梅童鱼多为野生产品，个体大者价格较高。个体较小的人工养殖大 黄鱼，单凭外观不易与小黄鱼、棘头梅童鱼等区分，在养殖、生产及销售中会引起混淆，因 此，建立一套快速、有效的种质检测技术十分必要。
[0005] 分子遗传标记在鱼类种质资源保护与应用研究领域正发挥着越来越重要作用，可 以快速、高效和灵敏地检测出基因组DNA的多态性，是当前用于分析水产生物种质鉴定与群 体遗传特性的主要标记。利用电泳图谱分析技术，以条带的扩增情况来反映物种的特异遗 传信息，操作方法简单、结果分析方便。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题是提供一种快速鉴定大黄鱼、小黄鱼及棘头梅童鱼的 引物序列及方法，该方法无需经测序等复杂步骤，经适宜的PCR扩增后，能快速准确区分出3 种鱼类个体样品，为3种外形相近、价格不同的经济鱼类的种质鉴定提供一种新的简单、快 捷的鉴定研究方法。
[0007] 本发明为一种快速鉴定大黄鱼、小黄鱼及棘头梅童鱼的引物序列为：
[0008] IF:5 '-GGAAAGAGCCAGGAAAGC-3 '；
[0009] IR:5，-GGCGGAACTCTGAGCAAA-3，。
[0010] 本发明为一种快速鉴定大黄鱼、小黄鱼及棘头梅童鱼的方法，包括：
[0011] (1)提取样品 DNA;
[0012] ⑵采用如权利要求1所述的引物进行PCR扩增;PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检 测，并于紫外成像仪器中观察、拍照及记录，根据电泳图谱结果与DNA片段条带位置对比，大 黄鱼在近750bp处有一特异条带；小黄鱼在近1000 bp处各有一个特异条带;棘头梅童鱼则在 低于500bp(约480bp)处有一个特异条带。
[0013]所述步骤(1)中的样品基因组总DNA在双蒸水中的浓度为1 OOng/μΙ。
[0014] 所述步骤(2)中的PCR扩增反应体系为：10XBuffer 2.5yl，dNTP 0.5yl，Mg2+1.5y I，Taq酶0 · 25μ1，引物各ΙμL，DNA模板ΙμL，dH20 17 · 25μ1 ;PCR扩增反应条件为:94°C预变性 5min 后进入 35 个循环：94°C40sec，58°C40sec，72°C lmin;最后 72°C 延伸 lOmin。
[0015] 所述步骤(2)中的琼脂糖凝胶浓度为1.5%，含0.5μg/ml EB;电泳的具体参数为： 电泳缓冲液为〇. 5 X TBE，电压120(不超过5V/cm)，电泳时间40-60min。
[0016] 所述步骤(2)中，取8yL PCR扩增产物用琼脂糖凝胶电泳检测。
[0017] 本发明是基于分子生物学技术原理建立的种质鉴别新方法。该方法只需要简单的 分子生物学仪器就可以进行操作;不仅可以鉴别大黄鱼与小黄鱼，小黄鱼与棘头梅童鱼，及 大黄鱼与棘头梅童鱼之间的完整个体，还可用于研究鉴别大黄鱼、小黄鱼及棘头梅童鱼的 鱼卵、仔稚幼鱼或成鱼，及其加工冻鲜产品；具有准确快捷、经济实用的特点。
[0018] 本发明通过利用特定基因保守序列而设计的一对标记引物，即可得到3种鱼类各 自的一条特异DNA标记谱带，达到快速鉴别3种鱼类的目的，该鉴定引物特异性明显、鉴别方 法简单快速。
[0019] 有益效果
[0020] (1)本发明设计了一对特异性引物扩增来区分样品，拓宽了包括大黄鱼、小黄鱼及 棘头梅童鱼3种不同鱼类间的种质鉴定技术体系，同时也提供了另一种质分析方法；
[0021] (2)本发明有利于缩短技术周期，提高选择准确性，降低成本，从而快速高效实现 不同种质区分；
[0022] (3)本发明无需经测序等复杂步骤，步骤简单，经适宜的PCR扩增后，能快速准确区 分出3种鱼的个体样品，为3种外形相近、价格不同的经济鱼类的种质鉴定提供一种新的研 究方法。
【附图说明】
[0023]图1为大黄鱼（dl-d8)，小黄鱼（xl-x8)及棘头梅童鱼(ml-m8)三个种类的电泳图 谱。
【具体实施方式】
[0024]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人 员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。
[0025] 实施例1
[0026] (1)样品DNA提取，并定溶于双蒸水（lOOng/ul)溶液中，4°C保存备用。
[0027] (2)PCR扩增条件
[0028]特异引物编号及序列分别为：
[0029]引物IF序列：5 ' -GGAAAGAGCCAGGAAAGC;
[0030] 引物IR序列：5 ' -GGCGGAACTCTGAGCAAA。（根据GenBank中的EST序列进行设计）
[0031] PCR反应总体积为25yL，10XBuffer 2·5μ1，(1ΝΤΡ 0.5以1，]\%2+1.541，了39酶0.2541， 引物各ΙμL(〇. 5mmol/L)，样品DNA模板ΙμL，dH20 17.25μ1。
[0032] PCR 扩增参数为：94°C 预变性 5min 后进入 35 个循环：94°C40sec，58°C40sec，72°C lmin;最后72 °C 延伸 IOmin。
[0033] (3) PCR扩增的电泳检测及图谱分析
[0034]取8yL PCR扩增产物在电泳仪上进行检测，电泳缓冲液为0.5 X TBE，琼脂糖凝胶浓 度为1.5% (含0.5ug/ml EB)，电压不超过5V/cm，电泳l-3h后取出，于紫外成像仪下拍照记 录。
[0035] PCR扩增结果与所附图谱中不同种类的特异DNA片段位置比较，如果从扩增得出电 泳图谱中，在近750bp处有一个特异性条带为大黄鱼;在近1000 bp处有一个特异性条带为小 黄鱼；只在小于500bp处（约480bp)有一个特异性条带为棘头梅童鱼。利用引物扩增得到不 同分子量的差异条带，可以进行3种鱼类样本的鉴定。
【主权项】
1. 一种快速鉴定大黄鱼、小黄鱼及棘头梅童鱼的引物序列，其特征在于：引物序列为： IF:5，-GGAAAGAGCCAGGAAAGC-3，； 1R:5，-GGCGGAACTCTGAGCAAA-3，。2. -种快速鉴定大黄鱼、小黄鱼及棘头梅童鱼的方法，包括： (1) 提取样品DNA; (2) 采用如权利要求1所述的引物进行PCR扩增;PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测， 并于紫外分析仪器中观察、拍照及记录，按电泳结果与DNA片段条带位置对比，大黄鱼在近 750bp处有一特异条带；小黄鱼在近lOOObp处各有一个特异条带；棘头梅童鱼则在低于 500bp处有一个特异条带。3. 根据权利要求2所述的一种快速鉴定大黄鱼、小黄鱼及棘头梅童鱼的方法，其特征在 于:所述步骤(1)中的样品DNA在双蒸水中的浓度为lOOng/μΙ。4. 根据权利要求2所述的一种快速鉴定大黄鱼、小黄鱼及棘头梅童鱼的方法，其特征在 于:所述步骤(2)中的PCR扩增中，反应体系为：10 XBuffer 2.5μ1，dNTP 0.5μ1，Mg2+l. 5μ1， Taq酶0.25μ1，引物各ΙμL，样品DNA模板lyl，dH20 17.25μ1;反应条件为:94°C预变性5min后 进入 35 个循环：941€4〇86(3,581€4〇86(3,72°(：1111丨11 ;最后72°(：延伸1〇11^11。5. 根据权利要求2所述的一种快速鉴定大黄鱼、小黄鱼及棘头梅童鱼的方法，其特征在 于:所述步骤(2)中的琼脂糖凝胶浓度为1.5%，含0.5μg/ml EB，琼脂糖凝胶电泳的具体参 数为：电泳缓冲液为〇. 5 X TBE，电压不超过5V/cm，电泳时间40-60min，取8yL PCR扩增产物 用琼脂糖凝胶电泳检测。
【文档编号】C12Q1/68GK106086167SQ201610397814
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月7日
【发明人】陈淑吟, 王思婷, 张志勇, 李鹏, 贾超峰, 祝斐, 尹绍武, 张曹进, 吴国均, 吴磊
【申请人】江苏省海洋水产研究所