单细胞定位微孔膜和单细胞自动化获取装置的制造方法
【技术领域】
[0001] 本实用新型属于稀有细胞检测领域，具体涉及一种从细胞悬液中获取单个细胞的 微孔膜，还涉及一种单细胞自动化获取装置。
【背景技术】
[0002] 单细胞分析已成为生物医学研究的热点领域，它能够揭示异质性较大细胞群体的 分子特征，特别是一些数量极其稀少，却具有重要生物学功能或临床检测意义的细胞，如人 外周血中的循环肿瘤细胞、循环内皮细胞、被病毒感染的细胞，孕妇外周血中来自胎儿的有 核红细胞，以及少量实体肿瘤样本中的肿瘤干细胞等，对其的捕获和检测分析意义就更为 重大了。但是如何可靠获取单个细胞进行分析，尤其针对数目极少的稀有细胞，无疑是目前 技术上的瓶颈。
[0003] 这些稀有细胞在进一步分析之前往往需要加以富集，但即使在富集之后，这些稀 有细胞的数目仍然极少且存在一定量其他的干扰细胞，需要一种可靠且自动化程度较高方 法能够将这些珍贵的细胞一一取出并进行分析。
[0004] 对单个细胞的操纵是属于对单细胞分析前的样本准备过程，要求将目标细胞从背 景样本中分离出来然后运送至指定位置或处于指定环境中以便于下一步的单细胞分析。一 个典型的应用场景是经过富集的循环肿瘤细胞样本中含有80个循环肿瘤细胞，500个白细 胞，其中循环肿瘤细胞与白细胞可以通过针对细胞膜表面蛋白的免疫荧光染色来区分，为 了从单细胞尺度上研究循环肿瘤细胞的分子特征，需要将80个循环肿瘤细胞一一取出并分 别进行细胞裂解、基因组扩增以及靶基因的测序。
[0005]目前已有多种单细胞操纵的方法，常见的是通过显微操作仪、激光显微切割或光 镊来获取靶细胞，能够对少量细胞样本进行处理，但自动化程度低、操作时间长，需要训练 有素的操作人员且操作过程中细胞存在一定的损失率。流式细胞仪是另一种常见的细胞分 选设备，能够将细胞逐个分到比如96孔板中的各个孔内，但这一技术的不足之处是其无法 处理较少数目的细胞，难以对只含有几百甚至几十个细胞的样本进行可靠的分选。
[0006]微流控芯片是一种操控微量液体流动的芯片技术，非常适用于微量液体生物样 本、少量细胞的操作与分析，且易于自动化并能够实现多项功能或模块的整合。比如 Fluidigm公司的C1?单细胞自动前处理系统（Single-Cell Auto Prep System)，通过微流 控芯片上设计精巧的几何结构将单个细胞滞留在指定位置从而实现单细胞的捕获。每块芯 片有96个捕获单元，当单个细胞被捕获后可以随即进行芯片上的细胞裂解，核酸扩增等步 骤，完成整个单细胞操纵与处理过程，所获得的来自单细胞的核酸可转移至该公司的另一 款设备进行分析以实现单细胞的基因分析。但是，这一系统仍然不太适合极少数目细胞的 操纵，原因在于其操纵准确率低，从而靶细胞损失率较高，且无法处理混有除靶细胞以外其 他细胞的样本，同时用于分选单个细胞的微流控芯片价格昂贵。另一种对单个细胞进行操 纵的方式是在芯片外施加不均一的电场，从而将不同细胞移动至特定位置，比如Silicon Biosystems公司的DEPArray?系统可以操纵可移动的介电泳讲从细胞群体取出特定的单个 细胞，虽然操纵准确，细胞损失率低，但其操作时间较长，通量很低，且该系统价格极其昂 贵，难以装备一般实验室，更加无法应用于临床，普及性差。
[0007] 综述所述，现有技术中用于单细胞操纵装置的优缺点汇总于表1。
[0008] 表 1
【实用新型内容】
[0011] 本实用新型提供了一种从细胞悬液中获取单个细胞的微孔膜，用以解决传统稀有 细胞检测中的单细胞提取准确度低，损失率高，周期长的问题。
[0012] 本实用新型还提供了 一种单细胞自动化获取装置，用以解决目前获取装置自动化 程度低或设备成本过高，不利于普及的问题。
[0013] 为了解决上述技术问题，本实用新型的技术方案是:所述单细胞定位微孔膜，包括 开设有若干通孔的多孔膜和覆盖所述通孔的滤膜，所述通孔内滤膜上设有至少一个微孔， 所述微孔直径为3_8μπι，优选5μπι，所述滤膜的厚度为0.5_2μπι，优选ΙμπιΑ微米的孔径小于绝 大部分的稀有细胞，如血液中的循环肿瘤细胞、循环内皮细胞，孕妇血液中的胎儿有核红细 胞，以及胸腔积液、脑脊液等体液中的游离肿瘤细胞，因此5微米的微孔可以截留细胞悬液 中以上这些稀有细胞，另外0.5-2μπι厚度的滤膜一方面可以保证成功截留，另一方面在定位 回收时可以较容易戳破。
[0014] 优选的是，所述多孔膜的材质为硅，所述滤膜的材质为氮化硅。氮化硅材质较脆， 既能保证细胞的承载，又容易被利器打破。
[0015] 优选的是，所述多孔膜上通孔呈阵列分布，数量为10000-100000个。如果细胞悬液 中细胞的数目远小于滤膜上通孔的数目（超过10000个），根据泊松分布可知，在每个微孔上 的基本都是单个细胞，阵列分布的通孔，坐标容易确定，从而使落入通孔内的单细胞坐标确 定，实现单细胞快速准确定位。
[0016] 优选的是，所述多孔膜上的通孔直径为20-100μπι，优选70μπι。多孔膜的直径，一方 面要能够在单位面积中容纳尽量多的孔，另一方面要保证后续破除滤膜时，机械器件可以 戳破膜的通知不会碰到其中的细胞。
[0017] 采用上述单细胞定位微孔膜进行单细胞定性并获取的方法包括如下步骤：
[0018] 1)将样品施于所述单细胞定位微孔膜上，样品中细胞落入所述通孔内，被所述滤 膜截留，至此各个细胞坐标通过通孔位置得以确定；
[0019] 2)通过显微镜明场成像或荧光素标记细胞并成像确定各通孔内细胞类别，从而确 定了目标细胞位置；
[0020] 3)将容器置于所述单细胞定位微孔膜下方，排除目标细胞所处通孔内滤膜的阻 挡，使其落入所述容器内，完成目标细胞的收集。
[0021] 细胞悬液中截留的稀有细胞，可以通过显微镜的明场成像观察到，如果细胞悬液 中还存在其他种类的细胞，可以在滤膜上直接通过针对细胞膜表面特异性蛋白的免疫荧光 染色将不同种类区分开。比如，细胞悬液中同时存在非小细胞肺癌的肿瘤细胞和白细胞，这 些细胞在被滤膜截留后，可以用FITC荧光素标记的白细胞抗原CD45的抗体(显微镜下为绿 色），以及APC荧光素标记的上皮标志物EpCAM和EGFR的抗体（显微镜下为红色)来对细胞进 行染色，然后在显微镜下将显示较强红色荧光、不显示绿色荧光的细胞认定为肿瘤细胞，将 显示较强绿色荧光、不显示红色荧光的细胞认定为白细胞。
[0022] 所述目标细胞为血液中的循环肿瘤细胞、循环内皮细胞、胎儿有核红细胞、体液中 的游离肿瘤细胞和/或白细胞。
[0023] 所述容器收集到目标细胞后进一步在其中进行细胞裂解和单细胞全基因组放大。 经过简单处理后可用于后续的目的基因扩增，进行一系列检测。
[0024] 本实用新型还提供了一种单细胞自动化获取装置，包括支架、设置在支架上的破 膜机构、位于所述破膜机构下方的第一平台和设置在所述破膜机构和所述第一平台之间的 第二平台，所述第一平台和第二平台在XY向平面平移，所述破膜机构在Z向竖直运动，所述 第一平台上设置容器，所述第二平台上设置上述单细胞定位微孔膜。
[0025]优选的是，所述容器为微孔板。比如96孔板或384孔板。
[0026]优选的是，所述破膜机构的运动精度为0.1-10M1，优选5μπι，所述第二平台的运动 精度为〇·1_5μπι，优选Ιμπι，所述第一平台的运动精度为0·1-10μπι，优选5μπι。
[0027]优选的是，所述单细胞自动化获取装置还包括显微镜。
[0028]优选的是，所述破膜机构包括第三平台和固定在第三平台上破膜针，所述第三平 台沿Ζ向运动。
[0029] 本实用新型提供的技术方案中细胞悬液中的单细胞落入单细胞定位微孔膜中的 各通孔中，而又被滤膜截获，对各通孔中单细胞进行鉴别，其中目标细胞因通孔可寻址从而 完成定位，然后将目标细胞所处通孔移至收纳容器上方，将滤膜刺破，目标细胞落入容器 内。该微孔膜和装置可准确、可靠、