一种Haliscomenobacter hydrossis丝状菌群PCR引物和方法
【专利摘要】一种Haliscomenobacter hydrossis丝状菌群PCR试验特异性引物和方法，涉及污水生物处理领域。该特异性引物的序列为正向引物(序列为5’?AATCAGGTTGAGGTAGGC?3’)；反向引物(序列5’?CTTAGCCCCAGTTACTGGTTTT?3’)。PCR反应体系：2倍浓度的Taq PreMix试剂10μl；DNA模板0.5?1μl；正向引物和反向引物(浓度为10μm/L)各0.5?1μl；加灭菌水到总体积20μl。按上述引物、反应体系进行PCR反应，并将扩增产物在1.5％的琼脂糖凝胶电泳中跑胶，得到分离良好的DNA亮条带(图1)。本发明对H.hydrossis丝状菌群特异性高，能够更高效地进行PCR试验，方便后续对其定性和定量分析，同时只需对PCR产物进行单向测序，省去了双向测序及拼接等操作步骤，节省测序费用。
【专利说明】
_种Ha I i scomenobacter hydross i s丝状菌群PGR引物和方法
技术领域
[0001 ] 本发明涉及污水生物处理领域，提供一种Haliscomenobacter hydrossis (H.hydrossis)丝状菌群PCR引物和方法，该引物对H.hydrossis丝状菌群特异性高，能够高 效准确地进行H. hydrossis丝状菌群的PCR试验，可以对后续H. hydrossis丝状菌群进行准 确定性和定量，同时只需对PCR产物进行单向测序，省去了双向测序及后续序列拼接等操作 步骤，节省测序费用。
【背景技术】
[0002] 目前，活性污泥法污水处理厂及活性污泥法工艺时常发生以H.hydrossis丝状菌 引起的污泥膨胀问题。目前对H.hydrossis丝状菌群的鉴定通常采用较早的Eikelboom丝状 菌鉴定方法及荧光原位杂交（FISH)技术。随着PCR和实时定量PCR试验技术的发展，给 H. hydross i s丝状菌群的鉴定及定量提供了新的技术方法。
[0003] 然而，目前针对H. hydrossis丝状菌群进行PCR试验的引物稀少，且现有引物的特 异性不是很高，在进行PCR过程中同时可以扩增大量非目的菌种，对后续的序列分析带来不 便。此外现有H.hydrossis丝状菌的引物PCR产物序列较长，序列测序过程同时需要正向和 反向测序，后期再进行拼接才能完成，测序费用较高。
[0004] 因此，目前缺乏针对H.hydrossis丝状菌群进行PCR试验简便且特异性高的引物和 方法，对H.hydrossis丝状菌群进行高效准确的PCR试验分析，以便对H.hydrossis丝状菌序 列进行简便准确测序分析，以便后期对其菌群进行准确定性和定量。
【发明内容】
[0005] 针对上述研究的不足之处，本发明提供针对H.hydrossis丝状菌群PCR试验特异性 引物和方法，对H.hydrossis丝状菌群特异性高，能够高效地进行H.hydrossis丝状菌群的 PCR试验，同时只需对PCR产物进行单向测序，节省测序费用。
[0006] 1.一种Haliscomenobacter hydrossis丝状菌群PCR引物，其特征在于：
[0007] 正向引物序列为5 ' -AATCAGGTTGAGGTAGGC-3 ' ；
[0008] 反向引物序列为5'-(：7^60：0^67^(^661'1'1'1'-3'。
[0009] 2.包含所述引物的试剂盒。
[0010] 3.使用所述引物进行PCR扩增的方法，其特征在于:包括变性、复性和延伸。
[0011] 聚合酶链式反应方法的反应体系：
[0012] 2倍浓度的Taq PreMix试剂10μ1 ;DNA模板0·5-1μ1;浓度为ΙΟμπι/L的正向引物和浓 度为ΙΟμπι/L的反向引物各0.5-1μ1;加灭菌水到总体积20μ1。
[0013] 聚合酶链式反应的反应程序：
[0014] ①1个循环:温度为94°C时间为2-5min;
[0015] ②30个循环：依次为变性温度94°C，时间20-30s;复性温度50-55°C，时间30s-lmin;延伸温度72°C，时间2min;
[0016] ③1个循环:温度72°C，时间5-10min。
[0017] 与现有引物相比，本发明具有以下优点：
[0018] (1)本发明提供的H.hydrossis丝状菌群PCR试验引物和方法特异性高，能高效地 进行H. hydross i s丝状菌PCR试验。
[0019] (2)本发明提供的H.hydrossis丝状菌群PCR试验特异性引物可以准确地进行后续 H.hydrossis丝状菌群定性及定量分析。
[0020] (3)本发明提供的H.hydrossis丝状菌群引物的理论PCR产物只需进行单向测序分 析，省去了双向测序及拼接等操作步骤，大大节省了测序分析费用。
【附图说明】
[0021] 图1为本发明NCBI数据库中搜索的H.hydrossis丝状菌基因序列
[0022] 图2为本发明特异性引物在NCBI数据库中特异性比对分析结果图 [0023]图3为本发明H.hydrossis丝状菌群PCR产物1.5%琼脂糖凝胶电泳图
【具体实施方式】
[0024]下面结合附图和具体实施方法对本发明作进一步详细说明，本发明提供的 H.hydrossis丝状菌群特异性引物和方法包括以下内容：
[0025] (I )NCBI库里查找H.hydrossis丝状菌序列，图1;
[0026] (2)对H.hydrossis丝状菌群各序列与其他菌序列进行比对分析，选择设计其特异 性引物的模板序列：NR_074420.1、M58790.2和NR_042316.1 (NCBI检索号）；
[0027] (3)根据引物设计的一般原则（引物长度、引物GC含量、引物Tm、引物3'端和5'端注 意事项、引物序列与模板序列组成的相似性、AG值等)进行引物的设计，主要进行设计引物 类型、搜索模式、前后引物搜索范围、产物大小、引物长度等参数设置；
[0028] (4)得到前后引物后分析其有无① Hairpin:引物自身是否会形成发夹结构；② Dimer:同一种引物是否会形成二聚体;③False primiring:引物在待扩增序列中其他位置 是否有配对;④Cross Dimer:正向与反向引物间是否会形成二聚体，同时查看引物各指标 是否符合引物设计原则；
[0029] (5)按需要对设计的引物进行结合位点、酶切位点等相应编辑；
[0030] (6)将得到的引物与作为设计模板的序列输入NCBI库进行引物特异性比对，分析 其结果(图2)，发现此引物对H.hydrossis丝状菌群特异性高。
[0031] (7)准备200μ1离心管，依次加入2倍浓度的Taq PreMix试剂10yl;DNA模板ΙμL;正 向引物和反向引物（ΙΟμπι/L)各0.5μ1;加灭菌水到总体积20μ1;同时用灭菌水代替DNA模板 进行阴性对照试验。
[0032] (8)对PCR仪设定反应程序:①1个循环:温度为94°C时间为2min。②30个循环:依次 为变性温度94°C，时间30s;复性温度51°C，时间40s;延伸温度72°C，时间2min。③1个循环： 温度72°C，时间10min。
[0033] (9)将PCR扩增产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳试验，观察目的DNA条带的分离效果 良好(图3)，进行下一步。
[0034] (10)将目的条带进行凝胶回收和连接转化后送测序公司测序，将测序序列与目的 菌种的DNA序列对比分析，发现与目的菌群序列一致。
[0035]以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和 原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1 . 一种他118(301116110匕&(^61'117(11'08818丝状菌群?〇?引物，其特征在于： 正向引物序列为5 ' -AATCAGGTTGAGGTAGGC-3 ' ； 反向引物序列为5'-(：7^60：0^67^(^661'1'1'1'-3'。2. 包含如权利要求1所述引物的试剂盒。3. 使用如权利要求1所述引物进行PCR扩增的方法，其特征在于：包括变性、复性和延 伸。4. 如权利要求3所述方法，其特征在于： 聚合酶链式反应方法的反应体系： 2倍浓度的Taq PreMix试剂10yl;DNA模板0.5-1μ1;浓度为ΙΟμπι/L的正向引物和浓度为 ΙΟμπι/L的反向引物各0.5-1μ1;加灭菌水到总体积20μ1。5. 如权利要求3所述方法，其特征在于： 聚合酶链式反应的反应程序： ① 1个循环:温度为94°C时间为2-5min; ② 30个循环：依次为变性温度94°C，时间20-30s;复性温度50-55°C，时间30s-lmin;延 伸温度72°C，时间2min; ③ 1个循环:温度72°C，时间5-10min。
【文档编号】C12Q1/68GK106086176SQ201610424199
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月15日 公开号201610424199.X, CN 106086176 A, CN 106086176A, CN 201610424199, CN-A-106086176, CN106086176 A, CN106086176A, CN201610424199, CN201610424199.X
【发明人】焦二龙, 高春娣, 田烨, 李任飞, 樊士信, 彭永臻
【申请人】北京工业大学