基于核酸恒温扩增技术检测汞离子的dna结构探针的制作方法
【专利摘要】基于核酸恒温扩增技术检测汞离子的DNA结构探针，包括含错配位点并能通过核酸杂交构成三重杂交结构的三条DNA结构探针的核酸序列，三重杂交结构特点是：由汞离子触发DNA探针结构杂交形成，在空间上隔了汞离子结合区域与聚合酶识别区域，利用聚合酶的快速聚合作用，在生物硫醇分子破坏汞离子与胸腺嘧啶作用前获得可持续聚合的稳定结构，巧妙的回避了生物硫醇分子的干扰。该方法可有效消除微量汞离子在应用核酸恒温方法检测时由于生物硫醇分子的干扰而造成的损失，在不引入任何试剂的前提下，有效提高痕量汞离子的检测效率，同时进一步提高核酸恒温扩增技术在汞离子检测中的应用。
【专利说明】
基于核酸恒温扩増技术检测汞离子的DNA结构探针
技术领域
[0001]本发明属于生物技术领域汞离子的痕量检测，特别涉及基于核酸恒温扩增技术检测汞离子的DNA结构探针。
技术背景
[0002]重金属离子在环境中具有相当高的稳定性，且难以被微生物降解。它们一旦进入环境，很难被自然修复，而且能够在生态系统中不断富集和传递，即使微量摄入也会产生很大毒性，是生态平衡和人类健康的重大威胁。作为重金属离子污染的典型代表，汞离子在生物组织内积累导致DNA损伤，影响配体-受体的相互作用，破坏免疫系统，引发一系列的疾病，如脑损伤，肾衰竭，各种认知和运动紊乱等。因此，环境中汞离子的定量检测具有重要的研究价值和现实意义。
[0003]传统的检测汞离子检测的方法有原子吸收/发射光谱、色谱层析法、电感耦合等离子体质谱、冷蒸汽原子荧光光谱、高效液相色谱法、阳极溶出伏安法等，但这些方法大多依赖于大型设备，实验成本高，需要专业人员操作，且样品的预处理过程繁琐，这些都制约了这些方法在实际检测中的广泛应用。
[0004]近年来，基于功能化核酸进行检测的方法得到广泛的发展。核酸以其高稳定性，生物相容性，易标记和修饰，成本低，应用广等优点在生物检测和生化分析中发挥越来越重要的作用。Akira Ono等于2004年首次发现并提出汞离子可与胸腺嘧啶碱基上第三个氮原子发生质子取代反应形成稳定的T-Hg2+-T结构。该结构甚至可以取代核酸序列中原有的A-T碱基配对结构，使核酸的二级结构发生重组。这种特殊的配位结构的发现在很大程度上提高汞离子检测的灵敏度和特异性，为重金属检测做出突破性贡献。目前已发展了多种基于该结构的核酸检测汞离子的方法，包括比色、电化学、电化学发光、荧光光谱等检测方法。然而比色法虽然结果肉眼可见但是灵敏度不够高，并且纳米金的合成与准备过程也较为繁琐。而电化学法的灵敏度高但是操作复杂，时间较长，需要配备价格较为昂贵的电化学相关仪器，同时，相关的荧光法由于没有进行放大虽然更加快速和简便，但是比较难以获得令人满意的灵敏度和检测范围。
[0005]核酸恒温扩增技术是近年来发展起来的，能够在恒温条件下迅速扩增出多条寡核苷酸单链。相比于传统扩增技术如PCR，核酸恒温扩增技术不仅具有较高的扩增效率，而且不需要热循环设备，已被越来越多地用于DNA，micr0RNA，以及其它生物活性分子和金属离子的检测。利用核酸恒温扩增技术检测汞离子的方法得到一定发展，相比于传统检测方法，能快速高效地实现汞离子检测。应用核酸恒温扩增技术检测汞离子也得到一定发展。
[0006]应用核酸恒温扩增技术进行信号放大时，常常需要使用工具酶如KlenowFragment聚合酶(KF)。而在现有聚合酶的储存液以及最适反应缓冲液中普遍含有生物硫醇分子如二硫苏糖醇(DTT)、BSA等以保证酶的稳定结构和活性。以往研究表明，生物硫醇分子与汞离子具有很强的亲和作用。生物硫醇分子的存在会与胸腺嘧啶竞争，捕获体系中痕量汞离子，导致汞离子与胸腺嘧啶作用效果降低，造成痕量汞离子的检测灵敏度偏低，影响核酸恒温扩增方法在汞离子检测方面的应用。
【发明内容】
[0007]为了克服上述现有技术存在的缺陷，本发明的目的在于针对核酸恒温扩增过程中聚合酶KF中生物硫醇分子对汞离子检测的影响，提供一种基于核酸恒温扩增技术检测汞离子的DNA结构探针，在错配位点与引物3’末端之间预留了特定长度的双链区，在空间上隔离了汞离子结合区域与聚合酶识别区域。利用聚合酶的快速聚合作用，在生物硫醇分子破坏汞离子与胸腺嘧啶作用前获得可持续聚合的稳定结构，巧妙的回避了生物硫醇分子的干扰，促进了核酸恒温扩增技术在痕量汞离子检测中的广泛应用。
[0008]为了达到上述目的，本发明通过以下技术方案来实现:
[0009]基于核酸恒温扩增技术检测汞离子的DNA结构探针，包括含错配位点并能通过核酸杂交构成三重杂交结构的三条DNA结构探针的核酸序列，其核苷酸序列(5’到3’):
[0010]3-WJ 探针 1AGAGGTAGTAGGTGATAGTCGG[0011 ] 3-WJ 探针 2CCGTCTTTCTCCCCATAT
[0012]3-WJ 模板:TGAGGCTAGAGCGAGCTGAGGCGGATATGGAATACTACCTCTAAA。
[0013]本发明设计含错配位点并能通过核酸杂交构成三重杂交结构的三条DNA结构探针的核酸序列。
[0014]三重杂交结构特点在于由汞离子触发DNA探针结构杂交形成后，即使汞离子被生物硫醇分子捕获，三重杂交结构仍稳定存在，并引发聚合反应。在汞离子触发下，DNA结构探针可形成稳定的三重杂交结构，引发聚合反应;汞离子触发DNA结构探针形成稳定的三重杂交结构后，在聚合酶KF作用下延伸，之后Nt.BbvCI识别并切割延伸序列上的特定位点，产生单链产物1，剩余部分再次在KF作用下聚合，形成第一轮聚合-酶切的循环反应，同时产生大量单链产物I。切割下来的产物I和具有序列特异性且末端荧光标记的分子信标(MB)进行杂交产生荧光信号，同时以MB为模板进行扩增，同时在MB上产生Nt.BbvCI识别并切割延伸序列的特定位点。Nt.BbvCI识别并且切割后，产生单链产物2。产物2可以和MB杂交，产生荧光信号。同时，释放产物2后的剩余MB和产物I的杂交结构再次在聚合酶作用下聚合，形成第二轮聚合-酶切的循环放大，产生大量单链产物2，与MB杂交后，产生放大的荧光信号。
[0015]与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果:
[0016]1.比较传统的汞离子检测方法有原子吸收/发射光谱、色谱层析法、电感耦合等离子体质谱、冷蒸汽原子荧光光谱、高效液相色谱法、阳极溶出伏安法等，但这些方法大多依赖于大型设备，实验成本高，需要专业人员操作，且样品的预处理过程繁琐，这些都制约了这些方法在实际检测中的广泛应用。
[0017]2.现有核酸恒温扩增方法虽然操作简便，但是由于所用聚合酶中普遍含有DTT、BSA等生物硫醇分子，该物质与汞离子具有很强的亲和能力，会干扰痕量汞离子检测，造成灵敏度低，重现性差等问题。本发明针对核酸恒温扩增技术在汞离子检测方面的应用中生物硫醇分子的干扰问题，提出的一种利用DNA结构探针增强核酸恒温扩增技术在汞离子检测中检测效果的方法，在不引入外来试剂的情况下，能有效避免聚合酶中生物硫醇分子的干扰，提高核酸扩增效率，具有重要的应用前景。
【附图说明】
[0018]图1是本发明的反应流程原理示意图。
[0019]图2是本发明所用来表征的核酸恒温扩增方法的信号来源示意图。
[0020]图3比较本发明与现有方法的扩增效果。
【具体实施方式】
[0021]下面结合附图对本发明做详细叙述。
[0022]基于核酸恒温扩增技术检测汞离子的DNA结构探针，包括含错配位点并能通过核酸杂交构成三重杂交结构的三条DNA结构探针的核酸序列，其核苷酸序列(5’到3’):
[0023 ] 3-WJ 探针 IAGAGGTAGTAGGTGATAGTCGG
[0024]3-WJ 探针 2CCGTCTTTCTCCCCATAT
[0025 ] 3-WJ 模板:TGAGGCTAGAGCGAGCTGAGGCGGATATGGAATACTACCTCTAAA。
[0026]本发明的工作原理为:
[0027]将本发明的DNA结构探针利用核酸恒温扩增技术来检测汞离子，步骤如下:
[0028](I)将含错配位点并能通过核酸杂交构成三重杂交结构的三条DNA结构探针的核酸序列按浓度20nM混合，探针结合待测溶液中的20nM汞离子之后可形成可被聚合酶识别的稳定杂交结构；同现有扩增方法比较时，利用错配引物和模板按浓度20nM混合，加入20nM汞离子进行杂交反应；
[0029](2)将结合汞离子之后的核酸杂交结构与扩增底物(1奶1^、狀、财.81^(:1、分子信标、以及扩增反应缓冲液混合反应，反应温度为37°C，反应时间为60min。混合物中各个组分浓度分别为:序列20nM、扩增底物dNTPs 40yM、KF聚合酶0.5U、Nt.BbvCI 4U，扩增反应缓冲液为1mM Tris,75mM KAc11mM Mg(Ac)2，pH=7.9，探针序列形成稳定杂交结构后引发后续核酸恒温扩增反应，并通过MB产生荧光信号；
[0030](3)利用荧光分光光度计检测荧光信号，对荧光信号分析得到待测溶液中汞离子的含量。
[0031]从参照图1可以看出，现有核酸扩增方法为汞离子触发错配引物和模板杂交，进而引发恒温扩增反应。但是，当反应体系中存在聚合酶KF时，KF中自带的DTT会与核酸链竞争结合汞离子，造成错配引物和模板杂交不稳定，不能引发后续聚合反应的正常进行。本发明设计能形成三重杂交结构的特异性DNA探针序列。三重杂交结构的特点是其由汞离子触发DNA探针杂交形成后，即使汞离子被DTT捕获，三重杂交结构仍稳定存在，并引发聚合反应，并可通过恒温扩增实现信号放大。因此，相比于现有检测方法，能提高核酸恒温反应的聚合效率，从而提高痕量汞离子的检测效率。
[0032]参照图2，为了验证本发明增强核酸恒温扩增的效果，选用已有的核酸恒温扩增方法产生荧光信号的强度进行表征。
[0033]汞离子触发DNA结构探针形成稳定的三重杂交结构后，在聚合酶KF作用下延伸，之后Nt.BbvCI识别并切割延伸序列上的特定位点，产生单链产物I，剩余部分再次在KF作用下聚合，形成第一轮聚合-酶切的循环反应，同时产生大量单链产物I。切割下来的产物I和具有序列特异性且末端焚光标记的分子信标(MB)进行杂交产生焚光信号，同时以MB为模板进行扩增，同时在MB上产生Nt.BbvCI识别并切割延伸序列的特定位点。财.BbvCI识别并且切割后，产生单链产物2。产物2可以和MB杂交，产生荧光信号。同时，释放产物2后的剩余MB和产物I的杂交结构再次在聚合酶作用下聚合，形成第二轮聚合-酶切的循环放大，产生大量单链产物2，与MB杂交后，形成信号的级联放大。
[0034]参照图3，比较了本发明所提出的DNA结构探针与现有错配引物与模板杂交结构在结合核酸恒温扩增技术进行放大检测时，荧光信号的差异。
[0035]现有错配引物与模板杂交结构构成:
[0036]错配引物:TAGAGGTT
[0037]模板:TGAGGCTAGAGCGAGCTGAGGCGGATATGGAATACTACCTCTAAA
[0038]曲线a、b为汞离子触发错配引物和模板杂交并结合上述核酸恒温扩增方法产生的信号和背景荧光光谱。曲线c、d表示由汞离子触发DNA探针形成三重杂交结构，同样结合后续核酸恒温扩增产生的信号和背景的荧光光谱。插图为放大的a、b、c所对应的荧光光谱图。从图中可以看出，现有由引物和模板杂交再进行扩增的方法，信号和背景均很低，表明对痕量汞离子的检测效率很低。而基于DNA探针结构的恒温扩增方法，信号和背景具有很大的差异，表明体系中确实存在影响汞离子与核酸链稳定结合的干扰因素，并且三重杂交结构确实可以明显增强核酸恒温扩增技术在汞离子检测中的效果，证明DNA结构探针在基于核酸恒温扩增技术检测汞离子方面具有重要应用价值。
【主权项】
1.基于核酸恒温扩增技术检测汞离子的DNA结构探针，其特征在于，包括含错配位点并能通过核酸杂交构成三重杂交结构的三条DNA结构探针的核酸序列，其核苷酸序列(5’到.3，): .3-WJ 探针 1AGAGGTAGTAGGTGATAGTCGG .3-WJ 探针 2CCGTCTTTCTCCCCATAT .3-WJ 模板:TGAGGCTAGAGCGAGCTGAGGCGGATATGGAATACTACCTCTAAA。
【文档编号】C12Q1/68GK106086188SQ201610460403
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月22日
【发明人】赵永席, 赵越, 刘华青, 袁慧, 董绘阳, 白凯, 王芳霞, 杨卫军, 魏帅
【申请人】西安交通大学, 中国烟草总公司陕西省公司