一种抑制肿瘤细胞增殖的药物筛选方法
【专利摘要】本发明公开了一种抑制肿瘤细胞增殖的药物筛选方法，包括以下步骤：以端粒酶活性为作用靶点筛选抗肿瘤药物；应用快速荧光素测定法筛选抗肿瘤药物；应用结晶紫染色测定法筛选抗肿瘤药物；应用噬菌体筛选抗肿瘤药物；本发明所提供的这种筛选方法优势有两点：其一是多种细胞株初筛有可能筛选出对特殊的人类肿瘤或对特殊组织亚型有活性的物质；其二是这种体外筛选尤其适合于复杂天然产物提取物中有效成分的证实，过去动物筛选需较大量的天然产物，而现在天然产物的需要量就大大减少，可以指导有效成分的进一步分离纯化，使得从天然产物中发现新的抗肿瘤药物更加便利。
【专利说明】
一种抑制肿瘤细胞増殖的药物筛选方法
技术领域
[0001]本发明涉及药物筛选技术领域，尤其涉及一种抑制肿瘤细胞增殖的药物筛选方法。
【背景技术】
[0002]药物筛选是现代药物开发流程中检验和获取具有特定生理活性化合物的一个步骤，系指通过规范化的实验手段从大量化合物或新化合物中选择对某一特定作用靶点具有较高活性化合物的过程。是临床新药开发的必经过程。
[0003]—个新药从研发到临床使用历时十年以上，耗资10亿美金。平均而言，每一百万个化合物中最终能被FDA批准上市的只有一个，而上市的药物中，也只有30 %的药物能够获得的利润，收回其研发成本。制药公司年收入的20%用在新药的研发上，全球每年在新药上的投资超过300亿美金。在先导化合物的后续筛选过程中，40%到60%的先导化合物在后续的ADME/T (药物吸收、分布、代谢、分泌和毒性检测)中被淘汰。72 %的药物研发费用被浪费在:日益增长的临床耗费、体内无法预测的调控环境以及药物的副作用方面。因此，选出优良品质的先导化合物是药物筛选的一个至关重要的过程。各制药公司在药物开发的早期都会收集尽可能多的关于靶点、待测化合物性质、以及现有筛选方法手段优劣性的信息，以确保尽快剔出阴性化合物，拿到优良品质的先导化合物，降低药物筛选的成本。
[0004]传统的中药筛选方法包括随机筛选和经验式重复筛选。
[0005]一、随机筛选
[0006]是最经典的药物筛选方式，在历史上曾发挥过重要作用，特别在50?60年代较为变通。它用一种或多种生物试验手段评筛化合物或自然资源。现在应用的许多有效治疗药物都是通过随机筛选得到的。随机筛选典型代表，如利用细菌培养法从自然资源中筛选抗菌素，利用瘤株细胞培养法从多种来源的化学物质中筛选抗癌药物;70年代后利用受体(竞争)结合法随机筛选神经一精神性药物等。
[0007]随机筛选发现新药的机率较低，据统计，筛选800个化合物可发现一个有活性化合物，一个投放市场的药物，常需筛选上万个化合物，例如美国国家肿瘤研究所(NCL)每年筛选一万个化合物，连续9年，只有一个成为上市药物。尤其早期(50?60年代)随机筛选常用整体动物试验方法，不但速度慢、所获信息少、耗资巨大，且不能有效地利用化合物资源。因此，随机筛选遭到冷落，新药研制部门，特别是药物产业部门很少依靠随机筛选做为发现新药的主要手段。
[0008]随着筛选技术方法的进步和自动化技术在药物筛选中的应用，特别是90年代以来，组合化学在新药发展研究中确立了重要的地位，随机筛选又逐渐兴起，甚至出现了专门从事随机筛选的公司，例如有的公司(PanLabs)用全细胞、纯化酶、受体或离子通道建立了45种筛方法，从微生物发酵液和其他自然产物中筛选导向化合物。又如英国的Xenova选用30个与疾病有关的靶标，建立筛选方法，从自然资源中筛选免疫、中枢神经系统、癌和心血管系统疾病的治疗药物，每年可完成100万次以上的筛选实验。
[0009]二、经验式重复筛选
[0010]是使用最为广泛的传统的筛选方法。
[0011]这种筛选主要特点是合成筛选紧密配合，经重复性(trial and error)试验过程，根据构效关系(SAR)，不断对化合物进行结构修饰(structural modificat1n)，找到选择性导向或候选化合物。它属于定向合成与筛选，成败的关键在于确定适当的筛选目标和范围，选好靶标(target)和筛选指标。60年代以来，特别是70年代以后，这种筛选在新药发现研究中占主导地位。80年代以来这种筛选方式更强调靶标的选择，提出了基于机制的筛选(mechanism-based screening),即根据疾病性病的分子机制，选择关键革E标，建立相应筛选方法，进行革巴向筛选(targeted screening)。
[0012]基于以前的筛选方法存在较大缺陷，1985年以后研究单位普遍开始采用针对疾病的筛选方法来代替针对化合物的筛选方法，即体外代表各种常见实体瘤的人类肿瘤细胞株筛选。
【发明内容】
[0013]本发明所提供的这种筛选方法优势有两点:其一是多种细胞株初筛有可能筛选出对特殊的人类肿瘤或对特殊组织亚型有活性的物质;其二是这种体外筛选尤其适合于复杂天然产物提取物中有效成分的证实，过去动物筛选需较大量的天然产物，而现在天然产物的需要量就大大减少，可以指导有效成分的进一步分离纯化，使得从天然产物中发现新的抗肿瘤药物更加便利。
[0014]为此，本发明所采取的技术方案是:一种抑制肿瘤细胞增殖的药物筛选方法，包括以下步骤:
[0015]步骤一:以端粒酶活性为作用靶点筛选抗肿瘤药物；
[0016]步骤二:应用快速荧光素测定法筛选抗肿瘤药物；
[0017]步骤三:应用结晶紫染色测定法筛选抗肿瘤药物；
[0018]步骤四:应用噬菌体筛选抗肿瘤药物。
[0019]进一步地，所述步骤一还包括以下步骤:
[0020]端粒酶产物的扩增；
[0021 ]聚丙烯酰胺凝胶电泳分析扩增产物；
[0022]用12%丙烯酰胺灌胶，胶聚合后，取扩增产物1025微升加入加样孔，以180V的电压进行电泳2小时；
[0023]银染显色；
[0024]10%的乙醇和0.5%冰醋酸固定聚丙烯凝胶35分钟，然后加入浓度为0.2%的硝酸银溶液，在37摄氏度水浴上振荡染色5分钟，用超纯水洗涤三次，加入显色液直至DNA条带出现；
[0025]结果判断。
[0026]用PCR扩增产物间接反映端粒酶活性，即在DNA条带中显示出6bp的梯状条带，则判断端粒酶活性为阳性。
[0027]进一步地，所述步骤二还包括以下步骤:
[0028]细胞培养；
[0029]药物敏感性实验；
[0030]荧光素测定。
[0031]进一步地，所述步骤三还包括以下步骤:
[0032]细胞培养；
[0033]药物敏感性实验；
[0034]结晶紫染色测定。
[0035]进一步地，所述步骤四使用的方法是双层琼脂平板-纸片法，即两层琼脂分别铺于平皿底部和上层，用无菌圆形滤纸片一片，沾取待筛药物浸膏贴于平板上，于37摄氏度培养，24小时候观察结果，阳性结果:溶原性细菌释放多量成熟的噬菌体，浸入指示菌体内繁殖，而使得指示菌裂解，在滤纸片周围出现密集的噬斑，阴性结果，滤纸片周围与背景相同。
[0036]本发明的有益效果是:本发明所提供的这种筛选方法优势有两点:其一是多种细胞株初筛有可能筛选出对特殊的人类肿瘤或对特殊组织亚型有活性的物质;其二是这种体外筛选尤其适合于复杂天然产物提取物中有效成分的证实，过去动物筛选需较大量的天然产物，而现在天然产物的需要量就大大减少，可以指导有效成分的进一步分离纯化，使得从天然产物中发现新的抗肿瘤药物更加便利。
【具体实施方式】
[0037]是本发明提供的一种抑制肿瘤细胞增殖的药物筛选方法，包括以下步骤:
[0038]步骤一:以端粒酶活性为作用靶点筛选抗肿瘤药物；
[0039]步骤二:应用快速荧光素测定法筛选抗肿瘤药物；
[0040]步骤三:应用结晶紫染色测定法筛选抗肿瘤药物；
[0041 ]步骤四:应用噬菌体筛选抗肿瘤药物；
[0042]据统计，除去抗感染、抗病毒和抗寄生虫类药物以外，制药工业用来做为药物靶向筛选的靶标有417种，包括受体、酶、离子通道等，涉及10个系统的功能。在人类基因组计划完成后这种靶标可增至3000 — 4000个。据统计，人类疾病有30000种，但药物能控制和改善的只有100 —150种。未得到控制和改善的疾病大多数与基因有关，每一种疾病大约涉及5 —10个基因。因此，靶向筛选是新药筛选的一个有发展潜力的重要方向和领域。
[0043]进一步地，所述步骤一还包括以下步骤:
[0044]端粒酶产物的扩增；
[0045]聚丙烯酰胺凝胶电泳分析扩增产物；
[0046]用12%丙烯酰胺灌胶，胶聚合后，取扩增产物1025微升加入加样孔，以180V的电压进行电泳2小时；
[0047]银染显色；
[0048]10%的乙醇和0.5%冰醋酸固定聚丙烯凝胶35分钟，然后加入浓度为0.2%的硝酸银溶液，在37摄氏度水浴上振荡染色5分钟，用超纯水洗涤三次，加入显色液直至DNA条带出现；
[0049]结果判断。
[0050]用PCR扩增产物间接反映端粒酶活性，即在DNA条带中显示出6bp的梯状条带，则判断端粒酶活性为阳性。
[0051]作为本发明技术方案的一大改进，所述步骤二还包括以下步骤:
[0052]细胞培养；
[0053]药物敏感性实验；
[0054]荧光素测定。
[0055]作为本发明技术方案的一大改进，所述步骤三还包括以下步骤:
[0056]细胞培养；
[0057]药物敏感性实验；
[0058]结晶紫染色测定。
[0059]作为本发明技术方案的一大改进，所述步骤四使用的方法是双层琼脂平板-纸片法，即两层琼脂分别铺于平皿底部和上层，用无菌圆形滤纸片一片，沾取待筛药物浸膏贴于平板上，于37摄氏度培养，24小时候观察结果，阳性结果:溶原性细菌释放多量成熟的噬菌体，浸入指示菌体内繁殖，而使得指示菌裂解，在滤纸片周围出现密集的噬斑，阴性结果，滤纸片周围与背景相同。
[0060]本领域普通技术人员可以理解实现上述实施例方法中的全部或部分流程，是可以通过计算机程序来指令相关的硬件来完成，所述的程序可存储于一计算机可读取存储介质中，该程序在执行时，可包括如上述各方法的实施例的流程。其中，所述的存储介质可为磁碟、光盘、只读存储记忆体(Read-Only Memory，ROM)或随机存储记忆体(RandomAccessMemory，RAM)等。
[0061]以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
【主权项】
1.一种抑制肿瘤细胞增殖的药物筛选方法，其特征在于，包括以下步骤: 步骤一:以端粒酶活性为作用靶点筛选抗肿瘤药物； 步骤二:应用快速荧光素测定法筛选抗肿瘤药物； 步骤三:应用结晶紫染色测定法筛选抗肿瘤药物； 步骤四:应用噬菌体筛选抗肿瘤药物。2.如权利要求1所述的一种抑制肿瘤细胞增殖的药物筛选方法，其特征在于，所述步骤一还包括以下步骤: 端粒酶产物的扩增； 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析扩增产物； 用12%丙烯酰胺灌胶，胶聚合后，取扩增产物1025微升加入加样孔，以180V的电压进行电泳2小时； 银染显色； 10%的乙醇和0.5%冰醋酸固定聚丙烯凝胶35分钟，然后加入浓度为0.2%的硝酸银溶液，在37摄氏度水浴上振荡染色5分钟，用超纯水洗涤三次，加入显色液直至DNA条带出现；结果判断； 用PCR扩增产物间接反映端粒酶活性，即在DNA条带中显示出6bp的梯状条带，则判断端粒酶活性为阳性。3.如权利要求1所述的一种抑制肿瘤细胞增殖的药物筛选方法，其特征在于，所述步骤二还包括以下步骤: 细胞培养； 药物敏感性实验； 荧光素测定。4.如权利要求1所述的一种抑制肿瘤细胞增殖的药物筛选方法，其特征在于，所述步骤三还包括以下步骤: 细胞培养； 药物敏感性实验； 结晶紫染色测定。5.如权利要求1所述的一种抑制肿瘤细胞增殖的药物筛选方法，其特征在于，所述步骤四使用的方法是双层琼脂平板-纸片法，即两层琼脂分别铺于平皿底部和上层，用无菌圆形滤纸片一片，沾取待筛药物浸膏贴于平板上，于37摄氏度培养，24小时候观察结果，阳性结果:溶原性细菌释放多量成熟的噬菌体，浸入指示菌体内繁殖，而使得指示菌裂解，在滤纸片周围出现密集的噬斑，阴性结果，滤纸片周围与背景相同。
【文档编号】C12Q1/02GK106086171SQ201610421639
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月15日 公开号201610421639.6, CN 106086171 A, CN 106086171A, CN 201610421639, CN-A-106086171, CN106086171 A, CN106086171A, CN201610421639, CN201610421639.6
【发明人】张湘东, 潘文杰, 葛发欢
【申请人】广州中大南沙科技创新产业园有限公司