牦牛肌肉嫩度主效等位基因检测试剂盒的制作方法

文档序号:10204783阅读:345来源:国知局
牦牛肌肉嫩度主效等位基因检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本实用新型设及巧牛肌肉嫩度主效等位基因检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 牛肉嫩度受宰前和宰后的多种因素影响,但遗传对其也有重要作用。目前对普通 牛肌肉嫩度从分子水平开展了大量研究,定位了一些与嫩度有关的WL或主基因,确定了一 些牛肉嫩度候选基因并阐明了其结构和群体遗传多态性,筛选出与牛肉嫩度紧密连锁的分 子标记,部分分子标记已通过GeneSTAR Tenderness等开展商业检测。
[0003] 巧蛋白酶水解系统是一个普遍存在于人和动物机体内的高度复杂的调控体系,主 要由巧蛋白酶(CAPN)及巧蛋白酶抑制蛋白(CAST)、骨骼肌特异性巧蛋白酶(P94)组成。CAPN 降解肌细胞肌原纤维,CAST高效、专一性的抑制CAPN的水解,即CAST广泛存在于细胞内,可 W识别巧离子激活后引起的巧蛋白酶构象变化,并与之结合,从而抑制巧蛋白酶活性。 CAST作为CAPN内源性特异抑制因子,屠宰后24h CAST的活性通常能解释牛肉嫩度约40%的 差异,因此也确定为嫩度候选基因。普通牛CAST基因位于第7号染色体,CAST基因突变与一 些普通牛品种的肌肉嫩度相关;猪CAST基因对猪肉的蒸煮损失、系水力、多汁性、背腰厚、大 理石花纹等均有影响;绵羊CAST基因表达量与背最长肌失水率相关。
[0004] 巧牛是青藏高原及其周边高寒牧区的特有牛种,也是重要的生产和生活资源。近 年来,国内外从比较基因组学、巧牛起源、演化和分类等方面,对巧牛遗传特性开展了较多 研究,也对一些重要经济性状候选基因进行了探索,但均未见报道相应基因对巧牛肌肉嫩 度的作用。 【实用新型内容】
[000引本实用新型提供了巧牛肌肉嫩度主效等位基因检测试剂盒,能够方便的对巧牛肌 肉嫩度主效等位基因进行检测。
[0006] 本实用新型提供一种巧牛肌肉嫩度主效等位基因检测试剂盒,包括盒盖(1)和盒 体(2),还包括衬垫(3),所述衬垫(3)上设有分为=排放置的6个容器孔,分别为:用于放置 去离子水的去离子水容器孔(41),用于放置10%过硫酸锭的10%过硫酸锭容器孔(42),用于 放置上样变性缓冲液的上样变性缓冲液容器孔(43),用于放置PCR反应液的PCR反应液容器 孔(44),用于放置CAST*D的DNA标准样的CAST*D的DNA标准样容器孔(45),用于放置四甲基 乙二胺的四甲基乙二胺容器孔(46);在每排容器孔之间,设有用于放置冰块的凹槽一巧1) 和凹槽二巧2)。
[0007] 本实用新型的巧牛肌肉嫩度主效等位基因检测试剂盒将检测过程中所使用的多 种试剂存放在一起,使用方便,检测快速且准确。
【附图说明】
[0008] 附图用来提供对本实用新型的进一步理解,并且构成说明书的一部分,与本实用 新型的实施例一起用于解释本实用新型,并不构成对本实用新型的限制。在附图中:
[0009] 图1为本实用新型的巧牛肌肉嫩度性状等位基因的SSCP带型图。
[0010] 图2为巧牛肌肉嫩度主效等位基因检测试剂盒结构图。
【具体实施方式】
[0011] W下的实施例便于更好地理解本实用新型,但并不限定本实用新型。下述实施例 中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说 明,均为常规生化试剂。
[001引实施例1
[0013] 本实用新型所述的巧牛肌肉嫩度主效等位基因检测试剂盒的具体结构参见图2, 其中,1:盒盖;2:盒体;3:衬垫,衬垫上设有分为=排放置的6个容器孔,分别为:用于放置去 离子水的去离子水容器孔41,用于放置10%过硫酸锭的10%过硫酸锭容器孔42,用于放置上 样变性缓冲液的上样变性缓冲液容器孔43,用于放置PCR反应液的PCR反应液容器孔44,用 于放置CAST*D的DNA标准样的CAST蝴的DNA标准样容器孔45,用于放置TEMED(四甲基乙二 胺)的四甲基乙二胺容器孔46;在每排容器孔之间,设有用于放置冰块的凹槽一 51和凹槽二 52。
[0014] 其中,上样变性缓冲液包括98%去离子甲酯胺、0.025%漠酪蓝、0.025%二甲苯氯、10 mmol/L 邸TA,p册.0;
[001引 PCR反应的反应液为:总体积20化,其中DNA模板0.8化,上、下游引物各0.4化, TaKaRa Premix Taq聚合酶11化,灭菌超纯水7.化L。
[0016] C A S T * D的D N A标准样的核巧酸序列为:
[0017] 应用本实用新型的试剂盒检测和鉴别巧牛肌肉嫩度主效等位基因的方法如下: [001引(1)样品采集:巧牛颈静脉采血IOml, ACD抗凝,-70°C冻存;
[0019] (2 )基因组DNA的提取:用苯酪-氯仿法从冻存血样中提取基因组DNA;
[0020] (3)聚合酶链式反应:
[0021 ] PCR反应体系:总体积20化,其中DNA模板0.祉U SOngAiL),上、下游引物各0.4化, I^KaRa Premix Taq聚合酶11化,灭菌超纯水7.化L。反应条件:95°C预变性2 min;94°C变性 30 s,64°C退火30 s,72°C延伸30 S,共35个循环;最后72°C延伸10 min;
[002引引物序列为:
[002引 (4)PCR产物的SSCP检测:
[0026] 取化L的PCR产物加入8化变性上样缓冲液(98%去离子甲酯胺、0.025%漠酪蓝、 0.025%二甲苯氯、10 mmol/L EDTA P册.0),98°C变性lOmin,迅速冰浴5min后,上样到10%非 变性聚丙締酷胺凝胶^(3':5(3'=39:1),30(^电压、电泳室溫度4°〇、电泳槽水循环溫度4°〇电 泳1她,银染法显色后判定基因型。
[0027] (5)结果判断:
[002引通过对巧牛CAST基因第S内含子的PCR-SSCP检测,发现有6个等位基因,携带 CAST*D标准样带型的样品即为携带影响巧牛肌肉嫩度等位基因的个体。
[0029] 实施例2应用实施例
[0030] -、检测巧牛群体
[0031] 甘南巧牛703头,在屠宰时采集血样IOml,所有血样ACD(酸性巧樣酸葡萄糖)抗凝; 同时测定对应采集血样巧牛的肌肉嫩度、失水率、熟肉率,禍体重、眼肌面积,记录其年龄和 性别。
[0032] 二、试验方法
[0033] 1.引物设计和PCR扩增
[0034] 引物序列如下:
[0037]最佳反应体系及反应条件:
[003引 PCR反应体系:总体积20化,其中DNA模板0.祉U SOngAiL),上、下游引物各0.4化, hKaRa Premix Taq聚合酶11化,灭菌超纯水7 .化L。反应条件:95°C预变性2min; 94°C变性 30s,64°C退火30s,72°C延伸30s,共35个循环;最后72°C延伸lOmin。反应结束后,取5PCR反 应液巧化)用1%琼脂糖凝胶电泳,检测是否扩增到PCR产物。
[0039] 2. SSCP检测
[0040] 取步骤1中化L的PCR产物加入祉L变性上样缓冲液(包括去离子甲酯胺、0.025% 漠酪蓝、0.025%二甲苯氯、10 mmol/L EDTA (抑8.0)),98°C变性lOmin,迅速冰浴5min后,上 样到10%非变性聚丙締酷胺凝胶(Acr:Scr=39:l),300V电压、室溫及电泳槽水循环溫度均4 °C电泳1她,银染法显色后判定SSCP带型。在703头巧牛中检测到AA、BB、AB、BC、AC、AD、W、 CD、AE、FF及BF 11种带型,对应6种等位基因CAST*A、地、*C、*D、巧和冲。SSCP电泳图见说明 书附图1。
[0041 ] 3.基因测序
[0042] 根据SSCP胶图判型结果,等位基因CAST*A、*B、冲有纯合型个体,应用其PCR产物直 接测序;等位基因CAST*C、*D、巧存在于杂合个体中,对特异性SSCP条带切胶、重新扩增后测 序。等位基因序列由北京六合华大基因公司测定。测定结果通过DNAMAN软件进行序列比对。 经测序,CAST*A、地、*C、蝴、巧和冲的核巧酸序列如下:
[0043] 控制巧牛肌肉嫩度的等位基因为CAST*D的核巧酸序列为:

[0045] 对巧牛肌肉嫩度无影响的等位基因为C A S T * A的核巧酸序列为:
[0046] 对巧牛肌肉嫩度无影响的等位基因为C A S T * B的核巧酸序列为:
[0047] 对巧牛肌肉嫩度无影响的等位基因为C A S T * C的核巧酸序列为:
[0048] 对巧牛肌肉嫩度无影响的等位基因为C A S T * E的核巧酸序列为:
[0049] 对巧牛肌肉嫩度无影响的等位基因为C A S T * F的核巧酸序列为:
[0050] 4.巧牛CAST基因第S内含子区等位基因与肌肉嫩度相关性分析
[0051] 由于3岁、4岁、5岁和7岁巧牛样本量较小,各基因型的样本量也较小,故只对样本 量较大的6岁巧牛个体进行相关性分析;另外,CAST*E和CAST*F频率低,样本量少,故不进行 相关性分析。
[0052]表1巧牛CAST基因第S内含子区各等位基因与禍体及肉质性状关联分析
O
[0054] 注:(P<0.01)表示差异极显著;(P<0.05)表示差异显著。
[0055] 本实施例运用等位基因"缺失/存在"的方法分析了6岁甘南巧牛CAST基因第S内 含子主要等位基因对禍体重及肉质性状的影响(表1),结果表明6岁携带等位基因 D的巧牛 个体嫩度剪切力值显著低于(P<〇.05)未携带者,即选留携带等位基因 D的个体,能改善巧牛 肉的嫩度。
[0056] 最后应说明的是:W上所述仅为本实用新型的优选实施例而已,并不用于限制本 实用新型,尽管参照前述实施例对本实用新型进行了详细的说明,对于本领域的技术人员 来说,其依然可W对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分技术特征 进行等同替换。凡在本实用新型的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均 应包含在本实用新型的保护范围之内。
[0057] 序列表
[005引 <110〉甘肃农业大学
[0059] <120〉巧牛肌肉嫩度主效等位基因检测试剂盒
[0060] <170> PatentIn version 3.5
[0061] <210〉 1
[0062] <211〉 404
[0063] <212〉 DNA
[0064] <213〉CAST*A 核巧酸序列

【主权项】
1.牦牛肌肉嫩度主效等位基因检测试剂盒,包括盒盖(1)和盒体(2),其特征在于:还包 括衬垫(3),所述衬垫(3)上设有分为三排放置的6个容器孔,在每排容器孔之间,设有用于 放置冰块的凹槽一(51)和凹槽二(52);第一排设置竖向的两个容器孔,分别为容器孔一 (41)和容器孔二(42),第二排设置竖向的三个容器孔,分别为容器孔四(44)、容器孔五(45) 和容器孔六(46),第三排设置一个容器孔,为容器孔三(43);所述容器孔三(43)的直径大于 所述容器孔一 (41)、容器孔二(42)的直径;所述容器孔一 (41)、容器孔二(42)的直径大于所 述容器孔四(44)、容器孔五(45)和容器孔六(46)的直径。
【专利摘要】本实用新型提供一种牦牛肌肉嫩度主效等位基因检测试剂盒,包括盒盖和盒体,还包括衬垫,所述衬垫上设有分为三排放置的6个容器孔,分别为:用于放置去离子水的去离子水容器孔,用于放置10%过硫酸铵的10%过硫酸铵容器孔,用于放置上样变性缓冲液的上样变性缓冲液容器孔,用于放置PCR反应液的PCR反应液容器孔,用于放置CAST*D的DNA标准样的CAST*D的DNA标准样容器孔,用于放置四甲基乙二胺的四甲基乙二胺容器孔;在每排容器孔之间,设有用于放置冰块的凹槽一和凹槽二。本实用新型的牦牛肌肉嫩度主效等位基因检测试剂盒将检测过程中所使用的多种试剂存放在一起,使用方便,检测快速且准确。
【IPC分类】C12Q1/68, C12M1/34
【公开号】CN205115474
【申请号】CN201520530747
【发明人】胡江, 牛晓亮, 刘秀, 李彦清, 罗玉柱
【申请人】甘肃农业大学
【公开日】2016年3月30日
【申请日】2015年7月21日
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