一种高效扩增人类外周血nk细胞的简易装置的制造方法

文档序号:10090278阅读:465来源:国知局
一种高效扩增人类外周血nk细胞的简易装置的制造方法
【技术领域】
[0001]本实用新型属于实验用具领域,尤其是一种高效扩增人类外周血NK细胞的简易
目.ο
【背景技术】
[0002]当前治疗癌症的主流临床手段,如手术、放化疗,尽管可对多种癌症显示不同的治疗效果,但其适用范围仍存在局限。如,手术方法对实体瘤较为有效,但对弥散性癌细胞导致的癌症效果不佳且容易产生手术残留;放化疗可控制弥散性癌症,但对病人身体产生的负担也较大。ΝΚ细胞为非MHCI型分子限制型自然杀伤细胞,无需经历抗原呈递过程即可对多种肿瘤细胞显示杀伤效果。ΝΚ细胞得益于其自然杀伤效果,可作为适用范围很大的辅助治疗手段,用于清除癌症病人体内术后残留或放化疗后残留的癌细胞,减少或避免癌症复发或新的转移灶产生,从而达到改善预后效果的目的。
[0003]传统的ΝΚ细胞培养方法采用的是添加游离的细胞因子的液体培养基中,但由于ΝΚ细胞表面缺少IL — 15R α,其表面表达的IL — 15R β、IL — 15R γ对IL — 15亲和力不强,故此方法无法实现ΝΚ细胞的大量体外扩增。另有ΝΚ细胞培养方法采用经慢病毒转染的Κ562工程细胞系,该细胞系表面可表达⑶137L、IL 一 15、IL 一 15Ra、IL 一 21,通过接触式细胞膜刺激激活NK细胞,达到高倍率扩增的目的,但经慢病毒转染的K562工程细胞本身为癌细胞,需经过辐射灭活才可使用,有潜在的使用风险和技术要求较高、造价高昂等不利限制。为摆脱使用K562工程细胞系的限制而同时保证细胞培养过程中获得足够供给临床使用的NK细胞总量,本发明提供了一种高效扩增人类外周血NK细胞的装置。
【实用新型内容】
[0004]本实用新型的目的在于克服现有技术的不足之处,提供一种增殖效率高、结构简单、实用方便的高效扩增人类外周血NK细胞的简易装置。
[0005]本实用新型实现目的的技术方案如下:
[0006]—种高效扩增人类外周血NK细胞的简易装置,包括一培养瓶,培养瓶一侧制有瓶口,在培养瓶内两相向侧面固装翅片,两侧的翅片交错设置,在翅片上表面制有培养槽,在培养槽表面包裹一层助剂层。
[0007]而且,所述助剂层为细胞因子和激发单抗。
[0008]本实用新型的有益效果为:
[0009]1、本实用新型在原有细胞培养瓶的基础上进了改进和加工,将培养瓶内对应的两侧壁制有翅板,两侧壁的翅板交叉设置,培养瓶内设置翅板能够使NK细胞更多接触到光滑的翅板表面,能够激发NK细胞增殖,提高NK细胞的培养效率。
[0010]2、本申请通过固相结合细胞因子和特制的NK培养液对NK细胞进行共刺激,实现了 NK细胞表面的IL - 15和其它相关细胞因子受体的有效激活,从而获得足够供给临床上NK细胞免疫疗法需使用的细胞量,同时避免了使用K562工程细胞作为滋养细胞的潜在风险和高昂成本,使更多一般硬件水平和技术水平的实验室也可进行NK细胞的高效体外扩增。
[0011]3、本申请提供的简易装置不同于常规培养瓶,该培养瓶内部固定有平行排列的凹心板状结构,可有效增大培养瓶内表面积,同时在一定程度上防止培养悬浮细胞时常见的细胞沉降问题,保持培养瓶内细胞比较均匀的分布。
【附图说明】
[0012]图1为本实用新型的结构示意图;
[0013]图2为图1的A-A向剖视图;
[0014]图3为图1的B-B向剖视图。
【具体实施方式】
[0015]下面结合附图并通过具体实施例对本实用新型作进一步详述,以下实施例只是描述性的,不是限定性的,不能以此限定本实用新型的保护范围。
[0016]—种高效扩增人类外周血NK细胞的简易装置,包括一培养瓶1,培养瓶一侧制有瓶口 2,在培养瓶内两相向侧面固装翅片3,两侧的翅片交错设置,在翅片上表面制有培养槽5,在培养槽表面包裹一层助剂层4,所述助剂层为细胞因子和激发单抗,所述细胞因子和激发单抗包括 CD137L、IL — 15、IL — 15Ra、IL — 21、MICA。
[0017]在培养瓶内壁及翅片本实用新型的操作过程如下:
[0018]成人外周血NK细胞分离培养。
[0019]采血体积60ml,III型抗凝剂抗凝,常规ficoll密度梯度力心分离PBMC,总PBMC计数1*108。流式细胞表型分析显示⑶3-/⑶56+比例约为总PBMC的5%,即NK细胞数为5*106。
[0020]将分离后的PBMC以NKEM培养基洗涤一次后,重悬于100ml新鲜的NKEM,等量注入10个经CD137L、IL — 15、IL 一 15Ra、IL 一 21、MICA包被的低细胞粘附性75T培养瓶,包被浓度分别为 50ng/ml、300U/ml、50ng/ml、300U/ml、50ng/ml,并将其置于 37 °C 5 % C02培养箱中,每2天更换半量新鲜的NKEM。
[0021]培养第7天,有核细胞总数达到约1.1*108,FACS检测结果⑶3_/⑶56+比例约为25%,此时更换新的经CD137L、IL 一 15、IL 一 15Ra、IL 一 21、MICA包被的低细胞粘附性75T培养瓶,并将其置于37°C 5% 0)2培养箱中,每2天更换半量新鲜的NKEM。
[0022]培养第14天,有核细胞总数达到约2.0*108,FACS检测结果CD3-/CD56+比例约为50%。重新调整细胞密度为2.0*106/ml,并以每75T培养瓶10ml加入新的经CD137L、IL 一15、IL 一 15Ra、IL 一 21、MICA包被的低细胞粘附性75T培养瓶,每2天更换半量新鲜的NKEMo
[0023]培养第21天,有核细胞总数达到约1.1*109,FACS检测结果⑶3_/⑶56+比例约为70%。此时已经可以收获体外扩增的NK细胞用于临床。
【主权项】
1.一种高效扩增人类外周血NK细胞的简易装置,包括一培养瓶,培养瓶一侧制有瓶口,其特征在于:在培养瓶内两相向侧面固装翅片,两侧的翅片交错设置,在翅片上表面制有培养槽,在培养槽表面包裹一层助剂层。
【专利摘要】本实用新型涉及一种高效扩增人类外周血NK细胞的简易装置,包括一培养瓶,培养瓶一侧制有瓶口,在培养瓶内两相向侧面固装翅片,两侧的翅片交错设置,在翅片上表面制有培养槽,在培养槽表面包裹一层助剂层。所述助剂层为细胞因子和激发单抗。本申请提供的简易装置不同于常规培养瓶,该培养瓶内部固定有平行排列的凹心板状结构,可有效增大培养瓶内表面积,同时在一定程度上防止培养悬浮细胞时常见的细胞沉降问题,保持培养瓶内细胞比较均匀的分布。
【IPC分类】C12M1/24, C12M3/00
【公开号】CN204999921
【申请号】CN201520524723
【发明人】王之婴, 朱江
【申请人】天津市康婷生物工程有限公司
【公开日】2016年1月27日
【申请日】2015年7月20日
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