用于检测微量组织中egfr基因突变的引物组合及其应用
【专利摘要】本发明公开了一种用于检测微量组织中EGFR基因突变的引物组合，其包括预扩增引物组、用于检测18号外显子突变的引物组、用于检测19号外显子突变的引物组、用于检测20号外显子突变的引物组、用于检测21号外显子突变的引物组；该方法旨在将微量的DNA通过预扩增得到较高浓度的DNA模板，结合直接测序法检测样本中EGFR基因的突变情况；将该引物组合应用于制备检测EGFR基因突变的检测试剂中，可检测样本的DNA浓度低至100pg，且可以同时检测EGFR基因第18、19、20和21号外显子的所有突变，本发明提供的检测方法灵敏度高，特异性强，成本低，适用于临床肿瘤患者EGFR基因突变的检测，具有很好的临床应用价值。
【专利说明】
用于检测微量组织中EGFR基因突变的引物组合及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种用于微量组织中基因突变检 测的引物组合及其在肿瘤用药选择和疾病诊断相关方面的应用。
【背景技术】
[0002] 表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor, )是原癌基因 C-erbB-1 (HER-1)的表达产物，一旦与表皮生长因子(EGiO组合可启动细胞核内的有关基因， 从而促进细胞分裂增殖(Herbst RS，et al. 2008)。
[0003] EGFR是一个巨大的跨膜糖蛋白，分子量约为180Kda，由28个外显子构成，具有配体 诱导的酪氨酸蛋白激酶(Tyrosine kinase，TK)活性，它是erbB这个保守的受体家族的一个 成员，这个家族的其他成员包括HER2/Neu/ErbB2，HER3/ErbB3和HERVErbBLEGFR由胞外 区、跨膜区和胞内区3部分组成。正常情况下，EGFR胞外区与相应配体结合，引起受体二聚 化，形成同源二聚体或与其他家族成员形成异源二聚体。受体二聚体化后构象改变与ATP分 子结合，激活胞内的酪氨酸激酶活性，导致自身磷酸化，启动下游多条信号转导通路，如Ras -Raf-MAPK通路，PI3K-Akt通路，PLC- γ通路，JAK-STAT通路等。通过这些途径，将胞外 信号转化为胞内信号，调节转录因子激活基因的转录，指导细胞迀移、黏附、增殖、分化和凋 亡。这些特点使得EGFR成为具有良好前景的肿瘤诊断和个体化治疗的靶点(Appert-Collin A，et al. 2015)。
[0004] EGFR酪氨酸激酶功能区由18-24号外显子编码，其中18-20号外显子编码N-Iobe， 21-24号外显子编码C-lobe。及;M突变主要集中在编码酪氨酸激酶结构域的18-21号外显 子，包括三种不同突变类型：点突变、缺失突变和插入突变。其中，19号外显子多为缺失突 变，导致19号外显子编码的4个高度保守的氨基酸Leu-Arg-Glu-Ala缺失；18号外显子 G719X，20号外显子T790M以及21号外显子L858R也是比较常见的点突变。临床试验表明， 及?M的突变状态是决定EGFR-TKIs药物(吉非替尼、厄洛替尼等)一线疗效的关键。19号外 显子缺失突变及21号外显子L858R突变对TKIs药物反应良好，被认为是优势突变，约占总突 变的75%-90%，而20号外显子T790M突变的患者则对TKIs药物产生耐药性(Villadolid J， et al. 2015; Huang L, et al. 2015)。于此同时，19号外显子不同的缺失突变的病人对 TKIs的反应疗效也是不同的。对于及;M不突变的病人来说，TKIs的药物疗效很低，甚至无 效(June-Koo Lee, et al. 2014)。因此，FDA现在已经强制要求在选择使用TKIs药物之前 必须进行五^仲基因的突变检测，以利于为这些患者选择最好的治疗方法。
[0005] 目前针对及;M突变的检测方法有很多，如直接测序法，该法对样本要求较高，检 测范围有限。多态性分析法(RFLP)，是将PCR与限制性酶切相结合的一种方法，此实验操作 繁琐，检测周期长，成本高昂，存在第一轮酶切不完全导致的假阳性。Taqman水解探针法，使 用扩增阻滞突变系统(ARMS)与荧光探针结合来检测突变，针对该方法设计的引物，使得突 变型得到扩增，野生型无法扩增，从而增强了突变信号，便于检测。但是ARMS技术应用最后 一个碱基不匹配并不能完全阻滞野生型DNA的扩增，存在假阳性的风险，且只能针对特异性 位点检测。此外，如高效液相色谱、毛细血管电泳等，需要特殊的仪器设备，且操作复杂，不 利于在临床上进行大范围的推广。核酸序列扩增法(NASBA)、自序序列复制法(3SR)和链置 换复制法(SDA)虽均为等温扩增法，但是它们对目的序列的扩增特异性不强。
[0006] 尽管如此，突变的检测方法仍以肿瘤组织标本检测为金标准，但是临床上常 常由于组织样本获取不足量，使其检测具有一定的局限性。因此临床上亟需一种高效准确 全面地检测微量组织中及W基因突变的产品及方法，以便于为肿瘤个性化治疗服务。
[0007] 为此，本发明利用恒温扩增与直接测序相结合的方法，建立了一套针对微量组织 样本中基因所有突变类型检测的技术流程，该检测方法灵敏度高，特异性强，成本低， 有利于临床使用和推广。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于提供一种具有高特异性和灵敏度的检测微量组织样本中 基因突变的引物组合，以组织DNA为检测对象，结合恒温预扩增技术和普通PCR技术，通过直 接测序法确定肿瘤样本中有无及W基因突变，可对及W基因的突变进行准确的检测。
[0009] 本发明提供的引物组合能检测出及;M基因发生在第18、19、20和21号外显子的所 有突变。
[0010] 本发明提供的用于检测抓M基因突变的引物组合包括如SEQ ID NO: I- SEQ ID NO: 18所示的预扩增引物组、如SEQ ID NO: 19- SEQ ID NO:20所示的用于检测18号外显子 突变的引物组、如SEQ ID NO:21- SEQ ID NO: 22所示的用于检测19号外显子突变的引物 组、如SEQ ID N0:23- SEQ ID N0:24所示的用于检测20号外显子突变的引物组、如SEQ ID NO:25- SEQ ID NO:26所示的用于检测21号外显子突变的引物组。
[0011] 本发明的另一目的是将上述引物组合应用在制备检测基因突变的检测试剂 中； 本发明的另一目的是将上述引物组合应用于制备用于检测基因突变的检测试剂 盒中，所述试剂盒组分还包含下列常规组分中的一种或几种:聚合酶、引物组合、PCR反应缓 冲液、dNTP、BSA、去离子水。
[0012] 本发明用于检测基因突变的引物组合的检测使用方法，具体步骤如下： (1)引物稀释 将primerl_primel8分别稀释后混勾制得Primer Mix(表1)，其中primerl_primerl6引 物的终浓度为0 · 05-0 · ΙμΜ，primer 17-primer 18引物的终浓度为 1_3μΜ;primer 19_primer26 引物(表1)稀释至5-10μΜ。
[0013] ⑵预扩增 在扩增管中加入IyL的10X反应缓冲液、2·5yL的Primer Mix、IOO-1000 pg微量DNA模板 (本发明采用的DNA模板来源于肺癌病人组织，并按照《分子克隆实验指南》中所述常规方法 提取组织DNA)、用去离子水补足至8.8yL;混匀，98 °C预变性5-10min，然后置于冰上10-2〇min;再加入0.5yL dNTP (IOmM each)、0.2yL 100XBSA以及0.5yL phi29 DNA聚合酶， 30-35°C扩增过夜，65°C加热10_20min使酶失活。
[0014] (3)使用PCR纯化试剂盒纯化上述预扩增产物。
[0015] (4)及W基因突变检测 针对抓M基因的18-21号外显子突变，分别采用如SEQ ID NO: 19- SEQ ID N0:20所示 的引物组检测18号外显子突变;如SEQ ID N0:21- SEQ ID N0:22所示的引物组检测19号外 显子突变；如SEQ ID NO:23- SEQ ID NO:24所示的引物组检测20号外显子突变；如SEQ ID N0:25- SEQ ID N0:26所示的引物组检测21号外显子突变。
[0016] 配置PCR反应总体系为25yL:其中Pfu Mix混合液12.5yL、所述正向引物（5-10μΜ) 的体积〇.5-lyL、反向引物（5-10μΜ)的体积0.5-lyL、预扩增产物l-2yL、用水补足至25yL。 PCR反应条件为:①94°C，5min预变性;②94°C，30s变性;③55°C，30s退火;④72°C，35s延伸； 循环②至④35次;⑤72 °C，5min;测序检测。
[0017] 本发明的检测优势在于：?本发明采用多引物组合、利用恒温扩增及普通PCR相 结合的方法，解决了组织样本中初始DNA含量低的，无法进行基因突变检测的局限性。 S本发明中使用的试剂价格低廉，可大批量的处理样本。?本发明方法扩增效率高，如 I OOpg的DNA经扩增后可得到1000 ngAxL;可同时检测多位点的突变情况。Φ本发明方法DNA 扩增后DNA忠实性好。总之，使用本发明方法可实现对微量组织样本中的及;M基因的突变 情况进行高效、准确的检测，其对于临床肿瘤早期筛查，指导临床用药，以及监测肿瘤的预 后具有很好的实际应用价值。
[0018] 表1:引物1-26的核苷酸序列
【附图说明】
[0019]图1是本发明针对1000 pg的DNA模板扩增结果;其中A图为预扩增结果(3次重复）;B 图为及沪7?基因18-21号外显子扩增结果； 图2是本发明针对500pg的DNA模板扩增结果;其中A图为预扩增结果(3次重复）;B图为 及沪7?基因18-21号外显子扩增结果； 图3是本发明针对IOOpg的DNA模板扩增结果。A图为预扩增结果(3次重复）;B图为 基因18-21号外显子扩增结果； 图4是本发明针对1000 pg的DNA模板中及;M基因18-21号外显子测序结果图； 图5是本发明针对500pg的DNA模板中及;M基因18-21号外显子测序结果图； 图6是本发明针对IOOpg的DNA模板中及;M基因18-21号外显子测序结果图。
【具体实施方式】
[0020] 下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本 发明而不用于限制本发明的范围，该领域的技术人员可以根据上述本
【发明内容】
对本发明做 出一些非本质的改进和调整。下述实施例中，若非特异表明，所用试剂均为分析纯，所有试 剂均可从商业渠道获得，百分比均为质量百分比。文中未注明具体条件的实验方法，通常按 照《分子克隆实验指南》中所述常规条件，或试剂制造厂商所建议的条件实施。除非另行定 义，文中所使用的所有专业和科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。
[0021] 实施例1: 1000 pg的DNA模板中及W基因突变检测 1、实验材料 phi29 DNA聚合酶，10 Xreaction buffer，dNTP (IOnM)，100 XBSA，1000 pg的 DNA模 板，去离子水，primerl-p;rimel8 (即Primer Mix)，2XPfu Mix，primerl9-p;rimer26，PCR 仪，超薄产物纯化试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司DP203)，1%的琼脂糖凝胶，电泳仪。 [0022] 2、实验步骤及结果 2.1预扩增 (1) 引物稀释 将primerl_primel8分别稀释后混勾形成Primer Mix(表1)，其中primerl_primerl6引 物的终浓度为〇.1以]?4411^^171411^^18引物的终浓度为2以]\1;配置如下体系：
(2) 将上述试剂混匀后，98°C预变性lOmin，然后迅速置于冰上20min; 1 再加入如下体系：
符上还泯贫物泯>」/5，；iU-；ibU5増]3：仪，那热15min使酶失活。铺1%的胶检测（图 1A)。结果显示使用phi29DNA聚合酶对1000 pg的DNA模板扩增效果良好。
[0023] 2.2 PCR产物纯化 (1)柱平衡步骤：向吸附柱CBl中加入500yL的平衡液BL，12，000 rpm (~13，400 X g) 离心I min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中； (2 )估计PCR反应液的体积，向其中加入5倍体积的结合液I1B，充分混匀(无需去除石蜡 油或矿物油）； (3) 将上一步所得溶液加入一个吸附柱CBl中（吸附柱放入收集管中），室温放置2 min， 12,000 rpm(~13,400Xg)离心30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CBl放入收集管中； (4) 向吸附柱CBl中加入600yL漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12， 000 rpm (~13,400Xg)离心30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CBl放入收集管中； (5) 重复操作步骤(4); (6) 12，000 rpm(~13，400 X g)离心2 min，尽量除去漂洗液，将吸附柱置于室温放置数 分钟，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验； (7) 取出吸附柱CBl，放入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加20-50yL洗 脱缓冲液EB，室温放置2 min，12，OOOrpm(~13，400Xg)离心2 min，收集DNA溶液。
[0024] 2.3及?M基因突变检测 (1)配置如下PCR反应体系，分别扩增基因的第18,19,20和21号外显子；
其中针对18号外显子突变的引物如SEQ ID NO: 19- SEQ ID N0:20所示;针对19号外显 子突变的引物如SEQ ID NO:21- SEQ ID NO:22所示；针对20号外显子突变的引物如SEQ ID NO:23- SEQ ID NO:24所示，针对21号外显子突变的引物如SEQ ID NO:25- SEQ ID NO:26 所示。
[0025] (2)反应条件：①94°C，5min预变性；②94°C，30s变性；③55°C，30s退火；④72°C， 35s延伸；循环②至④35次;⑤72 °C，5min; (3)PCR反应结束后，铺1%的胶检测（图IB)，结果显示第二轮PCR对及;M基因的第18， 19,20和21号外显子均出现特异性扩增;然后送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行 测序检测。测序结果如图4所示，及;M基因第18,19和21外显子均未检测到突变，第20号外 显子发生同义突变c. 2361G>A。
[0026] 实施例2:500pg的DNA模板中及基因突变检测 1、实验材料 phi29 DNA聚合酶，10 Xreaction buffer，dNTP (IOnM)，100 XBSA，1000 pg的 DNA模 板，去离子水，primerl-p;rimel8 (即Primer Mix)，2XPfu Mix，primerl9-p;rimer26，PCR 仪，超薄产物纯化试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司DP203)，1%的琼脂糖凝胶，电泳仪。
[0027] 2、实验步骤 2.1预扩增 (1)引物稀释。将primer I-prime 18分别稀释后混勾形成Primer Mix(表1)，其中 口1'；[11161'1-口1'；[11161'16引物的终浓度为0.]^]\1，口1'；[11161'17-口1'；[11161'18引物的终浓度为24]\1。
[0028] 配置如下体系： (2)将上述试剂混匀后，98 °C
预变性5min，然后迅速置于冰上IOmin。
[0029] (3)再加入如下体系：
将上述混合物混习后，30-35 uC扩增过夜，65 uC加热10_20min使酶失活。铺1%的胶检测 (图2A)。结果显示使用phi29DNA聚合酶对500pg的DNA模板扩增效果良好。
[0030] 2.2 PCR产物纯化 (1)柱平衡步骤：向吸附柱CBl中加入500 yL的平衡液BL，12,000 rpm (~13,400 Xg) 离心I min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
[0031] (2)估计PCR反应液的体积，向其中加入5倍体积的结合液I3B，充分混匀(无需去除 石蜡油或矿物油）。
[0032] (3)将上一步所得溶液加入一个吸附柱CBl中（吸附柱放入收集管中），室温放置2 min，12,000 rpm(~13,400 Xg)离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CBl放入收集管 中。
[0033] (4)向吸附柱CBl中加入600 yL漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇）， 12,000 rpm (~13,400\8)离心308扣，倒掉收集管中的废液，将吸附柱081放入收集管中。 [0034] (5)重复操作步骤4。
[0035] (6)12,000 rpm(~13,400Xg)离心2 min，尽量除去漂洗液。将吸附柱置于室温放 置数分钟，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验。
[0036] (7)取出吸附柱CBl，放入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加20-50 yL洗脱缓冲液EB，室温放置2 min，12，OOOrpm(~13，400Xg)离心2 min，收集DNA溶液。
[0037] 2.3及?M基因突变检测 (1)配置如下PCR反应体系，分别扩增及W基因的第18,19,20和21号外显子，
其中针对18号外显子突变的引物如SEQ ID NO: 19- SEQ ID N0:20所示;针对19号外显 子突变的引物如SEQ ID NO:21- SEQ ID NO:22所示；针对20号外显子突变的引物如SEQ ID NO:23- SEQ ID NO:24所示，针对21号外显子突变的引物如SEQ ID NO:25- SEQ ID NO:26 所示。
[0038] (2)反应条件：①94°C，5min预变性；②94°C，30s变性；③55°C，30s退火；④72°C， 35s延伸；循环②至④35次;⑤72 °C，5min; (3)PCR反应结束后，铺1%的胶检测（图2B)，结果显示第二轮PCR对及;M基因的第18， 19,20和21号外显子均出现特异性扩增;然后送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行 测序检测；测序结果如图5所示，及;M基因第18,19和21外显子均未检测到突变，第20号外 显子发生同义突变c. 2361G>A。
[0039] 实施例3: IOOpg的DNA模板中及基因突变检测 1、实验材料 phi29 DNA聚合酶，10 Xreaction buffer，dNTP (IOnM)，100 XBSA，1000 pg的 DNA模 板，去离子水，primerl-p;rimel8 (即Primer Mix)，2XPfu Mix，primerl9-p;rimer26，PCR 仪，超薄产物纯化试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司DP203)，1%的琼脂糖凝胶，电泳仪。
[0040] 2、实验步骤 2.1预扩增 (1) 引物稀释。将primer I-prime 18分别稀释后混勾形成Primer Mix(表1)，其中 primerl_primerl6 引物的终浓度为0·0 5μΜ，primerl7_primerl8 引物的终浓度为 3μΜ。
[0041 ] 配置如下体系：
(2) 将上述试剂混匀后，98 °C预变性8min，然后迅速置于冰上15min。
[0042] (3)再加入如下体系：
将上述混合物混匀后，30-35°C扩增过夜，65°C加热10-20min使酶失活。铺1%的胶检测 (图3A)。结果显示使用phi29DNA聚合酶对IOOpg的DNA模板扩增效果良好。
[0043] 2.2 PCR产物纯化 (1)柱平衡步骤：向吸附柱CBl中加入500 yL的平衡液BL，12,000 rpm (~13,400 Xg) 离心I min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
[0044] (2 )估计PCR反应液的体积，向其中加入5倍体积的结合液I3B，充分混匀(无需去除 石蜡油或矿物油）。
[0045] (3)将上一步所得溶液加入一个吸附柱CBl中（吸附柱放入收集管中），室温放置2 min，12,000 rpm(~13,400 Xg)离心60 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CBl放入收集 管中。
[0046] (4)向吸附柱CBl中加入600 yL漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙 醇），12,000 rpm (~13,400Xg)离心60 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CBl放入收 集管中。
[0047] (5)重复操作步骤4。
[0048] (6)12,000 rpm(~13,400Xg)离心2 min，尽量除去漂洗液。将吸附柱置于室温放 置数分钟，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验。
[0049] (7)取出吸附柱CBl，放入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加20-50 μ L洗脱缓冲液EB，室温放置2 min。12，OOOrpm(~13，400 X g)离心2 min，收集DNA溶液。
[0050] 2.3及?M基因突变检测 (1)配置如下PCR反应体系，分别扩增及W基因的第18,19,20和21号外显子，
其中针对18号外显子突变的引物如SEQ ID NO: 19- SEQ ID N0:20所示;针对19号外显 子突变的引物如SEQ ID NO:21- SEQ ID NO:22所示；针对20号外显子突变的引物如SEQ ID NO:23- SEQ ID NO:24所示，针对21号外显子突变的引物如SEQ ID NO:25- SEQ ID NO:26 所示。
[0051 ] (2)反应条件：①94°C，5min预变性；②94°C，30s变性；③55°C，30s退火；④72°C， 35s延伸；循环②至④35次;⑤72 °C，5min; (3)PCR反应结束后，铺1%的胶检测（图3B)，结果显示第二轮PCR对及;M基因的第18， 19,20和21号外显子均出现特异性扩增;然后送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行 测序检测；测序结果如图6所示，及;M基因第18,19和21外显子均未检测到突变，第20号外 显子发生同义突变c. 2361G>A。
[0052]以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技 术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修 改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 用于检测微量组织中及?Μ基因突变的引物组合，其特征在于，包括如SEQ ID N0:1-SEQ ID NO: 18所示的预扩增引物组、如SEQ ID NO: 19- SEQ ID NO:20所示的用于检测18号 外显子突变的引物组、如SEQ ID NO:21- SEQ ID NO:22所示的用于检测19号外显子突变的 引物组、如SEQ ID NO:23- SEQ ID NO:24所示的用于检测20号外显子突变的引物组、如SEQ ID NO:25- SEQ ID NO:26所示的用于检测21号外显子突变的引物组。2. 权利要求1所述的引物组合在制备检测基因突变的检测试剂中的应用。3. 权利要求1所述的引物组合在制备检测基因突变的检测试剂盒中的应用。
【文档编号】C12N15/11GK106086169SQ201610417807
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月15日 公开号201610417807.4, CN 106086169 A, CN 106086169A, CN 201610417807, CN-A-106086169, CN106086169 A, CN106086169A, CN201610417807, CN201610417807.4
【发明人】盛苗苗, 罗瑛, 唐文如, 张继虹, 贾舒婷, 吴晓明, 刘静, 周若宇, 旦菊花
【申请人】昆明理工大学