一种快速检测凝结芽孢杆菌的多重pcr试剂盒的制作方法
【专利摘要】本实用新型具体涉及芽孢杆菌的检测技术，本实用新型的目的是提供一种快速检测凝结芽孢杆菌的多重PCR试剂盒，使用该试剂盒检测快速准确，敏感性高，且操作简单成本低。一种快速检测凝结芽孢杆菌的多重PCR试剂盒，包括盒体。所述盒体内包含装有coag基因正向引物的coag-F引物试剂容器和装有coag基因反向引物的coag-R引物试剂容器；包含装有coaK基因正向引物的coaK-F引物试剂容器和装有coaK基因反向引物的coaK-R引物试剂容器。本实用新型提供的试剂盒中包含多个装有检测所需试剂的试剂容器，便于检测时使用，能快速检测出样品中是否存在凝结芽孢杆菌。
【专利说明】
-种快速检测凝结芽抱杆菌的多重PCR试剂盒
技术领域
[0001] 本实用新型设及芽抱杆菌的检测技术，具体设及一种快速检测凝结芽抱杆菌的多 重PCR试剂盒。
【背景技术】
[0002] 凝结芽抱杆菌(Bacillus coagulans)为革兰氏阳性菌，菌体呈杆状，芽抱端生，可 发酵糖类产生k乳酸，所W又被称为"有抱子性乳酸菌"。由于菌株自身的安全性、有效性、 经济性和环境友好性，成为我国农业部《饲料添加剂品种目录》(2008)批准使用的新型微生 物饲料添加剂。凝结芽抱杆菌不仅具有普通乳酸菌的益生保健功能，还具较强的耐胃酸、耐 高溫高压、易培养和储存等优势，是益生菌领域中的后起之秀，被广泛应用于医疗、保健、食 品、畜禽及水产养殖等领域。
[0003] 目前，市场上凝结芽抱杆菌产品制剂较多，但缺乏规范的管理及科学的评估手段 和参数标准，使得一部分微生态制剂生产厂家提供的产品质量、价格参差不齐。市面上一些 厂家利用甲基营养型芽抱杆菌、解淀粉芽抱杆菌、枯草芽抱杆菌或地衣芽抱杆菌冒充凝结 芽抱杆菌高价售卖，牟取暴利，严重影响了用户对该类产品的选择。因而，建立一种快速、高 效、准确的鉴定方法显得非常重要。
[0004] 近年来分子生物学技术的快速发展，已有应用PCR技术和环介导等溫扩增技术，检 测凝结芽抱杆菌的方法。CN102533743B"-种用于扩增凝结芽抱杆菌的特异性引物及其应 用"，公开了通过特异性的扩增ComK基因来检测凝结芽抱杆菌的方法，用该方法扩增凝结芽 抱可获得400bp的特异性片段，扩增炭痘芽抱杆菌、蜡样芽胞杆菌、枯草芽抱杆菌、红球菌 时，则无特异性片段。该检测方法仅扩增凝结芽抱杆菌的一段基因序列，易出现假阳性。
[0005] CN104152543A"-种凝结芽抱杆菌检测引物组、试剂盒及其方法"，用该方法能从 凝结芽抱杆菌DNA中扩增出大量的梯度大小核酸片段，而未能从其他属细菌DNA中扩增出核 酸片段。所述其他属细菌为枯草芽胞杆菌、蜡状芽抱杆菌、地衣芽抱杆菌、巨大芽抱杆菌和 大肠杆菌标准株。
[0006] 然而与凝结芽抱杆菌分子序列相似度较高的甲基营养型芽抱杆菌与解淀粉芽抱 杆菌，在上述方法中均没有进行检测，难W保证检测方法的准确性。此外，巧光定量PCR和环 介导等溫扩增技术，存在仪器昂贵、人员要求较高或难定量、非特异性高等缺陷。
【发明内容】
[0007] 本实用新型的目的是提供一种快速检测凝结芽抱杆菌的多重PC时式剂盒，使用该 试剂盒检测快速准确，敏感性高，且操作简单成本低。
[000引为实现上述发明目的，本实用新型所采用的技术方案是:一种快速检测凝结芽抱 杆菌的多重PC时式剂盒，包括盒体。所述盒体内包含装有PCR扩增引物的引物试剂容器;所述 引物试剂容器有两组，一组为coag基因引物组，包含装有coag基因正向引物的coag-F引物 试剂容器和装有coag基因反向引物的coag-R引物试剂容器；另一组为CoaK基因引物组，包 含装有coaK基因正向引物的coaK-F引物试剂容器和装有coaK基因反向引物的coaK-R引物 试剂容器。
[0009]其中，所述引物序号可W如下：
[00 …]coag-F:GAAGAAATCGGGATGGTG
[0011] coag-R：CGTTTGAGGACAAGGAGC
[0012] comK-F：ACTTTGGAAGCGATTACG
[0013] comK-R：CCCTGTATCCCTGTTGTT
[0014] 当然，具体的引物也可W是采用其他具体产品替换。
[0015] 优选的，所述盒体内还包含PCR反应试剂容器，阳性对照样品试剂容器及阴性对照 样品试剂容器。
[0016] 优选的，所述盒体内设置衬垫，衬垫上设有孔桐;所述孔桐与所述的试剂容器形状 相吻合，用于放置试剂容器。
[0017] 优选的，所述Coag基因引物组的试剂容器规格小于COaK基因引物组的试剂容器。
[0018] 优选的，所述coag-F引物试剂容器和CoaK-F引物试剂容器配套有相似的容器盖； 所述coag-R引物试剂容器和CoaK-R引物试剂容器配套有相似的容器盖;所述coag-F引物试 剂容器和coag-R引物试剂容器上的容器盖相区别。
[0019] 优选的，所述试剂容器为带有密封盖的锥形离屯、管。
[0020] 优选的，所述衬垫包括两层，分别为上层的海绵衬垫和下层的塑料衬垫;所述塑料 衬垫上设有与离屯、管下部相吻合的锥形孔桐，所述海绵衬垫上设有与离屯、管中部相吻合的 圆形孔桐。
[0021] 本实用新型具有W下有益效果:本实用新型提供的试剂盒中包含多个装有检测所 需试剂的试剂容器，便于检测时使用。使用该试剂盒能快速检测出样品中是否存在凝结芽 抱杆菌，且操作简单成本低。试剂盒中提供的扩增引物可W特异的扩增凝结芽抱杆菌基因 组中的coag基因和ComK基因序列，而不会扩增得到其他细菌的基因片段，特异性强。
【附图说明】
[0022] 图1为本实用新型的结构示意图。
【具体实施方式】
[0023] 如图1所示的，一种快速检测凝结芽抱杆菌的多重PC时式剂盒，包括盒体1。所述盒 体1内包含装有PCR扩增引物的引物试剂容器;所述引物试剂容器有两组，一组为coag基因 引物组，包含装有coag基因正向引物的coag-F引物试剂容器2和装有coag基因反向引物的 coag-R引物试剂容器3;另一组为coaK基因引物组，包含装有coaK基因正向引物的CoaK-F引 物试剂容器4和装有coaK基因反向引物的CoaK-R引物试剂容器5。本实用新型提供的试剂盒 中包含多个装有检测所需试剂的试剂容器，便于检测时使用，能快速检测出样品中是否存 在凝结芽抱杆菌。
[0024] 其中，所述引物序号可W如下：
[00 巧]coag-F:GAAGAAATCGGGATGGTG [00%] coag-R:CGTTTGAGGACAAGGAGC
[0027] comK-F：ACTTTGGAAGCGATTACG
[0028] comK-R：CCCTGTATCCCTGTTGTT
[0029] 上述引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
[0030] 试剂盒中提供的扩增引物可W特异的扩增凝结芽抱杆菌基因组中的Coag基因和 ComK基因序列，而不会扩增得到其他细菌的基因片段，特异性强。特别是与凝结芽抱杆菌分 子序列相似度较高的甲基营养型芽抱杆菌与解淀粉芽抱杆菌，不能扩增得到基因片段。能 够准确、有效的检测出待检样品中是否存在凝结芽抱杆菌。
[0031] 优选的，所述盒体1内还包含PCR反应试剂容器6,阳性对照样品试剂容器7及阴性 对照样品试剂容器8。所述盒体1内设置衬垫9,衬垫9上设有孔桐;所述孔桐与所述的试剂容 器形状相吻合，用于放置试剂容器。试剂盒内包含检测时所用的试剂，便于扩增体系的配 置，有效提高检测效率。检测时所用coag基因引物量少于CoaK基因引物量，因此更好的是， 所述coag基因引物组的试剂容器规格小于CoaK基因引物组的试剂容器，并且其容积比例为 1:5,与实际用量比例相一致。
[0032] 所述coag-F引物试剂容器巧PcoaK-F引物试剂容器4配套有相似的容器盖;所述 coag-R引物试剂容器3和CoaK-R引物试剂容器5配套有相似的容器盖;所述coag-F引物试剂 容器2和coag-R引物试剂容器3上的容器盖相区别。所述区别可W是容器盖颜色上的区别， 例如coag-F引物试剂容器2和CoaK-F引物试剂容器4配套有红色的容器盖，coag-R引物试剂 容器3和CoaK-R引物试剂容器5配套有绿色的容器盖。或者是容器盖形状的区别，如圆形、楠 圆形、矩形等。也可W是贴有不同的标签，均能实现有效区分。运样通过容器的规格及容器 盖的区别，能有效区分运四个引物试剂容器，避免因混淆而引起的操作失误，保证操作及 结果的正确性。
[0033] 所述试剂容器为带有密封盖的锥形离屯、管。所述衬垫9包括两层，分别为上层的海 绵衬垫10和下层的塑料衬垫11;所述塑料衬垫11上设置与离屯、管下部相吻合的锥形孔桐， 所述海绵衬垫10上设置与离屯、管中部相吻合的圆形孔桐。下层的塑料衬垫11可W固定离屯、 管的位置，上层的海绵衬垫10能起到很好的保护作用，避免运输途中的磕碰破损。
[0034] 本实用新型所提供试剂盒的使用方法如下：
[0035] 1.提取样品DNA
[0036] 2. PCR 扩增
[0037] 取步骤1提取的样品DNA作为DNA模板，用PCR扩增引物进行扩增，使用试剂盒进行 PCR总体系的配置。
[003引PCR总体系为25化，各组分含量分别为： 10XPCR Mix 12.日 wL dd 11,0 9.1 U L D臟模板 1.0 U L
[0039] coag-F 0.2 uL CQag-R 0. 2 U L comK-F 1.0 U L CQfflK-R 1.0 U L
[0040] 反应程序:94°C预变性10min，94°C变性30s，54°C退火30s，72°C延伸Imin，扩增30 个循环，最后72°C溫育5min。
[0041 ] 3.结果检测
[0042] 取扣L扩增产物，采用1%的琼脂糖凝胶电泳，在恒压120V条件下电泳45min，置于 凝胶成像系统下观察PCR扩增结果。只有检测电泳图出现两条清晰条带，且大小分别约为 345bp与769bp时，样品中存在凝结芽抱杆菌。
[0043] 实施例1
[0044] 引物特异性实验
[0045] -、实验方法
[0046] 1. DNA模板制备
[0047] 按照无菌操作要求，分别培养各类细菌并提取DNA。具体如下：
[004引a.凝结芽抱杆菌标准株(CICC 20138)、解淀粉芽抱杆菌和甲基营养型芽抱杆菌： 接种至凝结芽抱杆菌液体培养基，37 °C恒溫静置培养36h，取2mL菌夜提取DNA，制备DAN模 板；
[0049] b.葡萄球菌、枯草芽抱杆菌和地衣芽抱杆菌:接种至LB液体培养基，37°C恒溫振荡 培养(180r/min) 24h，取2mL菌夜提取DNA，制备DAN模板；
[0050] C.粪肠球菌、嗜酸乳杆菌和唾液乳杆菌:接种至MRS液体培养基中，37°C恒溫静置 培养2地，取2mL菌夜提取DNA，制备DAN模板。
[0051] 各株细菌DNA提取操作步骤如下：
[0化2] (1)取培养的细菌菌液4mL，10 0(K)r/min离屯、Imin,尽量吸尽上清液。
[0053] (2)向菌体沉淀中加入20化L缓冲液(称取20mg的溶菌酶溶解在ImL TE缓冲液中， 审IJ成终浓度为20mg/mL的溶菌酶液，0.22皿微孔过滤后保存备用），37°C处理40min。
[0化4] (3)向管中加入20化Proteinase K溶液，混匀。
[0055] (4)加入22化L缓冲液GB，振荡15s，70°C放置IOmin，溶液变清亮，简短离屯、，去除管 盖内壁水珠。
[0056] (5)加入22化L无水乙醇，充分振荡15s，此时可能会出现絮状沉淀。
[0057] (6)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管 中），12 0(K)r/min离屯、30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
[0化引 （7)向吸附柱CB3中加入5(K)化缓冲液GD(使用前已加入无水乙醇），12 OOOr/min 离屯、30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
[0化9] (8)向吸附柱CB3中加入60化L漂洗液PW(使用前已加入无水乙醇），12 0(K)r/min离 屯、30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
[0060] (9)重复操作步骤(8)。
[0061 ] (10)将吸附柱CB3放回收集管中，12 00化/min离屯、2min，倒掉废液，将吸附柱CB3 置于室溫放置数分钟，W彻底惊干吸附材料中残留的漂洗液。
[0062] (11)将吸附柱CB3转入一个干净的离屯、管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加10化L 无菌双蒸水，室溫放置5min，12 00化/min离屯、2min，将溶液收集到离屯、管中。
[00创 2. PCR扩增
[0064] 取步骤1所制备的DNA模板，用PCR扩增引物进行扩增。
[0065] PCR总体系为2如L，各组分含量分别为： IOXPCR Mix 12.日 UL dd 11,0 9. 1 WL DNA 模板 1.0 PL
[0066] coag-F 0.2 P L coag-R 0. 2 W L comK-F I. 0 P L CO曲K-民 1. 0 P L
[0067] 反应程序:94°C预变性10min，94°C变性30s，54°C退火30s，72°C延伸Imin，扩增30 个循环，最后72°C溫育5min。
[0068] 3.结果检测
[0069] 取扣L PCR扩增产物，采用1 %的琼脂糖凝胶电泳，在恒压120V条件下电泳45min， 置于凝胶成像系统下观察PCR扩增结果。
[0070] 二、结果
[0071] 1号泳道为凝结芽抱杆菌标准株(CICC 20138)的扩增结果;2-9号泳道分别为解 淀粉芽抱杆菌、甲基营养型芽抱杆菌、葡萄球菌、枯草芽抱杆菌、地衣芽抱杆菌、粪肠球菌、 嗜酸乳杆菌和唾液乳杆菌的扩增结果。
[0072] 仅有凝结芽抱杆菌标准菌株（CICC 20138)出现两条清晰条带，大小分别约为 345bp与769bp。虽然其他菌株能扩增得到一定条带，但所有对照菌株均不能扩增到目的条 带。
[0073] 本实例表明了本实用新型提供的试剂盒检测凝结芽抱杆菌的特异性强，可W准确 的将凝结芽抱杆菌与其他芽抱杆菌或乳酸菌准确的区别开，特别是与凝结芽抱杆菌分子序 列相似度较高的甲基营养型芽抱杆菌与解淀粉芽抱杆菌。
[0074] 实施例2
[0075] 引物灵敏性实验
[0076] 一、实验方法
[0077] I. DNA模板制备
[0078] 按照无菌操作要求，将凝结芽抱杆菌标准菌株(CICC 20138)接种于凝结芽抱杆菌 培养液体培养基，37 °C恒溫静置培养36h，取2mL菌液提取DNA。细菌基因组DNA提取操作步骤 如下：
[00巧](1)取培养的细菌菌液4mL，10 0(K)r/min离屯、Imin,尽量吸尽上清液。
[0080] (2)向菌体沉淀中加入20化L缓冲液(称取20mg的溶菌酶溶解在ImL TE缓冲液中， 审IJ成终浓度为20mg/mL的溶菌酶液，0.22皿微孔过滤后保存备用），37°C处理40min。
[0081 ] (3)向管中加入20化Proteinase K溶液，混匀。
[0082] (4)加入220化缓冲液GB，振荡15s，70°C放置IOmin，溶液变清亮，简短离屯、，去除管 盖内壁水珠。
[0083] (5)加入22化L无水乙醇，充分振荡15s，此时可能会出现絮状沉淀。
[0084] (6)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管 中），12 0(K)r/min离屯、30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
[00化](7)向吸附柱CB3中加入50化L缓冲液GD(使用前已加入无水乙醇），12 0(K)r/min离 屯、30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
[00化](8)向吸附柱CB3中加入60化L漂洗液PW(使用前已加入无水乙醇），12 0(K)r/min离 屯、30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
[0087] (9)重复操作步骤(8)。
[0088] (10)将吸附柱CB3放回收集管中，12 00化/min离屯、2min，倒掉废液，将吸附柱CB3 置于室溫放置数分钟，W彻底惊干吸附材料中残留的漂洗液。
[0089] (11)将吸附柱CB3转入一个干净的离屯、管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加10化L 无菌双蒸水，室溫放置5min，12 00化/min离屯、2min，将溶液收集到离屯、管中。
[0090] 测定提取的细菌基因组DNA浓度，确定浓度后，对DNA样品依次按照10倍、20倍、50 倍、IO2倍、IO 3倍、IO4倍、IO5倍、IO6倍、IO7倍进行稀释后，制备DNA模板。
[00川 2. PCR扩增
[0092]取步骤1所制备的DNA模板，用PCR扩增引物进行扩增。
[009引PCR总体系为25化，各组分含量分别为： 10 乂P邸 Mix 12.日 IiL Cid ILO 9. 1 UL DNA 模板 1.0 PL
[0094] coag-F 0.2 P L coag-R 0. 2 W L comK-F I. 0 P L comK-R 1.0 y L
[0095] 反应程序:94°C预变性10min，94°C变性30s，54°C退火30s，72°C延伸Imin，扩增30 个循环，最后72°C溫育5min。
[0096] 3.结果检测
[0097] 取扣L扩增产物，采用1%的琼脂糖凝胶电泳，在恒压120V条件下电泳45min，置于 凝胶成像系统下观察PCR扩增结果。
[009引二、结果
[0099] 凝结芽抱杆菌DNA浓度测定结果为78ngAiL，因此稀释后浓度依次为7. SngAiU 3.化g/化、1.56ngAiL、7.8 X 1 Q-Vg/化、7.8 X 1 〇-2ng/化、7.8 X 1 〇-3ng/化、7.8 X 1 〇-4〇邑/化、 7.8 X 1 〇-5雌/化、7.8 X 1 〇-6叫/化。
[0100] 结果1-5号泳道均能出现清晰条带，5号泳道所对应的浓度为7.8X ICT2IigAiL。因此 可准确测定凝结芽抱杆菌的最低模板浓度为7.8 X l(T2ngAiL。即使用本实用新型提供的试 剂盒检测待检样本可准确检测凝结芽抱杆菌浓度不低于1.6 X IO4C化/mL的待检样品。
[0101] 本实例表明了本实用新型提供的试剂盒检测凝结芽抱杆菌的灵敏度高。
【主权项】
1. 一种快速检测凝结芽孢杆菌的多重PCR试剂盒，包括盒体（1)，其特征在于:所述盒体 (1) 内包含装有PCR扩增引物的引物试剂容器;所述引物试剂容器有两组，一组为coag基因 引物组，包含装有coag基因正向引物的coag-F引物试剂容器(2)和装有coag基因反向引物 的coag-R引物试剂容器（3);另一组为coaK基因引物组，包含装有coaK基因正向引物的 coaK-F引物试剂容器(4)和装有coaK基因反向引物的coaK-R引物试剂容器(5)。2. 根据权利要求1所述的快速检测凝结芽孢杆菌的多重PCR试剂盒，其特征在于:所述 盒体(1)内还包含PCR反应试剂容器(6)，阳性对照样品试剂容器(7)及阴性对照样品试剂容 器(8) 〇3. 根据权利要求1所述的快速检测凝结芽孢杆菌的多重PCR试剂盒，其特征在于:所述 盒体（1)内设置衬垫(9)，衬垫(9)上设有孔洞;所述孔洞与所述的试剂容器形状相吻合，用 于放置试剂容器。4. 根据权利要求1所述的快速检测凝结芽孢杆菌的多重PCR试剂盒，其特征在于:所述 coag基因引物组的试剂容器规格小于coaK基因引物组的试剂容器。5. 根据权利要求4所述的快速检测凝结芽孢杆菌的多重PCR试剂盒，其特征在于:所述 coag-F引物试剂容器(2)和coaK-F引物试剂容器(4)配套有相似的容器盖;所述coag-R引物 试剂容器（3)和coaK-R引物试剂容器（5)配套有相似的容器盖;所述coag-F引物试剂容器 (2) 和coag-R引物试剂容器(3)上的容器盖相区别。6. 根据权利要求3-5任意一项中所述的快速检测凝结芽孢杆菌的多重PCR试剂盒，其特 征在于:所述试剂容器为带有密封盖的锥形离心管。7. 根据权利要求3所述的快速检测凝结芽孢杆菌的多重PCR试剂盒，其特征在于:所述 衬垫(9)包括两层，分别为上层的海绵衬垫（10)和下层的塑料衬垫（11);所述塑料衬垫（11) 上设置与离心管下部相吻合的锥形孔洞，所述海绵衬垫（10)上设置与离心管中部相吻合的 圆形孔洞。
【文档编号】C12Q1/04GK205420443SQ201520905874
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2015年11月13日
【发明人】苟小兰, 黄丹, 苏艳秋, 刘梅, 罗国强
【申请人】通威股份有限公司