一种检测胞外蛋白酶酪蛋白水解活性及耐热性的试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本实用新型涉及微生物技术领域，特别涉及一种检测胞外蛋白酶酪蛋白水解活性 及耐热性的试剂盒。
【背景技术】
[0002] 微生物在牛乳生产链过程中分泌的胞外耐热蛋白酶会导致牛乳及制品产生凝胶， 沉淀和变苦。现有的脱脂乳平板筛查技术，利用向培养基中添加脱脂乳，通过对微生物的培 养，观察是否有水解圈的形成来判断微生物的酪蛋白水解活力，操作简单，但是只能检测微 生物是否有酪蛋白水解活力，而不能精确定量地检测和比较酪蛋白水解活力。现有的偶氮 酪蛋白检测技术，利用微生物对偶氮酪蛋白底物的降解，释放具有特定紫外吸收波长的产 物，通过检测产物的紫外吸收值，同时结合检测菌体生长浓度，可以实现对微生物酪蛋白水 解活力的定量检测，但是由于需要同时检测菌体浓度，导致检测过程复杂且不能实现批量 检测。最近报道的偶氮酪蛋白检测技术直接对培养基上清进行检测，可以不依赖菌体浓度， 能够对胞外蛋白酶的酪蛋白水解活力定量测试，但未能对其酪蛋白水解活力及耐热性同时 进行定量、批量检测未能实现对胞外蛋白耐热性的检测，且在菌株复壮培养中，培养基体积 在5-8毫升，需要用试管培养，不利于批量操作。 【实用新型内容】
[0003] 本实用新型要解决的技术问题是为了克服现有技术中检测胞外蛋白酶酪蛋白水 解活性时不能同时批量地检测胞外蛋白酶耐热性的缺陷，提供了一种检测胞外蛋白酶酪蛋 白水解活性及耐热性的试剂盒。本实用新型试剂盒可以同时对微生物胞外蛋白酶酪蛋白水 解活性及耐热性进行定量测试，通过得到的不同样品之间的酪蛋白水解活性差异和耐热性 差异可以更加精确比较菌株之间的差异。
[0004] 本实用新型是通过下述技术方案来解决上述技术问题：
[0005] -种检测胞外蛋白酶酪蛋白水解活性及耐热性的试剂盒，其包括:盒盖、盒体、衬 垫、装有偶氮酪蛋白溶液的容器、装有三氯乙酸溶液的容器、装有氢氧化钠溶液的容器和酶 标板，所述衬垫设置于所述盒体内，所述衬垫上设有容器孔和槽，所述装有偶氮酪蛋白溶液 的容器和所述三氯乙酸溶液的容器置于所述容器孔内，所述酶标板置于所述槽内。
[0006] 所述偶氮酪蛋白溶液可以为本领域常规的偶氮酪蛋白溶液，所述偶氮酪蛋白溶液 较佳地含有偶氮酪蛋白、3-吗啉丙磺酸(MOPS)和氯化钙，更佳的含有5g/L偶氮酪蛋白、50mM 3-吗啉丙磺酸(MOPS)pH 6.7和ImM氯化钙。所述三氯乙酸可以为本领域常规的三氯乙酸溶 液，较佳地为2M三氯乙酸溶液。所述氢氧化钠溶液可以为本领域常规的氢氧化钠溶液，较佳 地为1M氢氧化钠溶液。所述酶标板为本领域常规的酶标板，较佳地为96孔酶标板或384孔酶 标板，更佳地为96孔酶标板。所述容器为本领域常规的容器，较佳地为塑料试剂瓶或离心 管，更佳地为1.5mL离心管。所述容器孔的数量为一个到多个，较佳地为3个或4个。
[0007] 所述试剂盒较佳地还可以包括装有细菌培养基的容器，所述细菌培养基可以为本 领域常规的细菌培养基，较佳地为MPC培养基，所述MPC培养基包括5 . Og/L胰化蛋白胨、 2.5g/L酵母提取物和1.0g/L葡萄糖。所述细菌培养基可以用于对待检测的细菌样品进行复 壮培养。
[0008] 所述试剂盒较佳地还可以包括使用说明书，所述使用说明书记载使用所述试剂盒 同时、批量检测微生物胞外蛋白酶酪蛋白水解活性及耐热性的方法，该方法包括以下步骤：
[0009] (1)将微生物培养液离心、取上清液；
[0010] (2)将一部分步骤（1)所述上清液90-100°C加热l-3min，得经过热处理的上清液， 剩余的步骤(1)所述上清液为未经过热处理的上清液；
[0011] (3)将步骤（2)中所述经过与未经过热处理的上清液与反应缓冲液按体积比1: 0.5-1: 2分别混合，所述反应缓冲液的组分为2-4.5g/L偶氮酪蛋白、25-45mM吗啉丙磺酸 (MOPS)和1.5-3mM氯化钙，35-45 °C反应2-3h，加入1.5-3M三氯乙酸溶液或三氟乙酸终止反 应，离心，取上清转移至多孔板，向所述上清中加入强碱溶液至强碱终浓度为0.2-0.5M，分 别检测450nm吸光值；
[0012] (4)将步骤(3)所得450nm吸光值分别换算为步骤(2)所述经过热处理与未经过热 处理的上清液中的胞外蛋白酶酪蛋白水解活性，所述换算的方法为将样品在450nm处的吸 光值减去空白对照在450nm的吸光值得吸光值增值，再将所述吸光值增值换算为每毫升样 品每小时的吸光值增值即得所述胞外蛋白酶酪蛋白水解活性;所述胞外蛋白酶的耐热性为 所得经过热处理与未经过热处理的上清液中的胞外蛋白酶酪蛋白水解活性的比值。
[0013] 本实用新型的积极进步效果在于:本实用新型试剂盒1)可以同时对微生物胞外蛋 白酶酪蛋白水解活性及耐热性进行定量测试，通过得到的不同样品之间的胞外蛋白酶酪蛋 白水解活性和耐热性差异可以更加精确比较菌株之间的差异;2)所有处理操作，都可以在 1.5ml的离心管中进行，节省了试管到离心管的转移步骤，菌株培养以及处理后可以直接离 心，使得操作更加便捷;3)节省了培养基的使用;4)通过酶标板的使用能够实现批量操作； 5)不需要考虑菌体浓度，可以直接检测菌液上清，比较一定体积单位中胞外蛋白酶酪蛋白 水解活性及耐热性。
【附图说明】
[0014] 图1为本实用新型实施例1和2中的检测胞外蛋白酶酪蛋白水解活性及耐热性的试 剂盒的结构示意图俯视图，其中，1为盒盖，2为盒体，3为衬垫，4为装有偶氮酪蛋白溶液的容 器，5为装有三氯乙酸溶液的容器，6为装有氢氧化钠溶液的容器，7为96孔酶标板，8为槽。装 有偶氮酪蛋白溶液的容器4、装有三氯乙酸溶液的容器5、装有氢氧化钠溶液的容器6和装有 细菌培养基的容器7置于容器孔内，96孔酶标板7置于槽8内。
【具体实施方式】
[0015] 下面举个较佳实施例，并结合附图来更清楚完整地说明本实用新型。
[0016] 本实用新型实施例中用到的培养基如下：
[0017] MPC培养基:5. Og/L胰化蛋白胨、2.5g/L酵母提取物和1. Og/L葡萄糖
[0018] MPC固体培养基:在上述MPC培养基中加入脱脂乳粉至lg/L，琼脂至18g/L，调pH值 7·0±0· 1，115°C灭菌 15min
[0019] 灭菌脱脂乳:取lOg脱脂乳粉溶于1L水中，115°C，15min灭菌即得
[0020]本实用新型中以下实施例所用到的菌株均为假单胞菌(Pseudomonas sp)，编号分 别为 N2-3、N5-3、N9-2、M41、M46、J937、N96、D11、D13、M13、N97、D62、D72、D81、D104、D15、D19、 044、1435、1436、1737、021、022、046、084、0105、仰35、1225和町1。以上菌株由本实验室从原 料乳中分离获得，分离方法包括以下步骤:对原料乳用无菌水进行梯度稀释，取1〇_2~1〇_5 四个稀释度样品各l〇〇yL，涂布于MPC固体培养基上，挑单菌落划线，重复两次，所得的菌株 即为实验菌株。
[0021] 实施例1
[0022] -种检测胞外蛋白酶酪蛋白水解活性及耐热性的试剂盒，其形状和结构如图1所 示，其包括:盒盖1、盒体2、衬垫3、装有偶氮酪蛋白溶液的容器4、装有三氯乙酸溶液的容器 5、装有氢氧化钠溶液的容器6和96孔酶标板7,所述装有偶氮酪蛋白的容器4、装有三氯乙酸 溶液的容器5和装有氢氧化钠溶液的容器6嵌入3个容器孔内，所述96孔酶标板7置于槽8内。 装有偶氮酪蛋白溶液的容器4中为含有5g/L偶氮酪蛋白、50mM MOPS pH6.7和ImM氯化钙的 溶液，装有三氯乙酸溶液的容器5中为2M三氯乙酸溶液，装有氢氧化钠溶液的容器6中为1M NaOH溶液。该试剂盒还包括使用说明书，使用说明书记载了使用所述试剂盒同时、批量检测 微生物胞外蛋白酶酪蛋白水解活性及耐热性的方法。
[0023] 实施例2用实施例1试剂盒检测一般细菌胞外蛋白酶酪蛋白水解活性及耐热性
[0024] (1)将冻存的假单胞菌菌株N2-3、N5-3和N9-2从-20 °C冰箱中取出置于冰盒上，以 2%体积比的接种量接种到含lmLMPC培养基的EP管中，30°C培养箱200rpm振荡复壮培养 24h，得复壮细菌培养液;取所述复壮细菌培养液100yL转接至含lmL灭菌脱脂乳的EP管中30 °C 200rpm振荡培养48h，将培养好的菌液25 °C 12000rpm离心15min，得上清液；
[0025] (2)取100yL步骤（1)上清液于金属浴中100°C加热2min，4°C冷却30s后，另取100yL 步骤(1)上清液不加热备用；
[0026] (3)将步骤(2)经过加热与未经加热的上清液分别与反应缓冲液100yL混合，40°C 反应2h，所述反应缓冲液的组分为4.5g/L偶氮酪蛋白、45mMM0PS和1.5mM氯化钙。两组样品 均用20yL2M的三氯乙酸终止反应，25°C10000rpm离心15min;取离心后的上清150yL至96孔 细胞培养板中，加50yL 1M氢氧化钠溶液，立即用酶标仪测450nm的吸光值；
[0027] (4)将步骤(3)测得的样品吸光值减去同一空白样品（菌液上清由去离子水替代） 的吸光值即得吸光值增值(DAhASOnm处每毫升样品每小时的吸光值增值即为蛋白酶活