一种快速区分4种禽呼吸道病原的多重荧光免疫分析的引物、试剂盒及方法
【专利摘要】本发明公开了一种快速区分4种禽呼吸道病原的多重荧光免疫分析的引物、试剂盒及方法。本发明操作简单，通过PCR获得目标扩增片段，然后将扩增产物、荧光编码微球和链霉亲和素?藻红蛋白进行杂交，然后通过检测仪读取MFI值，分辩不同类型的病毒。本发明方法，能够同时对鸡新城疫病毒、禽流感病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡传染性喉气管炎病毒进行准确检测，而且特异性强，灵敏度高，重复性好。与传统检测方法相比，本发明方法实现了对同一样本中的多种不同目的分子同时进行检测，样本用量少，操作简单、快速，可大大降低检测成本。本发明的灵活性好，可以根据需要在此基础上加减检测病原的种类。
【专利说明】
一种快速区分4种禽呼吸道病原的多重荧光免疫分析的引物、 试剂盒及方法
技术领域
[0001] 本发明属于养殖业的病毒检测领域，具体涉及一种快速区分4种禽呼吸道病原的 引物、试剂盒及方法。
【背景技术】
[0002] 随着市场对禽类的需求不断增多，养禽业得到迅猛的发展，养禽业集约化程度不 断提高，禽呼吸道病原的感染呈逐年上升趋势。禽的呼吸道疾病一直是导致养禽业重大经 济损失的主要因素。鸡的呼吸道疾病经常发生，各种日龄的鸡均可感染甚至导致死亡，成年 鸡产蛋会下降，同时鸡的呼吸道疾病发病率高，容易引起多种疾病的继发感染，所以积极预 防和及时治疗呼吸道疾病有着重大的意义。
[0003] 禽流感病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡新城疫病毒、鸡传染性喉气管炎病毒是重 要的禽呼吸道病原，临床症状和病理变化极为相似，在临床和组织病理学上很难区分。鸡呼 吸道疾病多是混合感染，在临床上容易造成误诊，其鉴别诊断通常需借助实验室诊断技术， 病毒的分离和鉴定、血清学试验、酶联免疫吸附试验以及分子生物学诊断。传统的检测方法 敏感性低，特异性差，不易检测出混合感染，而且操作方法繁琐，不利于疾病的及时诊断治 疗，造成重大的经济损失。
[0004] 随着分子生物学的快速发展，多重PCR已广泛应用于禽病混合感染的鉴别诊断，其 原理是设计能够同时扩增出多种待测病原特定片段大小的多对引物，在PCR反应体系中加 入多对引物，能够对多种病原进行鉴别诊断。多重RT-PCR因其灵敏性、特异性和操作的简单 性被广泛应用于禽病的混合感，但结果判定需要电泳，费时费力，且反应产物容易产生污染 而导致假阳性，而多重PCR是靠片段的大小来区别的，一般到了三重以上，片段大小差别大， 其每种病毒的扩增效率不一样，造成结果存在偏差。荧光定量PCR技术融合了 PCR的多种优 点，通过直接检测PCR反应过程中荧光信号的变化实现对目的分子的定量，不需要电泳检 测，并且整个过程完全闭管式操作，污染机率降低，避免了常规PCR容易造成的假阳性问题。 相对常规PCR，荧光定量PCR在敏感性、特异性与速度等方面具有优势，但在实际应用中，当 样品量非常大时，单重荧光PCR在成本和时间方面就存在一定的劣势，而建立一个多重荧光 PCR方法比单重的要复杂得多，其对试剂和引物的要求更高，同时需要保证不同探针所标记 的荧光基团间无相互干扰，使用的荧光定量PCR仪具有相应的多个检测通道，使实验难度加 大。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种用于快速区分4种禽呼吸道病原的多重荧光免疫分析 引物。
[0006] 本发明的另一个目的在于提供一种快速区分4种禽呼吸道病原的多重荧光免疫分 析的试剂盒。
[0007] 本发明的再一个目的在于提供一种快速区分4种禽呼吸道病原的多重荧光免疫分 析的方法。
[0008] 本发明所采取的技术方案是： 一种快速区分4种禽呼吸道病原的多重荧光免疫分析的引物，所述4种禽呼吸道病原为 鸡新城疫病毒、禽流感病毒、鸡传染性支气管炎病毒和鸡传染性喉气管炎病毒，所述引物核 苷酸序列如下所示： 引物NI: 5 '-CTCATCTCAGACAGGGTCAATC-3 '（ SEQ ID NO: 1)， 引物N2:5'-ATGGAGTCACCAAGGGG-3'（SEQ ID N0:2); 引物A1:5'-ATGAGTCTTCTACCCGAGG-3'（SEQ ID N0:3)， 引物A2:5'-TCAGAGGTGACAGGATTG-3'（SEQ ID N0:4); 引物B1:5'-AATCACGCTCAAGTTCAAGGC-3'（SEQ ID N0:5)， 引物B2:5'-GCATTGTTCCTCTCCTCATC-3'（SEQ ID N0:6); 引物L1:5'-GCAGCGAAAAGAAGGC-3'（SEQ ID N0:7)， 引物L2:5'-TCATCGTGCTCGGTGTCC-3'（SEQ ID N0:8)。
[0009] 进一步的，所述引物NI和N2其中一条引物的5 '端被生物素化； 进一步的，所述引物Al和A2其中一条引物的5'端被生物素化； 进一步的，所述引物Bl和B2其中一条引物的5'端被生物素化； 进一步的，所述引物Ll和L2其中一条引物的5'端被生物素化。
[0010] 进一步的，所述引物Nl和N2、A1和A2、B1和B2、L1和L2中未被生物素化的引物的5' 端连接有tag序列，所述tag序列能与焚光编码微球中带有的anti-tag序列互补配对。
[0011] 进一步的，所述引物Nl和N2、A1和A2、B1和B2、L1和L2这4组引物对中连接的tag序 列选自SEQ ID N0:9~12所示的tag序列，且该4组引物对中连接的tag序列互不相同。
[0012] -种快速区分4种禽呼吸道病原的多重荧光免疫分析的试剂盒，所述4种禽呼吸道 病原为鸡新城疫病毒、禽流感病毒、鸡传染性支气管炎病毒和鸡传染性喉气管炎病毒，该试 剂盒中含有上述任一所述引物。
[0013] 进一步的，上述试剂盒中还含有链霉亲和素-藻红蛋白复合物、4种编码不同荧光 色的荧光编码微球。
[0014] 进一步的，所述荧光编码微球中还含有与引物中tag序列互补配对的anti-tag序 列，编码不同荧光色的荧光编码微球中含有的anti-tag序列互不相同。
[0015] -种快速区分4种禽呼吸道病原的多重荧光免疫分析的方法，所述4种禽呼吸道病 原为鸡新城疫病毒、禽流感病毒、鸡传染性支气管炎病毒和鸡传染性喉气管炎病毒，包括如 下步骤： 1) 从样品中提取RNA; 2) 以提取的RNA为模板，用上述任一所述的引物进行RT-PCR扩增； 3) 将扩增产物、4种编码不同荧光色的荧光编码微球、链霉亲和素-藻红蛋白进行杂交； 4) 杂交结束后，通过Luminex系统对杂交产物进行检测分析，确定病毒的类型； 上述方法用于非疾病的诊断的治疗。
[0016] 进一步的，步骤2)所述RT-PCR扩增的反应体系为： 5 X buffer 4yL dNTP 0.8pL 引物混合液 2nL 酶 0.8yL RNA模板 IyL CldH2O 11.4pL 总体积 20yL。
[0017] 进一步的，步骤2)所述RT-PCR扩增的反应程序为50°C反转录30min;94°C预变性 15min;94°C 变性 30s，60°C 退火 25s，72°C 延伸 20s;循环 35 次；72°C 终延伸 lOmin。
[0018] 本发明的有益效果是： 本发明能够同时对鸡新城疫病毒、禽流感病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡传染性喉气 管炎病毒进行准确检测，而且特异性强，灵敏度高，重复性好。与传统检测方法相比，本发明 方法实现了对同一样本中的多种不同目的分子同时进行检测，样本用量少，操作简单、快 速，可大大降低检测成本。本发明能保证相同的复性温度和杂交效率，且有效避免不同检测 物标记的微球之间交叉杂交。
[0019]
【附图说明】
[0020] 图1是对禽呼吸道4种病原质粒单重、两重、四重PCR扩增产物的电泳检测图；1:PCR 空白对照，M:DL2000 DNA marker，2:对NDV+AIV+IBV+ILTV进行的四重PCR，3:对NDV+AIV进 行的双重PCR，4~7是分别对18￥、11^17^1￥、灿￥进行的单重卩0? ; 图2是对禽呼吸道4种病原质粒单重、两重、四重PCR扩增产物的多重荧光免疫分析方法 检测实验结果图； 图3是禽呼吸道4种病原的多重荧光免疫分析方法检测特异性实验结果图； 图4是禽呼吸道4种病原的多重荧光免疫分析方法检测灵敏度实验结果图； 图5是禽呼吸道4种病原的多重荧光免疫分析方法临床检测实验结果图。
【具体实施方式】
[0021] -种快速区分4种禽呼吸道病原的多重荧光免疫分析的引物，所述4种禽呼吸道病 原为鸡新城疫病毒、禽流感病毒、鸡传染性支气管炎病毒和鸡传染性喉气管炎病毒，所述引 物核苷酸序列如下所示： 引物NI: 5 '-CTCATCTCAGACAGGGTCAATC-3 '（ SEQ ID NO: 1)， 引物N2:5'-ATGGAGTCACCAAGGGG-3'（SEQ ID N0:2); 引物A1:5'-ATGAGTCTTCTACCCGAGG-3'（SEQ ID N0:3)， 引物A2:5'-TCAGAGGTGACAGGATTG-3'（SEQ ID N0:4); 引物B1:5'-AATCACGCTCAAGTTCAAGGC-3'（SEQ ID N0:5)， 引物B2:5'-GCATTGTTCCTCTCCTCATC-3'（SEQ ID N0:6); 引物L1:5'-GCAGCGAAAAGAAGGC-3'（SEQ ID N0:7)， 引物L2:5'-TCATCGTGCTCGGTGTCC-3'（SEQ ID N0:8)。
[0022] 优选的，所述引物NI和N2其中一条引物的5'端被生物素化； 优选的，所述引物A1和A2其中一条引物的5 '端被生物素化； 优选的，所述引物B1和B2其中一条引物的5 '端被生物素化； 优选的，所述引物Ll和L2其中一条引物的5'端被生物素化。
[0023] 优选的，所述引物Nl和N2、A1和A2、B1和B2、L1和L2中未被生物素化的引物的5'端 连接有tag序列，所述tag序列能与焚光编码微球中带有的anti-tag序列互补配对。
[0024] 优选的，所述引物Nl和N2、A1和A2、B1和B2、L1和L2这4组引物对中连接的tag序列 选自SEQ ID N0:9~12所示的tag序列，且该4组引物对中连接的tag序列互不相同。
[0025] -种快速区分4种禽呼吸道病原的多重荧光免疫分析的试剂盒，所述4种禽呼吸道 病原为鸡新城疫病毒、禽流感病毒、鸡传染性支气管炎病毒和鸡传染性喉气管炎病毒，该试 剂盒中含有上述任一所述引物。
[0026] 优选的，上述试剂盒中还含有链霉亲和素-藻红蛋白复合物、4种编码不同荧光色 的荧光编码微球。
[0027]优选的，所述荧光编码微球中还含有与引物中tag序列互补配对的anti-tag序列， 编码不同荧光色的荧光编码微球中含有的anti-tag序列互不相同。
[0028] -种快速区分4种禽呼吸道病原的多重荧光免疫分析的方法，所述4种禽呼吸道病 原为鸡新城疫病毒、禽流感病毒、鸡传染性支气管炎病毒和鸡传染性喉气管炎病毒，包括如 下步骤： 1) 从样品中提取RNA; 2) 以提取的RNA为模板，用上述任一所述的引物进行RT-PCR扩增； 3) 将扩增产物、4种编码不同荧光色的荧光编码微球、链霉亲和素-藻红蛋白进行杂交； 4) 杂交结束后，通过Luminex系统对杂交产物进行检测分析，确定病毒的类型； 上述方法用于非疾病的诊断的治疗。
[0029]优选的，步骤2)所述RT-PCR扩增的反应体系为： 5 X buffer 4yL dNTP 0.8yL 引物混合液 2nL 酶 0.8yL RNA模板 IyL CldH2O 11.4pL 总体积 20yL。
[0030] 优选的，步骤2)所述RT-PCR扩增的反应程序为50°C反转录30min;94°C预变性 15min;94°C 变性 30s，60°C 退火 25s，72°C 延伸 20s;循环 35 次；72°C 终延伸 lOmin。
[0031] 优选的，步骤3)所述杂交的体系和反应程序为： 4种编码不同荧光色的荧光编码微球 2〇nL 链霉亲和素-藻红蛋白 75tiL 扩增产物 5tiL 总体积 IOOyL， 于37°C反应30min，即可。
[0032] 下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
[0033]实施例1引物 经过对所设计的大量引物进行筛选后，发现引物对Nl和N2、A1和A2、B1和B2、L1和L2对 同时快速区分4种禽呼吸道病原(鸡新城疫病毒、禽流感病毒、鸡传染性支气管炎病毒和鸡 传染性喉气管炎病毒)的效果最好，其碱基序列如下所示。
[0034] N1:5'-CTCATCTCAGACAGGGTCAATC-3'（SEQ ID N0:1)， N2：5，-ATGGAGTCACCAAGGGG-3，(SEQ ID NO:2)； A1:5'-ATGAGTCTTCTACCCGAGG-3'（SEQ ID N0:3)， A2：5，-TCAGAGGTGACAGGATTG-3，(SEQ ID NO:4)； B1:5'-AATCACGCTCAAGTTCAAGGC-3'（SEQ ID N0:5)， B2：5，-GCATTGTTCCTCTCCTCATC-3，(SEQ ID NO:6)； L1:5'-GCAGCGAAAAGAAGGC-3'（SEQ ID N0:7)， L2:5'-TCATCGTGCTCGGTGTCC-3'（SEQ ID N0:8)。
[0035] 本发明采用多重荧光免疫分析的方法对4种禽呼吸道病原进行区分，故将上述引 物作进一步的修饰，以满足相应的操作要求。其中引物NI、A1、B1和Ll的5'端连接有tag序 列，所连接的tag序列分别为： 引物Nl的tag序列为：5'-ACTTATTTCTTCACTACTATATCA-3'（SEQIDN0:9) ; 引物Al的tag序列为：5'-TACTACTTCTATAACTCACTTAAA-3'（SEQ ID N0:10); 引物BI的tag序列为：5'-ATTAAACAACTCTTAACTACACAA-3'（SEQ ID N0:11); 引物LI的tag序列为：5'-ATCTCAATTACAATAACACACAAA-3'（SEQ ID N0:12); 另外，引物N2、A2、B2和L2的5 '端添加有生物素标记。
[0036] 实施例2用于快速区分4种禽呼吸道病原的多重荧光免疫分析的试剂盒 试剂盒包括以下组分： (1) 实施例1所设计的用于多重荧光免疫分析的引物； (2) 4种编码不同焚光色的包含有anti-tag序列的焚光编码微球，所述anti-tag序列能 相应地与多重焚光免疫分析引物中的tag序列互补配对;4种微球均购自Iuminex公司，其中 鸡新城疫病毒(NDV)、禽流感病毒(AIV)、鸡传染性支气管炎病毒（IBV)和鸡传染性喉气管炎 病毒（ILTV)分别对应的荧光编码微球号为MTAG-A034、MTAG-A029、MTAG-A036和MTAG-A067。 [0037] (3)链霉亲和素-藻红蛋白复合物。
[0038] 实施例3 4种禽呼吸道病原的多重荧光免疫分析方法检测方法的建立 (1)四种禽呼吸道病原质粒的构建 用天根的核酸自动抽取仪分别提取NDV、AIV、IBV、ILTV病原的RNA，分别用引物对Nl和 N2、A1和A2、B1和B2、L1和L2进行RT-PCR扩增，将扩增产物分别进行琼脂糖凝胶电泳检测并 切胶纯化，将纯化后的cDNA分别连接至pMD-19T载体中，将连接产物转化至DH5a感受态细 胞，挑选单克隆，进行菌落PCR鉴定，将鉴定为阳性菌的菌落进行质粒抽提，送测序。
[0039] (2)质粒PCR扩增 用实施例1所述的引物分别对勵￥^1￥、18￥、11^17单重、两重、四重?0財广增。
[0040] 上游引物混合液的制备:将NI、A1、B1和Ll以摩尔比1: 1: 1:1比例进行混合;下游引 物混合液的制备:将N2、A2、B2和L2以摩尔比1: 1: 1:1比例进行混合。利用禽呼吸道四种病原 的特异性模板，以及AIV、NDV两重模板;冊￥^1￥、18￥、11^￥四重模板，对上述四种病毒的特 应性区域进行扩增。其中两重模板的制备:将两两质粒以体积比1:1的比例进行混合，四重 模板的制备:将四种质粒以体积比1:1:1:1的比例进行混合。
[0041 ] PCR扩增皮疝优赛加 T .
扩增的反应程序为：94°C预变性5min;94°C变性3〇8,60°(：退火258,72°(：延伸2〇8;循环 35 次；72 °C 终延伸 IOmin。
[0042]电泳检测结果:将上述PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，其电泳图如图1所示，图 中 I: PCR空白对照，M: DL2000 DNA marker，2:对NDV+AIV+IBV+ILTV进行的四重PCR，3:对NDV +AIV进行的双重PCR，4~7是分别对18￥、11^1^1￥、_￥进行的单重?0?。从图1中可以看出， IBV的扩增产物大小约为162bp，ILTV的扩增产物大小约为141bp，NDV的扩增产物大小约为 155bp，AIV的扩增产物大小约为186bp。但由于这4种病毒的扩增产物大小相近，所以两重、 四重PCR扩增产物的电泳条带无法分辨。
[0043] (3)将所得的PCR产物与荧光编码微球工作液、链霉亲和素藻红蛋白（SA-PE)工作 液进行杂交，包括以下步骤： 分别包被有特异的anti-tag序列的4种微球，其中anti-tag序列能相应地与NDV、AIV、 IBV和ILTV四种病毒引物上的tag序列互补配对。四种微球均购自Iuminex公司，具体的NDV、 八1￥、18￥和11^￥分别对应的荧光编码微球号为阶46-4034、]\^^-4029、]^^6-4036和]\^^-A067〇
[0044] 荧光编码微球工作液的制备：将2500个/μL荧光编码微球用I . I X Tm Hybrdization Buffer稀释到ΙμL约含有125个/种焚光编码微球。
[0045] SA-PE工作液制备：将lmg/ml SA-PE用I XTm Hybrdization Buffer稀释到lOyg/y 1〇
[0046] 充分重悬荧光编码微球工作液，每个样品孔和背景孔加入微球工作液20μ1，样品 孔中加入5μ1 PCR产物，背景孔中加入5μ1 PCR空白对照组产物，再加入75μ1的SA-PE工作 液，充分混匀，于金属加热器中37°C孵育30min。
[0047] 依照检测仪Luminex 200仪器的说明将杂交后的50μ1上述反应液进行检测，结果 如图2所示，图中"NDV+AIV+IBV+ILTV"表示四重PCR结果，"NDV+AIV"表示对NDV+AIV进行的 双重PCR，"IBV"、"ILTV"、"AIV"、"NDV"分别对18￥、11^￥、六1￥、灿￥进行的单重?0?;从图2中可 以看出，虽然两重和四重模板的扩增产物无法用电泳分辨，但用检测仪Luminex 200仪器读 取MFI值时，明显分辩不同类型的病毒。
[0048] 结果判断标准(注:该判断标准仅供参考，亦可对结果判断标准进行调整)如下： 最低检测阈值(cutoff值)的确定:选取10头健康鸡组织样品(每个样品平行重复3次）， 分别读取MFI值并计算其平均值和标准差。以平均值加3倍标准差的MIF值设定其为cutoff 值。本发明所获得cutoff值为465.2，因此将本发明的cutoff值定为500。只有检测样品的 MFI值高于500时，该实验数据才能进行有效分析。
[0049] 待测样本的分析判断：1)当待测样本的MFI值>500时，判断为阳性样本;2)待测样 本的MFI值<500时，判断为阴性，需要进行重复实验或采取其他检测方法进一步验证。
[0050] 实施例4 NDV、AIV、IBV和ILTV的多重荧光免疫分析检测特异性实验 分别用新城疫病毒、禽流感病毒、传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒、传染性 法氏囊病毒、禽白血病病毒、禽呼肠孤病毒和网状内皮增生症病毒作为模板进行多重荧光 免疫分析检测。实验结果如图3所示，只有新城疫病毒、禽流感病毒、传染性支气管炎病毒、 传染性喉气管炎病毒为阳性，其他的均为阴性，说明检测体系特异性良好。
[0051 ] 实施例5: AIV、NDV、IBV、ILTV、MS和MG的多重荧光免疫分析检测灵敏性实验 将制备的质粒进行定量，采用10倍稀释法进行稀释，稀释至lOVopies/ul，用上述建立 的多重荧光免疫分析方法进行检测。NDV、AIV、IBV和ILTV的多重荧光免疫分析检测灵敏性 实验结果如图4所示，实验结果表明，所有的灵敏度检出限为IO 2c0PiesAil。
[0052]实施例6:样品的检测 从鸡场采集的气管、肺、肾、肝样品，用天根核酸自动抽取仪提取RNA，使用Qiagen的RT-PCR kit进行扩增，以RNA作为模板，采用上述NDV、AIV、IBV、ILTV的多重荧光免疫分析检测 方法进行检测，扩增产物与荧光编码微球和SA-PE杂交，在Luminex 200检测仪上读数。具体 步骤参照实施例3,实验结果如图5所示。
[0053] 经普通PCR检测实验结果表明，样品1、3、5、8、12、15、16、21、22、24、25为阴性样品； 样品2、6、11为禽流感病毒(AIV);样品4、7、9、10、14、17、18、19、20、23为传染性喉气管炎病 毒（ILTV);样品13为传染性支气管炎病毒（IBV);样品20为新城疫病毒(NDV)。通过测序分 析，结果一致。
[0054]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种快速区分4种禽呼吸道病原的多重荧光免疫分析的引物，所述4种禽呼吸道病原 为鸡新城疫病毒、禽流感病毒、鸡传染性支气管炎病毒和鸡传染性喉气管炎病毒，其特征在 于，所述引物核苷酸序列如下所示： 引物N1:5'-CTCATCTCAGACAGGGTCAATC-3'（SEQIDN0:1)， 引物N2:5'-ATGGAGTCACCAAGGGG-3'（SEQ ID N0:2); 引物A1:5'-ATGAGTCTTCTACCCGAGG-3'（SEQ ID N0:3)， 引物A2:5 ' -TCAGAGGTGACAGGATTG-3 '（ SEQ ID NO: 4); 引物B1:5'-AATCACGCTCAAGTTCAAGGC-3'（SEQ ID N0:5)， 引物B2:5'-GCATTGTTCCTCTCCTCATC-3'（SEQIDN0:6); 引物L1:5'-GCAGCGAAAAGAAGGC-3'（SEQIDN0:7)， 引物L2:5'-TCATCGTGCTCGGTGTCC-3'（SEQIDN0:8)。2. 根据权利要求1所述的引物，其特征在于： 所述引物N1和N2其中一条引物的5 '端被生物素化； 所述引物A1和A2其中一条引物的5 '端被生物素化； 所述引物B1和B2其中一条引物的5 '端被生物素化； 所述引物L1和L2其中一条引物的5'端被生物素化。3. 根据权利要求1所述的引物，其特征在于:所述引物N1和N2、A1和A2、B1和B2、L1和L2 中未被生物素化的引物的5'端连接有tag序列，所述tag序列能与焚光编码微球中带有的 anti-tag序列互补配对。4. 根据权利要求1所述的引物，其特征在于:所述引物N1和N2、A1和A2、B1和B2、L1和L2 这4组引物对中连接的tag序列选自SEQ ID NO:9~12所示的tag序列，且该4组引物对中连接 的tag序列互不相同。5. -种快速区分4种禽呼吸道病原的多重荧光免疫分析的试剂盒，所述4种禽呼吸道病 原为鸡新城疫病毒、禽流感病毒、鸡传染性支气管炎病毒和鸡传染性喉气管炎病毒，其特征 在于，该试剂盒中含有权利要求1~4任一所述引物。6. 根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒中还含有链霉亲和素-藻红蛋 白复合物、4种编码不同荧光色的荧光编码微球。7. 根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光编码微球中还含有与引物中 tag序列互补配对的anti-tag序列，编码不同焚光色的焚光编码微球中含有的anti-tag序 列互不相同。8. -种快速区分4种禽呼吸道病原的多重荧光免疫分析的方法，所述4种禽呼吸道病原 为鸡新城疫病毒、禽流感病毒、鸡传染性支气管炎病毒和鸡传染性喉气管炎病毒，其特征在 于，包括如下步骤： 1) 从样品中提取RNA; 2) 以提取的RNA为模板，用权利要求1~4任一所述的引物进行RT-PCR扩增； 3) 将扩增产物、4种编码不同荧光色的荧光编码微球、链霉亲和素-藻红蛋白进行杂交； 4) 杂交结束后，通过Luminex系统对杂交产物进行检测分析，确定病毒的类型； 上述方法用于非疾病的诊断的治疗。9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤2)所述RT-PCR扩增的反应体系为： 5. buffer 4yL dNTP 0.8yL 引物混合液 2仙 酶 0.8yL RNA模板 lyL ddH20 11.4pL 总体积 20yL。10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤2)所述RT-PCR扩增的反应程序为50 °C 反转录 30min;94°C 预变性 15min;94°C 变性 30s，60°C 退火 25s，72°C 延伸 20s;循环 35 次；72 。(:终延伸lOmin。
【文档编号】C12Q1/70GK106086241SQ201610573525
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年7月19日
【发明人】郭鹏举, 朱余军, 丛峰, 黄韧, 陈梅丽
【申请人】广东省实验动物监测所