实时荧光pcr技术鉴定转基因大豆das?44406?6品系的引物组和方法
【专利摘要】本发明公开了一种实时荧光PCR技术鉴定转基因大豆DAS?44406?6品系的引物组和方法，方法依次包括下列步骤：（1）待检样品DNA的提取；（2）转基因大豆DAS?44406?6品系来源基因的实时荧光PCR扩增；（3）应用荧光定量PCR仪随机软件，测定扩增曲线的Ct值。本发明通过建立DAS?44406?6特异性检测方法，从而对该品系进行有效的检测和监管，便于转基因标识制度的实施。从而加强对转基因产品的监督，保护消费者的合法权益。
【专利说明】
实时荧光PCR技术鉴定转基因大豆DAS-44406-6品系的引物组和方法
技术领域
[0001 ]本发明涉及一种实时荧光PCR技术鉴定转基因大豆DAS-44406-6品系的引物组和方法，属于转基因产品检测鉴定技术领域。
【背景技术】
[0002]大豆是人类重要的油料作物，富含多种营养物质，可以作为粮食饲料以及营养品的来源，大豆油是中国需求最多的食用油，大豆加工产物豆柏是可以作为饲料添加物，因此大豆在我国粮食与饲料市场占有不可替代的重要地位。从1988年第一株转基因大豆问世至今，现在国际市场上转基因大豆种类可达30余种，囊括抗转基因除草剂、转基因高油酸、低亚麻酸、低棕榈酸、高硬脂酸、高棕榈酸、表达抗癌蛋白及富含脱敏因子等各式各样功能的转基因大豆品种。其中，孟山都公司研发的抗除草剂转基因大豆GTS40-3-2品系在全球近半数国家获得批准进行商业化种植，类似的还有拜尔公司的A2704-12抗除草剂品系等。
[0003]转基因大豆品种DAS-44406-6是美国陶氏益农公司研发的能耐受草铵膦、草甘膦还有2，4-D除草剂3种成分的转基因大豆品系。其中含有的主要外来基因为来源于食酸戴尔福特菌的aad-12基因、来源于玉米的2mepsps基因和来源于绿色产色链霉菌的pat基因。自从2013年加拿大批准转基因种植以来，截止到2015年10月30日，已经先后有美国、日本、阿根廷等国家商业化种植，加拿大、南非、新西兰、澳大利亚、美国、墨西哥、日本、韩国、中国台湾等国家和地区批准用于食品和饲料的食用和加工。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的技术问题是:提供一种实时荧光PCR技术鉴定转基因大豆DAS-44406-6品系的引物组和方法。
[0005 ]为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是:
本发明提供的实时荧光PCR技术鉴定转基因大豆DAS-44406-6品系的引物组，引物序列如下:
上游引物DAS-44406-6 primerF:5，_ cgtacaatattactcaccggatcct _3，，
下游引物DAS-44406-6 primerR:5，_ tggtttggttcgaatttgttttac -‘3，
探针DAS-44406_6Probe: 5，-FAM- tcatgggccgcgattaaaaatctcaatta -3，BHQ0
[0006]本发明还提供一种实时荧光PCR技术鉴定转基因大豆DAS-44406-6品系的方法，依次包括下列步骤:
(I)待检样品DNA的提取 DNA提取使用CTAB法；
(2 )转基因大豆DAS-44406-6品系来源基因的实时荧光PCR扩增
A.在装有24tiLPCR扩增反应液A的反应管中加入IyL待检样品DNA，混匀；
B.将PCR反应管放入荧光PCR仪，按下述反应条件完成PCR扩增: 95 °C 15min，I个循环预变性；
95°C 15sec,59°C Imin，40个循环。
[0007](3)应用荧光定量PCR仪随机软件，测定扩增曲线的Ct值；
有PCR扩增曲线且Ct值<38判定为检出，无PCR扩增曲线或者PCR扩增曲线但有Ct值>38判定为未检出；
其中所述的PCR扩增反应液A包括I X PCR Master Mix(内含热启动的Taq DNA聚合酶、氯化镁、dNTP),400 nmol/L上下游引物、200nmoI/L探针；
其中dNTP内的四种脱氧核糖核酸的混合物的质量比为dTTP: dATP: dGTP: dCTP = 1:1:1:1；
本发明的有益效果:
本发明通过建立DAS-44406-6特异性检测方法，其优点是快速、特异性强、灵敏度高、操作简便、成本低。该方法可以对该品系进行有效的检测和监管，便于转基因标识制度的实施。从而加强对转基因产品的监督，保护消费者的合法权益。
【附图说明】
[0008]下面结合附图对本发明的【具体实施方式】作进一步详细的说明。
[0009]图1是转基因品系DAS-44406-6大豆粉的荧光PCR图谱。
[0010]图2是50%浓度转基因品系DAS-44406-6大豆粉的荧光PCR图谱。
[0011]图3是转基因品系DAS-44406-6大豆粉浓度梯度样品的荧光PCR图谱。
【具体实施方式】
[0012]实施例1
本实施例提供了一种实时荧光PCR技术鉴定转基因大豆DAS-44406-6品系的方法，依次包括下列步骤:
(I)待检样品DNA的提取 DNA提取使用CTAB法；
(2转基因大豆DAS-44406-6品系来源基因的实时荧光PCR扩增
A.在装有24tiLPCR扩增反应液A的反应管中加入IyL待检样品DNA，混匀；
B.将PCR反应管放入荧光PCR仪，按下述反应条件完成PCR扩增:
95 °C 15min，I个循环预变性；
950C 15sec,59°C Imin，40个循环。
[0013](3)应用荧光定量PCR仪随机软件，测定扩增曲线的Ct值；
有PCR扩增曲线且Ct值<38判定为检出，无PCR扩增曲线或者PCR扩增曲线但有Ct值>38判定为未检出；
其中所述的PCR扩增反应液A包括I X PCR Master Mix(内含热启动的Taq DNA聚合酶、氯化镁、dNTP),400 nmol/L上下游引物、200nmoI/L探针；
其中dNTP内的四种脱氧核糖核酸的混合物的质量比为dTTP: dATP: dGTP: dCTP = 1:1:1:1；
上下游引物、探针序列如下:上游引物DAS-44406-6 primerF:5，_ cgtacaatattactcaccggatcct _3，，
下游引物DAS-44406-6 primerR:5，_ tggtttggttcgaatttgttttac -‘3，
探针DAS-44406_6Probe: 5，-FAM- tcatgggccgcgattaaaaatctcaatta -3，BHQ0
[0014]实施例2
按下述提供的方法检测转基因大豆DAS-44406-6品系的大豆做用作阳性对照。使用98140转基因玉米粉、DAS-40278-9转基因玉米粉、305423转基因大豆粉、M0N87701转基因大豆粉、M0N87708转基因大豆粉、3218转基因大豆粉、PH05转基因大豆粉、AM04转基因大豆粉、非转基因大豆粉、非转基因大豆粉和非转基因玉米粉作为实验的阴性对照:
包括I XPCR Master Mix(内含热启动的Taq DNA聚合酶、氯化镁、dNTP)，400 nmol/L上下游引物；
上游引物Potato DAS-44406-6 primerF(5’-ggtatcaggttctggaataagaccaa_3’ )，下游引物Potato DAS-44406-6 primerR(5 ’-tgtcgtgccagctgcatta-‘ 3)，探针Potato DAS-44406-6 Probe (5，-FAM- cccgcgcgttggccgat-3’ BHQ)。其中上游引物、下游引物和探针比例:2: 2:1;其中dNTP内的四种脱氧核糖核酸的混合物的质量比为dTTP: dATP: dGTP:dCTP = 1:1:1:10
[0015]按照以下程序进行检测:
(I)待测样品DNA的提取
Α.称取经过预处理的待测样本1.00 g至50 mL离心管中。
[0016]B.加入10 mL65°C预热的CTAB提取缓冲液和RNase A酶(使其终浓度为10 yg/mL)，颠倒混匀后于65°C温育30 min，期间颠倒混匀离心管2?3次；12000 g离心10 min，转移ImL上清液至2 mL离心管中。
[0017]C.在离心管中加入与上清液等体积的三氯甲烷中，上下颠倒充分混匀，12000 g离心1 min，转移上清液600 yL至2 mL离心管中。
[0018]D.加入2倍体积CTAB沉淀液，颠倒混勾后，室温静置I h; 12000 g离心10 min，弃去上清液。
[0019]E.向沉淀中加入400 yL氯化钠溶液，使之沉淀溶解，之后转移溶液至1.5 mL离心管。
[0020]F.在溶解液中加入等体积三氯甲烷，颠倒混匀后，12000 g离心10 min，转移上层水相至1.5 mL离心管中。
[0021]G.加入0.6倍体积经4°C预冷的异丙醇，颠倒混匀后，于4°C下静置30 min； 12000g离心10 min，小心弃去上清液。
[0022]H.加入500 yL70%乙醇，震荡离心柱管，12000 g离心10 min，弃去上清液，重复一次，在室温下挥干液体。
[0023]1.加入100 yL TE溶液溶解DNA，4°C保存备用。
[0024](2)待测样品DNA的实时荧光PCR扩增
A.在PCR反应管中加入24tiL PCR反应液A和IyL样品DNA，混匀。
[0025]B.将PCR反应管放入荧光定量PCR仪，按下述反应条件完成PCR扩增:
95 °C 15min，I个循环预变性；
950C 15sec,59°C Imin，40个循环。
[0026](3)应用荧光定量PCR仪随机软件，测定扩增曲线的Ct值。
[0027]转基因大豆DAS-44406-6品系粉末有PCR扩增曲线且Ct值为26.2判定为检出，其他阴性对照无PCR扩增曲线判定为未检出。结果如图1所示。
[0028]实施例3
按下述方法检测转基因大豆DAS-44406-6品系的大豆与等重量的非转基因大豆粉混合均匀做用作阳性对照。使用98140转基因玉米粉、DAS-40278-9转基因玉米粉、305423转基因大豆粉、M0N87701转基因大豆粉、M0N87708转基因大豆粉、3218转基因大豆粉、PH05转基因大豆粉、AM04转基因大豆粉、非转基因大豆粉和非转基因玉米粉作为实验的阴性对照:
包括I XPCR Master Mix(内含热启动的Taq DNA聚合酶、氯化镁、dNTP)，400 nmol/L上下游引物；
上游引物转基因大豆DAS-44406-6 primerF(5’_ cgtacaatattactcaccggatcct -3' ),下游引物DAS-44406-6 primerR(5，_ tggtttggttcgaatttgttttac -‘3)，探针转DAS-44406-6Probe (5，-FAM- tcatgggccgcgattaaaaatctcaatta -3’ BHQ)。其中上游引物、下游引物和探针比例:2: 2:1;其中dNTP内的四种脱氧核糖核酸的混合物的质量比为dTTP:dATP: dGTP: dCTP =
[0029]按照以下程序进行检测:
(I)待测样品DNA的提取
A.称取经过预处理的待测样本1.00 g至50 mL离心管中。
[0030]B.加入10 mL65°C预热的CTAB提取缓冲液和RNase A酶(使其终浓度为10 yg/mL)，颠倒混匀后于65°C温育30 min，期间颠倒混匀离心管2?3次；12000 g离心10 min，转移ImL上清液至2 mL离心管中。
[0031]C.在离心管中加入与上清液等体积的三氯甲烷中，上下颠倒充分混匀，12000 g离心1 min，转移上清液600 yL至2 mL离心管中。
[0032]D.加入2倍体积CTAB沉淀液，颠倒混匀后，室温静置I h; 12000 g离心10 min，弃去上清液。
[0033]E.向沉淀中加入400 yL氯化钠溶液，使之沉淀溶解，之后转移溶液至1.5 mL离心管。
[0034]F.在溶解液中加入等体积三氯甲烷，颠倒混匀后，12000 g离心10 min，转移上层水相至1.5 mL离心管中。
[0035]G.加入0.6倍体积经4°C预冷的异丙醇，颠倒混匀后，于4°C下静置30 min； 12000g离心10 min，小心弃去上清液。
[0036]H.加入500 yL70%乙醇，震荡离心柱管，12000 g离心10 min，弃去上清液，重复一次，在室温下挥干液体。
[0037]1.加入100 yL TE溶液溶解DNA，4°C保存备用。
[0038](2)待测样品DNA的实时荧光PCR扩增
A.在PCR反应管中加入24tiL PCR反应液A和IyL样品DNA，混匀。
[0039]B.将PCR反应管放入荧光定量PCR仪，按下述反应条件完成PCR扩增:
95 °C 15min，I个循环预变性；
950C 15sec,59°C Imin，40个循环。
[0040](3)应用荧光定量PCR仪随机软件，测定扩增曲线的Ct值。
[0041 ]转基因大豆DAS-44406-6品淀粉有PCR扩增曲线且Ct值为25.2判定为检出，其他阴性对照无PCR扩增曲线判定为未检出。结果如图2所示。
[0042]实施例4
按下述方法检测转基因大豆DAS-44406-6品系的大豆，核酸提取后稀释成为195，19.5, 1.95, 0.195, 0.0195 和 0.00195 ng/yL 的浓度梯度，分别对应 226000，22600，2260，226，22.6，2.26基因组拷贝数/yL。每个浓度梯度做3个PCR平行孔。
[0043]包括I XPCR Master Mix(内含热启动的Taq DNA聚合酶、氯化镁、dNTP)，400nmol/L上下游引物；
上游引物转基因大豆DAS-44406-6 primerF(5’_ cgtacaatattactcaccggatcct -3' ),下游引物DAS-44406-6 primerR(5，_ tggtttggttcgaatttgttttac -‘3)，探针转DAS-44406-6Probe (5，-FAM- tcatgggccgcgattaaaaatctcaatta -3’ BHQ)。其中上游引物、下游引物和探针比例:2: 2:1;其中dNTP内的四种脱氧核糖核酸的混合物的质量比为dTTP:dATP: dGTP: dCTP =
[0044]按照以下程序进行检测:
(I)待测样品DNA的提取
A.称取经过预处理的待测样本1.00 g至50 mL离心管中。
[0045]B.加入10 mL65°C预热的CTAB提取缓冲液和RNase A酶(使其终浓度为10 yg/mL)，颠倒混匀后于65°C温育30 min，期间颠倒混匀离心管2?3次；12000 g离心10 min，转移ImL上清液至2 mL离心管中。
[0046]C.在离心管中加入与上清液等体积的三氯甲烷中，上下颠倒充分混匀，12000 g离心1 min，转移上清液600 yL至2 mL离心管中。
[0047]D.加入2倍体积CTAB沉淀液，颠倒混匀后，室温静置I h; 12000 g离心10 min，弃去上清液。
[0048]E.向沉淀中加入400 yL氯化钠溶液，使之沉淀溶解，之后转移溶液至1.5 mL离心管。
[0049]F.在溶解液中加入等体积三氯甲烷，颠倒混匀后，12000 g离心10 min，转移上层水相至1.5 mL离心管中。
[0050]G.加入0.6倍体积经4°C预冷的异丙醇，颠倒混匀后，于4°C下静置30 min； 12000g离心10 min，小心弃去上清液。
[0051 ] H.加入500 yL70%乙醇，震荡离心柱管，12000 g离心10 min，弃去上清液，重复一次，在室温下挥干液体。
[0052]1.加入100 yL TE溶液溶解DNA，4°C保存备用。
[0053](2)待测样品DNA的实时荧光PCR扩增
A.在PCR反应管中加入24tiL PCR反应液A和IyL样品DNA，混匀。
[0054]B.将PCR反应管放入荧光定量PCR仪，按下述反应条件完成PCR扩增:
95 °C 15min，I个循环预变性；
950C 15sec,59°C Imin，40个循环。
[0055](3)应用荧光定量PCR仪随机软件，测定扩增曲线的Ct值。
[0056]转基因大豆DAS-44406-6品系粉末195 ng/yL浓度梯度的PCR扩增曲线且Ct值为25.3。最低检出的浓度为0.02 ng，相当于23个DAS-44406-6转基因大豆基因组拷贝数。结果如图3所不。
【主权项】
1.实时荧光PCR技术鉴定转基因大豆DAS-44406-6品系的引物组，其特征在于，引物序列如下: 上游引物DAS-44406-6 primerF:5，- cgtacaatattactcaccggatcct _3，， 下游引物DAS-44406-6 primerR:5，_ tggtttggttcgaatttgttttac -‘3， 探针DAS-44406-6Probe: 5，-FAM- tcatgggccgcgattaaaaatctcaatta _3，BHQ02.实时荧光PCR技术鉴定转基因大豆DAS-44406-6品系的方法，其特征在于，依次包括下列步骤: (1)待检样品DNA的提取 DNA提取使用CTAB法； (2)转基因大豆DAS-44406-6品系来源基因的实时荧光PCR扩增 A.在装有24tiLPCR扩增反应液A的反应管中加入IyL待检样品DNA，混匀； B.将PCR反应管放入荧光PCR仪，按下述反应条件完成PCR扩增: . 95 °C 15min，I个循环预变性； 950C 15sec,59°C Imin，40个循环。 (3)应用荧光定量PCR仪随机软件，测定扩增曲线的Ct值； 有PCR扩增曲线且Ct值彡38判定为检出，无PCR扩增曲线或者PCR扩增曲线但有Ct值>38判定为未检出； 其中所述的PCR扩增反应液A包括I XPCR Master Mix(内含热启动的Taq DNA聚合酶、氯化镁、dNTP),400 nmol/L上下游引物、200nmoI/L探针； 其中dNTP内的四种脱氧核糖核酸的混合物的质量比为dTTP: dATP: dGTP: dCTP = 1:.1:1:1； 所述上下游引物和探针的序列如权利要求1所述。
【文档编号】C12N15/11GK106086194SQ201610481689
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月27日
【发明人】高宏伟, 孙敏, 肖西志, 孙雯娴, 徐洋
【申请人】山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心