一种胞苷脱氨酶基因单核苷酸多态性检测试剂盒的制作方法

文档序号:10456329阅读:467来源:国知局
一种胞苷脱氨酶基因单核苷酸多态性检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001]本实用新型属于生物技术领域,涉及一种基因多态性检测试剂盒,具体涉及一种胞苷脱氨酶基因单核苷酸多态性检测试剂盒。
【背景技术】
[0002]吉西他滨是目前常用的化疗药物之一,其作为非小细胞肺癌、乳腺癌的一线治疗药物已取得较好的疗效,也可与卡铂、紫杉醇等药物联合,用于治疗膀胱癌、卵巢癌、鼻咽癌、霍奇金淋巴瘤等多种肿瘤(Fitzgerald SM,Goyal RK , Osborne ff R , e tal.1dentificat1n of funct1nal single nucleotide polymorphism haplotypes inthe cytidine deaminase promoter[J].Hum Genet,2006,119(3):276-283),Sugiyama E,Kaniwa N,Kim SR,et al.Pharmacokinetics of gemcitabine in Japanese cancerpatients: the impact of a cytidine deaminase polymorphism!! J].J Clin Oncol,2007,25(1):32-42)。然而,不同患者在接受吉西他滨治疗时,即使采用相同的单位体表面积剂量,疗效和不良反应仍差别明显,从而限制了吉西他滨在抗肿瘤治疗中的应用。除了患者本身疾病、性别、年龄等差异外,与吉西他滨相关的胞苷脱氨酶的基因CDA多态性是一个重要影响因素。CDA基因多态性会影响吉西他滨的药代动力学,通过损害CDA对吉西他滨的解毒功能,导致药物毒副作用的增加,CDA活性减弱的癌症患者在接受吉西他滨治疗时易导致更高的毒性发生。CDA存在两种基因多态性A79C和G208A,其突变型会导致⑶A活性减弱,使肿瘤患者在接受吉西他滨治疗时易发生更高的毒副作用(Yue L,Saikawa Y,Ota K,etal.A funct1nal single-nucleotide polymorphism in the human cytidinedeaminase gene contributing to ara_C sensitivity[J].Pharmacogenetics,2003,13(I):29-38)o
[0003]目前检测基因多态性的方法很多,包括反向点杂交、等位基因特异性聚合酶链反应、直接测序法等,但都因费用昂贵、操作复杂或特异性和敏感性不理想而未能广泛使用,且检测时间长。
【实用新型内容】
[0004]本实用新型要解决的技术问题为目前市场上针对胞苷脱氨酶基因CDA单核苷酸多态性扩增检测特异性不强,成本高且操作复杂的问题,本实用新型能较好的应用于CDA基因A79C和G208A两个位点的单核苷酸多态性检测,且体积小,便于运输携带和使用。
[0005]为实现上述目的,本实用新型采用以下技术方案:
[0006]—种胞苷脱氨酶基因单核苷酸多态性检测试剂盒,其特征在于,所述的试剂盒包括盒体1、海绵衬垫2,所述的海绵衬垫2置于盒体I内,海绵衬垫2上设有的容器孔装有多个装有试剂的试剂管,分别为装有胞苷脱氨酶基因多态性扩增检测反应液的试剂管3、装有A79C野生型阳性对照、突变型阳性对照、杂合子阳性对照的试剂管4-6、装有G208A野生型阳性对照、突变型阳性对照、杂合子阳性对照的试剂管7-9、装有阴性对照的试剂管10。
[0007]所述的海绵衬垫上容器孔数量较佳的为8个,容器孔在所述的海绵衬垫上分两排排列,每排4个,上述的装有胞苷脱氨酶基因多态性扩增检测反应液的试剂管为2ml试剂管,装有各类阳性对照和阴性对照的试剂管均为0.5ml试剂管。
[0008]上述的胞苷脱氨酶基因多态性扩增检测反应液主要包括DNA聚合酶、尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG酶)、特异性引物、探针、Mg2+和dUTP。
[0009]优选地,所述的阳性对照包括A79C野生型阳性对照、突变型阳性对照、杂合子阳性对照,G208A野生型阳性对照、突变型阳性对照、杂合子阳性对照。
[0010]本实用新型所述的所有阳性对照为本领域常规的阳性对照,本实用新型优选的为含有CDA基因DNA序列且包含相应多态性检测位点上游和下游检测引物及引物之间的基因组DNA序列的质粒。
[0011 ]优选地,所述CDA基因多态性检测引物包括:
[0012]厶79(:上游引物,其序列为:5’-丁厶0^厶0厶丁6600^6厶厶6(:-3’;
[0013]厶79(:下游引物,其序列为:5’-6(:11^00^66厶6666厶6厶厶-3’;
[0014]6208厶上游引物,其序列为:5’-丁厶6厶厶厶厶丁60^60^001;(:1'-3’;
[0015]6208厶下游引物,其序列为:5’-厶1'1'1^^6660厶厶1760^1^6(:-3’。
[0016]优选地,所述胞苷脱氨酶基因CDA单核苷酸多态性检测探针包括:
[0017]A79C野生型检测探针,其序列为:5 ’-TGCTCCCAGGAGGCCAAGAAGTCA-3 ’,其5 ’端标记物为J0E,3’标记物为BHQ1;
[0018]A79C突变型检测探针,其序列为:5 ’-TGCTCCCAGGAGGCCAAGCAGTCA-3 ’,其5 ’端标记物为CY5,3 ’标记物为BHQ2 ;
[0019]G208A野生型检测探针,其序列为:5 ’-AACGGACCGCTATCCAGAAGGCCGT-3 ’,其5 ’端标记物为ROX,3 ’标记物为BHQl ;
[0020]G208A突变型检测探针,其序列为:5 ’-AACGGACCACTATCCAGAAGGCCGT-3 ’,其5 ’端标记物为TAMRA,3 ’标记物为BHQ2。
[0021]本实用新型的保存温度优选的为-20°C,尽量减少反复冻融。
[0022]本实用新型较佳的应用方法为:
[0023]1.试剂准备:将待检样本的基因组DNA取5yL加入35yL PCR反应液中待扩增;
[0024]2.扩增检测:进行PCR扩增检测;
[0025]3.检测结果分析:在同时满足7个对照组标准的情况下,对样本检测结果进行分析。
[0026]优选地,所述的PCR扩增检测步骤包括:
[0027]1.荧光通道选择:每个样品选择JOE、CY5、ROX和TMRA 4个检测通道;
[0028]2.反应条件设定:反应体积设定为40yL,UNG酶反应条件为37 V加热5分钟,预变性条件为95°C加热5分钟,变性条件为95°C,15秒,以及退火、延伸及检测荧光条件为60°C,I分钟,共40个循环。
[0029]应用本实用新型的有益效果为:本实用新型提供的CDA基因单核苷酸多态性扩增检测试剂盒,通过使用优化设计的特异性检测引物和探针及PCR扩增检测反应条件,有效克服了常规检测方法步骤繁琐,假阳性和假阴性易出现的缺点,大大提高CDA基因单核苷酸多态性检测的特异性、敏感性。
[0030]本实用新型提供的CDA基因单核苷酸多态性扩增检测试剂盒设计合理,内部结构及各离心管排列有序,大小适宜,便于运输和使用。
【附图说明】
[0031]图1为本实用新型胞苷脱氨酶基因单核苷酸多态性检测试剂盒结构示意图;
[0032]图2为本实用新型检测A79C位点野生型、G208A位点野生型样本结果示意图,其中a为JOE通道检测曲线,c为ROX通道检测曲线;
[0033]图3为本实用新型检测A79C位点野生型、G208A位点突变型样本结果示意图,其中a为JOE通道检测曲线,d为TAMRA通道检测曲线;
[0034]图4为本实用新型检测A79C位点野生型、G208A位点杂合子样本结果示意图,其中a为JOE通道检测曲线,c为ROX通道检测曲线,d为TAMRA通道检测曲线;
[0035]图5为本实用新型检测A79C位点突变型、G208A位点野生型样本结果示意图,其中b为CY5通道检测曲线,c为ROX通道检测曲线;
[0036]图6为本实用新型检测A79C位点突变型、G208A位点突变型样本结果示意图,其中b为CY5通道检测曲线,d为TAMRA通道检测曲线;
[0037]图7为本实用新型检测A79C位点突变型、G208A位点杂合子结果示意图,其中b为CY5通道检测曲线,c为ROX通道检测曲线,d为TAMRA通道检测曲线;
[0038]图8为本实用新型检测A79C位点杂合子、G208A位点野生型结果示意图,其中a为JOE通道检测曲线,b*CY5通道检测曲线,c为ROX通道检测曲线;
[0039]图9为本实用新型检测A79C位点杂合子、G208A位点突变型样本结果示意图,其中a为JOE通道检测曲线,b*CY5通道检测曲线,d为TAMRA通道检测曲线;
[0040]图10为本实用新型检测A79C位点杂合子、G208A位点杂合子结果示意图,其中a为JOE通道检测曲线,b*CY5通道检测曲线,c为ROX通道检测曲线,d为TAMRA通道检测曲线。
【具体实施方式】
[0041]为了能够更清楚地描述本实用新型的技术内容,下面结合具体实施例来进行进一步的描述。
[0042]本实用新型所述的胞苷脱氨酶基因CDA单核苷酸多态性检测试剂盒包括胞苷脱氨酶基因⑶A单核苷酸多态性检测反应液、A79C和G208A两个检测位点的野生型阳性对照、突变型阳性对照、杂合子阳性对照以及阴性对照。
[0043]所述的阳性对照为本领域常规的阳性对照,本实用新型优选的为含有CDA基因DNA序列且包含相应多态性检测位点上游和下游检测引物及引物之间的基因组DNA序列的质粒,各试剂管中阳性对照的体积均为0.1ml,离心管规格为0.5ml。
[0044]所述的阴性对照为去离子水
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