阿胶真伪多重pcr检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本实用新型公开了一种阿胶真伪多重PCR检测试剂盒。上述检测试剂盒包括盒盖、盒体、内填充冷冻剂、盒扣、盒扣孔、离心管槽孔、放置PCR酶的槽孔、放置PCR Buffer的槽孔、放置阿胶DNA的槽孔、放置正向通用引物P1的槽孔、放置反向通用引物P2的槽孔、放置驴特异性引物A的槽孔、放置马特异性引物B的槽孔、放置猪特异性引物C的槽孔、放置牛特异性引物D的槽孔、放置无菌的去离子水槽孔。本实用新型可同时检测阿胶中是否掺杂马、牛、猪动物源性成分；试剂盒包含PCR所需试剂，且在实验操作时间范围内能使试剂盒温度维持在零摄氏度以下，同时试剂盒还设有PCR离心管架，可直接在试剂盒上进行PCR体系构建，方便快捷，避免因来回拿放试剂造成试剂变性失活。
【专利说明】
阿胶真伪多重PCR检测试剂盒
技术领域
[0001]本实用新型涉及分子生物学食药检测技术领域，具体涉及阿胶真伪多重PCR检测试剂盒，可同时鉴别阿胶中是否掺杂有马、猪和牛源性成分。
【背景技术】
[0002]阿胶在中国有数千年的食用历史，最早记载于《神农本草经》，《本草纲目》中也有记载。2010版《中国药典》中载述:阿胶为马科动物驴的干燥皮或鲜皮经煎煮、浓缩制成的固体胶;呈长方形块、方形块或丁状，棕色至黑褐色，有光泽，质硬而脆，断面光亮，碎片对光照视呈棕色半透明状，气微，味微甘。阿胶因具有补血健身、滋阴润肺的功效，而备受人们青睐，需求量日益增长。与此同时，劣质阿胶(多用猪、牛、马等动物皮、骨、结缔组织熬制)屡见不鲜，给消费者造成巨大损失，这也给阿胶的真伪鉴别和质量控制提出了新的挑战。
[0003]传统的看、嗅、摸、灼烧等鉴别方法已不能达到应有效果，目前常见的鉴别方法有免疫化学法、差示扫描量热法、高效液相色谱质谱联用法、分子生物学法等等。考虑到目前尚无阿胶鉴别试剂盒，利用PCR的敏感性和特异性，特开发一种阿胶真伪多重PCR检测试剂盒，其优点是采用多重PCR法使用多对引物，实现一次PCR可以扩增多个序列，即一次性鉴别阿胶中是否掺杂马、牛和猪源性成分。
[0004]采用分子生物学方法进行鉴别阿胶的另一个技术难点在于，目前用于检测阿胶真伪的各个试剂都是分散包装在不同的试剂盒内，当试验时，需将各试剂分别取出后放置在离心管架上，再进行后续的试验，来回拿取，温度的频繁变化容易造成试剂失活。此外，目前购买时各试剂都是包装在没有保温功能的包装盒里，购买后将其迅速放入冰箱冷藏，试验前再取出放置冰上，操作复杂麻烦。因此开发一种既能将试验所需试剂放置于同一且能够在试验时间范围内保冷的试剂盒中成为现在亟待解决的问题。
[0005]本实用新型旨在建立同时可以鉴别阿胶中是否掺杂马、牛和猪源性成分的多重PCR检测试剂盒，将PCR所需试剂置于一个试剂盒，操作简便快速，也可避免试剂因多次拿放造成反复冻融，以致变性失活。
【发明内容】
[0006]本实用新型目的在于提供一种阿胶真伪多重PCR检测试剂盒，该试剂盒可同时检测驴、马、牛、猪四种动物源性成分存在与否，从而断定阿胶是否掺假。该试剂盒包含PCR所需试剂，且在实验操作时间范围内能使试剂盒温度维持在零摄氏度以下，同时试剂盒还设有PCR离心管架，可直接在试剂盒上进行PCR体系构建，方便快捷，避免因来回拿放试剂造成试剂变性失活。
[0007]为实现上述目的，本实用新型采用以下技术方案:阿胶真伪多重PCR检测试剂盒包括盒盖1、盒体2、内填充冷冻剂3、盒扣4、盒扣孔5、离心管槽孔6、放置PCR酶的槽孔7、放置PCR Buffer的槽孔8、放置阿胶DNA的槽孔9，放置正向通用引物Pl的槽孔10、放置反向通用引物P2的槽孔11、放置驴特异性引物A的槽孔12、放置马特异性引物B的槽孔13、放置猪特异性引物C的槽孔14、放置牛特异性引物D的槽孔15和放置灭菌的去离子水槽孔16。
[0008]优选的，放置PCR酶的槽孔7含浓度为2.5UAU DNA Polymerase ΙΟΟμΙ、放置PCRBuffer的槽孔8含5 X PCR Mix Buffer I ml、放置阿胶DNA的槽孔9含0.5ngAU阿胶DNA50μ1，放置正向通用引物Pl的槽孔10含正向通用引物Pl、放置反向通用引物P2的槽孔11含反向通用引物Ρ2、放置驴特异性引物A的槽孔12含驴反向引物Α、放置马特异性引物B的槽孔13含马反向引物B、放置猪特异性引物C的槽孔14含猪反向引物C、放置牛特异性引物D的槽孔15含牛反向引物D，放置无菌的去离子水槽孔16含无菌去离子水1.5ml。
[0009]优选的，放置PCR酶的第一槽孔7、放置PCR Buffer的第二槽孔8、放置阿胶DNA的第三槽孔9，放置正向通用引物Pl的第四槽孔10、放置反向通用引物P2的第五槽孔11、放置驴特异性引物A的第六槽孔12、放置马特异性引物B的第七槽孔13、放置猪特异性引物C的第八槽孔14、放置牛特异性引物D的第九槽孔15和放置灭菌的去离子水的第十槽孔16都是最大放置1.5ml离心管的。
[0010]优选的，离心管槽孔6是PCR小离心管架，可以直接在试剂盒进行PCR体系构建，方便快捷。
[0011 ] 优选的，正向通用引物
[0012]反向通用引物P2 序列为 CTGGGTCTCCMAGMAGGTC;
[0013]驴特异反向引物A序列为TTTCACAGTAATAGCCACAGCAT；
[0014]马特异反向引物B序列为TCATCACAGCCCTGGTAGTCGTA;
[0015]猪特异反向引物C序列为GCCTTCCACTTTATCCTGCCATTC;
[0016]牛特异反向引物D序列为AGGCGGATTCTCAGTAGACAAAGC。
【附图说明】
[0017]图1为实用新型构造图。
[0018]图2为实用新型槽孔隔板可分离示意图。
[0019]其中，1.盒盖;2.盒体;3.内填充冷冻剂;4.盒扣;5.盒扣孔;6.离心管槽孔;7.放置PCR酶的槽孔;8.放置PCR Buf f er的槽孔;9.放置阿胶DNA的槽孔；10.放置正向通用引物Pl的槽孔;11.放置反向通用引物P2的槽孔;12.放置驴特异性引物A的槽孔;13.放置马特异性弓丨物B的槽孔;14.放置猪特异性引物C的槽孔;15.放置牛特异性引物D的槽孔;16.放置无菌的去离子水槽孔。
【具体实施方式】
[0020]使用阿胶真伪多重PCR检测试剂盒鉴别阿胶真伪的方法如下:
[0021 ] 1、使用动物组织DNA提取试剂盒或液氮研磨改良的SDS法提取待检阿胶DNA，电压I1V，浓度0.4琼脂糖凝胶电泳40min检测合格后，稀释至合适倍数，备用；
[0022]2、PCR反应体系构建
[0023]第一轮PCRDNA 模板Ιμ?
[0024]引物 PlΙμ?
[0025]引物 Ρ2Ιμ?
[0026]DNA Polymerase0.2μ1
[0027]5 X PCR Mix Buffer 2μ1
[0028]CldH2O4.8μ1
[0029]第二轮PCRDNA 模板 Ιμ?
[0030]引物 Pl2μ1
[0031]引物A0.5μ1
[0032]引物B0.5μ1
[0033]引物C0.5μ1
[0034]引物D0.5μ1
[0035]DNA Polymerase0.2μ1
[0036]5 X PCR Mix Buffer 2μ1
[0037]CldH2O2.8μ1
[0038]3、PCR反应条件
[0039]退火温度反应循环数延伸时间
[0040]第一轮PCR50 0C 257min[0041 ]第二轮 PCR48 0C 30 1min
[0042]4、琼脂糖凝胶电泳
[0043]取最终PCR产物5μ1上样，电压110V，浓度1.0琼脂糖凝胶电泳4011^11后观染色后观察条带大小，根据条带大小判断阿胶所掺杂的动物源性成分。
[0044]综上所述，本实用新型的【具体实施方式】仅提供最佳的实施方式，本实用新型的技术内容和特点如上，本实用新型的保护范围不限于实施例所揭示的技术内容，故凡依本实用新型的形状、构造及原理所做的替换修饰，均涵盖在本实用新型的保护范围内。
【主权项】
1.阿胶真伪多重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述检测用试剂盒包括盒盖(I)、盒体(2)、内填充冷冻剂(3)、盒扣(4)、盒扣孔(5)、离心管槽孔(6)、放置PCR酶的槽孔(7)、放置PCR Buffed^槽孔(8)、放置阿胶DNA的槽孔(9)，放置正向通用引物PI的槽孔(1)、放置反向通用引物P2的槽孔(11)、放置驴特异性引物A的槽孔(12)、放置马特异性引物B的槽孔(13)、放置猪特异性引物C的槽孔(14)、放置牛特异性引物D的槽孔(15)和放置灭菌的去离子水槽孔(16);盒盖(I)与盒体(2)紧密连接，盒体(2)内部中空用于放置冷冻剂，所有槽孔都在一个平面隔板上且隔板可以和盒体(2)分离，便于放置冷冻剂。2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于所述盒盖(I)和盒体(2)紧密连接，且两部分都聚乙烯保温材料制成，盒体(2)内置冷冻剂，在实验操作过程中能使温度保持在零度以下。3.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于所述所有槽孔不封闭，使放置在上面的试剂与冷冻剂直接接触保持低温，从而保持试剂活性。
【文档编号】C12M1/34GK205473772SQ201520904853
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2015年11月13日
【发明人】张慧, 孙海新, 许娜, 范忠刚, 孙丕春
【申请人】山东世通检测评价技术服务有限公司