绵羊肉用性能特异主效基因等位基因检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本实用新型涉及绵羊肉用性能特异主效基因等位基因检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 绵羊肉用性能（产肉量）是重要的经济性状，检测并选留具有优良肉用性能的绵 羊可以显著提高养殖户经济效益。随着现代生物技术的发展，利用分子遗传学方法能够准 确检测并选留具有优良肉用性能的绵羊。基于动物DNA序列影响表型性状的基本生物学原 理，应用现代分子遗传学方法，寻找鉴定影响绵羊肉用性能的高效特异等位基因是评价绵 羊肉用性能的有效手段之一。绵羊肉用性能（产肉量）是数量性状，受微效多基因调控，也 有效应较大的主基因（Majorgene)。目前，检测影响绵羊肉用性能的基因大多数为微效基 因，而微效基因数量大且并非随机分布，通过检测微效基因评估绵羊肉用性能的准确性不 高，多个微效基因的检测结果可能互相冲突且费时费力。而通过寻找和分析效应较大的主 基因DNA序列，检测影响绵羊广肉性能的主基因特异等位基因，可以有效提尚绵羊肉用性 能评估的准确性，缩短绵羊肉用性能改良进程，进而提高绵羊个体经济效益。
[0003] 绵羊FABP4基因定位于9号染色体，包括4个外显子和3个内含子，其被认为是影 响肉质性状的主要候选基因之一。绵羊FABP4基因具有丰富的变异，而剖析各个等位基因 对肉用性能的影响程度有利于开发DNA标记物。
[0004] 本实用新型采用的绵羊肉用性能分子标记选种技术主要针对特异主效基因 FABP4,利用PCR-SSCP技术检测特异等位基因，然后根据检测结果评估携带不同等位基因 个体的肉用性能等级，从而判断是否留做种用。上述检测过程需要使用多种试剂，因此很需 要有一种存放盒，能够将试剂瓶及主要辅助检测用品集装在一个盒中作为一个单元取用， 检测者使用时只需取一次盒即可实施操作，使用完可以存回原盒送检，这将是很方便之举， 同时这样也可避免造成二次污染。 【实用新型内容】
[0005] 本实用新型提供了绵羊肉用性能特异主效基因等位基因检测试剂盒，将检测过程 中所使用的多种试剂存放在一起，方便使用。
[0006] 本实用新型提供一种绵羊肉用性能特异主效基因等位基因检测试剂盒，包括盒 体、盒盖和衬垫，在衬垫12上设有9个容器孔，其特征在于：所述容器孔分3列放置，每列之 间设有挡板或凹槽；左列上部设有容器孔9,容器孔9为长方体形，左列下部横向并排设有 两个容器孔，分别为容器孔1和容器孔2 ;中间列设有竖向的两个容器孔，分别为容器孔3 和容器孔4,所述容器孔4的直径大于所述容器孔3的直径；右列设有竖向的四个容器孔， 分别为容器孔5、容器孔6、容器孔7和容器孔8。
[0007] 本实用新型提供一种绵羊肉用性能特异主效基因等位基因检测试剂盒，包括盒体 (11)、盒盖（10)和衬垫（12)，在衬垫（12)上设有9个容器孔，在容器孔中分别放置特异 性上下游引物混合溶液和FABP4基因的等位基因的标准样（4)以及PCR反应液（3);所述 FABP4基因的等位基因的标准样由等量的FABP4*A的标准样、FABP4*B的标准样、FABP4*C的标准样、FABP4*D的标准样和FABP4*E的标准样组成。
[0008] 优选地，在所述容器孔中还分别放置20mMNaOH试剂（1)、1倍TE溶液（2)、银染 液（5)、40 %的丙烯酰胺溶液（6)、变性上样缓冲液（7)、TEMED溶液和10 %的过硫酸铵溶液 (8) 和特殊DNA承载滤纸（9)。
[0009] 进一步地，在所述容器孔中分别放置5ml20mMNaOH试剂（l)、5ml1倍TE溶液 (2)、2mlPCR反应液（3)、0. 5ml特异性上下游引物混合溶液和0. 5ml等位基因标准DNA样 本、5ml银染液（5)、10ml40%的丙烯酰胺溶液（6)、0. 5ml变性上样缓冲液（7)、2mlTEMED 溶液和2ml10 %的过硫酸铵溶液（8)和特殊DNA承载滤纸（9)。
[0010] 应用本实用新型的试剂盒检测绵羊肉用性能特异主效基因等位基因的方法如 下：
[0011](一）收集具有产肉性能指标（腿部肉重、腰部肉重、肩部肉重、总肉重或腿部肉比 例、腰部肉比例和肩部肉比例）的绵羊DNA血样。
[0012] (二）PCR扩增所收集的DNA血样。
[0013] PCR扩增时所使用引物为：
[0014] 上游引物18bp核苷酸，下游引物20bp核苷酸，扩增片段大小约为350bp，具体引物 序列如下：
[0015] 上游引物Up:TGTGGGCTTTGCTACCAG;
[0016] 下游引物Dn:ACTTAGATGAAGGTGCTCTG。
[0017] PCR反应体系为：
[0018] 10XPCR缓冲液（2,5mM) 2μ1 Mg2+ (3.0μΜ) 1. 2μ 1 5XQ溶液（L5raM) :2μ1 dNTP(150μΜ) 1. 2μ1 上下游混合引物（0. 25μΜ) .1μ1 Taq聚合酶 0· 5tJ 0. 1μ1 模板DNA用量 1个滤纸小圆盘（1. 2mm) 去尚子水 12. 5y]
[0019] 上述特异等位基因扩增引物的PCR反应条件为：预变性95°C5分钟，变性94°C30 秒，退火温度60°C30秒，延伸温度72°C45秒，最后延伸温度72°C10分钟。
[0020] (三）对PCR产物进行SSCP检测判断等位基因SSCP带型。
[0021] SSCP检测试剂为：去离子水，10%过硫酸铵，变性上样缓冲液，TEMED(四甲基乙二 胺），非变性聚丙烯酰胺（Acr:Bis= 37. 5:1)，等位基因标准DNA样本。等位基因标准DNA 样本的核苷酸序列参见序列表中SEQIDNo. 1-5,与检测出的5种等位基因在序列上完全相 同。等位基因标准DNA样本是制备的单链DNA，其唯一特点是标样单链DNA在SSCP电泳时 条带非常清晰明亮，标样DNA与待检测DNA双链样本同步进行SSCP电泳时，可以用肉眼直 接比较标样DNA与待测DNA样本带型差别，以此来判断待测样本DNA是否存在特异等位基 因。
[0022] 为保证检测样本DNA等位基因判读的准确性，等位基因标准DNA与待测样本DNA 同时进行SSCP电泳，参照等位基因标准DNA样本判定检测样本等位基因类型。
[0023] SSCP检测方法为：将20μ1PCR产物与60μ1变性上样缓冲液（98 %去离子甲酰 胺、10mMEDTA、0. 025%溴酚蓝、0. 025%二甲苯青FF)混合，105°C变性5分钟，立即冰浴冷 却10分钟，14 %非变性聚丙烯酰胺凝胶在室温7. 5 °C、冷循环4. 2 °C、390V电压下电泳19小 时，银染后显色拍照。
[0024] 25ml非变性聚丙烯酰胺凝胶的制备方法为：40%的非变性聚丙烯酰胺8. 75毫升、 10倍TBE1. 25毫升、10%APS150微升、TEMED13. 64微升和蒸馏水14. 84毫升。
[0025] (四）克隆、测序判定等位基因序列。
[0026] 具体如下：
[0027]PCR产物回收纯化（按宝生物试剂盒说明书进行）、T载体连接（pGEM-TEasy载 体，普洛麦格（Promega)公司，按说明书进行操作）、感受态细胞制备和转化（大肠杆菌 DH5a感受态试剂盒，宝生物公司，按试剂盒说明书进行）、质粒DNA提取（宝生物公司，按 试剂盒说明书进行）、重组质粒鉴定（酶切鉴定，使用限制性内切酶EcoR1)、等位基因阳性 克隆的SSCP鉴定，送北京六合华大公司测序鉴定。
[0028] (五）结果判断：电泳结果发现5种等位基因（A、B、C、D和E)，SSCP带型图如图 1所示，通过上述方法检测绵羊个体FABP4特异等位基因带型和测序，结合产肉性能表型资 料，确定影响产肉性能的特异等位基因。
[0029] 绵羊产肉性能指标（腿部肉重、腰部肉重、肩部肉重、总肉重或腿部肉比例、腰部 肉比例和肩部肉比例）中最具代表性的指标为总肉重，即腿部肉重、腰部肉重和肩部肉重 总和。等位基因E被检出率很小，建议淘汰。表1对罗姆尼羊FABP4等位基因A、B、C和D 对总产肉量的影响进行了分析，结果表明等位基因A对总产肉量有显著影响（P〈0. 05)，等 位基因存在时总产肉量最高（51.730Kg);等位基因B和C对总产肉量有影响趋势（P〈0. 1); 等位基因D对总产肉量无影响（P>0. 15)。
[0030] 表1FABP4等位基因变异对罗姆尼绵羊总产肉量的影响
[0031]
[0032] 分析方法如下：选择无亲缘关系的优良父本（基于新西兰SIL协会评定）用于绵 羊配种（采用人工授精方法），每一只公羊与40到60只母羊（随机选取，年龄4-7岁）配种 组成单一家系。在本研究17个绵羊家系中，性别和初生等级被分别记录。采用视频图像分 析方法（文南犬如下HopkinsDL，SafariE，ThompsonJM,SmithCR.Videoimageanalysis intheAustra