一种TRβ基因突变检测试剂盒的制作方法

文档序号:10791469阅读:584来源:国知局
一种TRβ基因突变检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本实用新型公开一种TRβ基因突变检测试剂盒,该试剂盒包括PCR缓冲液、酶溶液和外显子特异性扩增引物,其中该试剂盒中设置有5管PCR反应液、1管酶混合液和20管1?10号外显子特异性扩增引物母液。本实用新型给出的TRβ基因突变检测试剂盒引物通过专业设计和多次筛选,保证了引物特异性,同时引入UNG酶防污染系统,能够更加准确,稳定地对样品进行监测。使用本实用新型的TRβ基因突变检测方法利用特异性强,灵敏度高的扩增引物快速准确地检测TRβ基因突变,具有检测效率高,方法简单,结果准确,成本低等特点。
【专利说明】
-种TRP基因突变检测试剂盒
技术领域
[0001] 本实用新型设及一种检测试剂盒,特别是设及一种T祕基因突变检测试剂盒,属于 生物技术及医学领域。
【背景技术】
[0002] 甲状腺激素抵抗综合征(RTH)是由于甲状腺激素受体(TR)基因突变,导致祀器官 对甲状腺激素(TH)的敏感性降低,使得TH对全身组织器官作用障碍的一种综合征。目前认 为该病是一种常染色体显性或隐性遗传性疾病,有家族发病倾向,也有散发病例。根据突变 受体亚型不同,分为TRa基因突变致RTH(RTHa)和TRP基因突变致RTH(RT邮)。1967年 Ref etoff首次报道RT册,目前全世界共报道3000多RT册病例,RT地是一类罕见的内分泌疾 病,其中80%由T祕基因突变所致,W家族性发病多见,呈常染色体显性或隐性遗传。T祕基 因突变是确诊RT地的金标准。
[0003] RT册临床表现呈高度异质性,主要由于T郎基因缺陷的严重程度及各祀器官对TH 的依赖性和反应性不同。依据抵抗程度的组织分布,可分为全身型RT册、垂体型RT册。临床 可表现为甲亢(甲状腺高代谢症状)或甲减(乏力、怕冷和记忆力减退等)或无明显甲功异 常,或同时合并甲亢和甲减症状。临床医师易误诊为甲亢,予W抗甲状腺激素药物、放射性 舰治疗或合用kT4治疗,导致疾病症状加重,因此正确诊断很重要。
[0004] 目前临床诊断RT册主要通过kT3抑制实验和TRH兴奋试验,但由于国内不生产k T3和T畑,从国外购买困难,导致该疾病长期W来无法诊断。
[0005] 金婷等W31岁女患为研究对象,该患者W甲状腺肿就诊,伴屯、慌、出汗和月经减少 等甲亢症状;同时有血脂异常等甲减症状。停赛治1个月后甲状腺功能显示FT3和Fl'4升高, 而T甜不适当升高。L-T3抑制试验显示垂体组织和外周组织均存在不同程度的ra抵抗。基因 序发现患者T祕基因出现M442T突变。诊断为全身型RT册(T祕基因 M442T点突变的散发病 例)。2004年Bayer在国际上首次报道一个M442T突变家系,先证者表现为结节性甲状腺肿和 房颤(非屯、脏病因),FT3和FT4升高,T甜正常高限。目前国际上仅1例M442巧良道,国内尚无该 突变位点的报道。T地的M442T突变导致其T3依赖性转录活性受损,同时突变的T祕干扰正常 T祕的功能,即显性负效作用,运是M442T导致RT地发病的分子机制。
[0006] 综上,建议临床遇到血清FT3和Fl'4升高,而T甜正常或升高患者,或确诊为甲亢后 抗甲药治疗甲状腺功能一直不能恢复正常的患者,要警惕T祕基因突变,因此临床迫切需要 一种检测效率高,方法简单,结果准确,成本低的T祕基因突变检测试剂盒及检测方法,用W 提高RT地的确诊率。

【发明内容】

[0007] 本实用新型的目的就在于解决现有技术存在的上述问题,提供一种检测效率高, 方法简单,结果准确,成本低的T祕基因突变检测试剂盒,用W提高RT地的确诊率。
[000引本实用新型给出的技术方案是:一种T祕基因突变检测试剂盒,该试剂盒包括PCR 缓冲液、酶溶液和外显子特异性扩增引物,其中该试剂盒中设置有5管PCR反应液、I管酶混 合液和20管1-10号外显子特异性扩增引物母液。
[0009] 所述PCR缓冲液包括0.5mM的MgCh,0.5mM的dNTPs,其中 dNTPs表示dATP,dUTP, dGTP,dCTP。
[0010] 所述酶溶液为高保真化q酶和UNG酶。
[0011] 所述10对1-10号外显子特异性扩增引物编号为沈Q ID NO: 1和沈Q ID N0:2、SEQ 10側:3和沈910側:4、56910側:5和沈910側:6、56910側:7和沈910側:8、56910 NO:9和沈Q ID NO: 10、沈Q ID NO: 11 和沈Q ID NO: 12、SEQ ID NO: 13和沈Q ID NO: 14、沈Q ID NO: 15和沈Q ID NO: 16、沈Q ID NO: 17和沈Q ID NO: 18、沈Q ID NO: 19和沈Q ID NO:20。
[0012] 本实用新型还提供一种T祕基因突变检测方法,包括W下步骤。
[0013] (1)制备本实用新型的T祕基因突变检测试剂盒。
[0014] (2)提取待测样品,进行PCR反应。
[001引 (3 )PCR产物纯化测序,获得T祕基因突变检测结果。
[0016] 利用T祕基因 1-10号外显子特异性扩增引物对待测样品进行点突变检测,包括。
[0017] 利用所述扩增引物和待测样本建立PCR扩增反应体系和程序,获得PCR产物,纯化 后测序。
[001引所述PCR扩增反应体系如下。
[。0101
[0020]所述PCR扩增反应程序如下。
[0021]
[0022] 所述PCR产物纯化处理所用试剂可W为市面上任何一款PCR产物纯化试剂。
[0023] 所述PCR产物纯化处理后测序,经过对测序图谱的分析来确定T郎基因的突变与 否。
[0024] 与现有技术相比,本实用新型的有益效果是。
[0025] 本实用新型给出的运种T祕基因突变检测试剂盒引物通过专业设计和多次筛选, 保证了引物特异性,同时引入UNG酶防污染系统,能够更加准确,稳定地对样品进行监巧M吏 用本实用新型检测试剂盒的检测方法具有检测效率高,方法简单,结果准确,成本低等特 点,因此本实用新型具有实质性的技术效果,便与推广。
【附图说明】
[0026] 图1:T祕基因突变检测试剂盒的结构示意图。
[0027] 图2:患者T祕基因第10外显子部分测序图,患者T祕基因第10外显子的第442位密 码子处存在点突变,密码子由ATG改变为ACG,编码的蛋白质由蛋氨酸变为苏氨酸(M442T)。 进一步分析其基因测序图,该突变为杂合子突变。患者父母的T祕基因未发现该突变。
[002引图3.对实施例2的患者T祕全长外显子1-10进行PCR扩增及测序,A:患者,B:患者父 亲,C:患者母亲,D:患者姐姐,测序结果显示,患者第10号外显子的第453位密码子存在点突 变,密码子从CCT突变为ACT,导致其所编码的蛋白质由脯氨酸变为苏氨酸。而患者父母和姐 姐均未发现该突变。
[0029] 图中标记:1. PCR反应液,2.酶混合液,3 .外显子特异性扩增引物母液,4.试剂盒, 5.试剂架。
【具体实施方式】
[0030] W下通过特定的具体实例说明本实用新型的实施方式,本领域技术人员可由本说 明书所掲露的内容轻易地了解本实用新型的其他优点与功效。本实用新型还可W通过另外 不同的【具体实施方式】加 W实施或应用,本说明书中的各项细节也可W基于不同观点与应 用,在没有背离本实用新型的精神下进行各种修饰或改变。
[0031] 在进一步描述本实用新型【具体实施方式】之前,应理解,本实用新型的保护范围不 局限于下述特定的具体实施方案;还应当理解,本实用新型实施例中使用的术语是为了描 述特定的具体实施方案,而不是为了限制本实用新型的保护范围;在本实用新型说明书和 权利要求书中,除非文中另外明确指出,单数形式"一个"、"一"和"运个"包括复数形式。
[0032] 当实施例给出数值范围时,应理解,除非本实用新型另有说明,每个数值范围的两 个端点W及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义,本实用新型中使用的所 有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方 法、设备、材料外,根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本实用新型的记载,还 可W使用与本实用新型实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方 法、设备和材料来实现本实用新型。
[0033] 除非另外说明,本实用新型中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技 术领域的常规技术。
[0034] 本实用新型实施例提供一种TRP基因突变检测试剂盒,该试剂盒包括PCR缓冲液, 酶溶液,10对特异性扩增引物,其中10对特异性引物序列分别为SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2、沈Q ID NO:3和沈Q ID NO:4、SEQ ID NO:5和沈Q ID NO:6、SEQ ID NO:7和沈Q ID NO:8、 沈Q ID N0:9和沈Q ID NO: 10、沈Q ID NO: 11 和沈Q ID NO: 12、沈Q ID NO: 13和沈Q ID NO: 14、沈Q ID NO: 15和沈Q ID NO: 16、沈Q ID NO: 17和沈Q ID NO: 18、沈Q ID NO: 19和沈Q ID N0:20〇
[0035] 具体地,所述PCR缓冲液含有0.5mM的MgCb,0.5mM的dNTPs,其中dNTPs表示dATP, dUTP,dGTP,dCTP。
[0036] 具体地,所述10对特异性引物序列如表1所示。
[0037] 表110对特异性引物序列。
[00;3 引
[0039]
[0040] 优选地,本实用新型T祕基因突变检测特异性引物针对T祕基因 1-10号外显子设计 且通过多次筛选,保证了引物特异性。
[OOW 优选地,本实用新型实施例中的酶溶液中含有Taq酶,其为PCR反应所必需,且该酶 溶液还含有UNG酶,在PCR反应中,使用UNG酶可防非特异性PCR扩增污染。
[0042] 本实用新型还提供一种T地基因突变检测方法,包括W下步骤(1)制备如权利要求 1-9中任一项所述的T祕基因突变检测试剂盒;(2)取10只PCR管,分别向其中加入步骤(1)中 的PCR缓冲液、酶溶液;向所述10只PCR管中分别加入步骤(1)中的10对特异性引物;(3)提取 待测样品DNA,分别加入至所述10只PCR管中,进行PCR反应。
[0043] 具体地,上述步骤(2)中的PCR缓冲液包括1.0-5. OmM的MgCb,1.0-5. OmM的dNTPs, 即 dATP,dUTP,dGTP,dCTP各1.0-5.OmM。
[0044] 优选地,WSOiil反应体系为例,向步骤(2)中加入待测样品后得到的混合物中各组 分终浓度及含量如下。
[00451
[0046] 上述体系仅为例证性,在实际应用中可按照比例扩大或缩小该混合物体积及其中 各组分含量。
[0047] 具体地,在上述SOiil反应体系中,所述各对引物包括步骤(1)中的10对特异性引 物,所述样品为基因组DNA。
[004引具体地,在步骤(3)中的PCR反应条件为。
[0049]
[0050] 在上述PCR反应后,对结果进行分析,所得结果可分为W下二种。
[0化1] (1)测序结果比对后与野生型一致,无突变。
[0052] (2)测序结果比对后出现突变,如图2所示。
[0化3]实施例1。
[0054]制备本实用新型的T祕基因突变检测试剂盒,包括W下步骤:
[005引1.引物合成:针对人类T地基因 1-10号外显子序列设计并合成10对特异性引物,序 列分别为沈Q ID NO:巧P沈Q ID N0:2、SEQ ID N0:3和沈Q ID N0:4、SEQ ID N0:5和沈Q ID 側:6、569 10側:7和沈9 10側:8、569 10側:9和沈9 10顯:10、569 10側:11和沈9 10 NO: 12、沈Q ID NO: 13和沈Q ID NO: 14、沈Q ID NO: 15和沈Q ID NO: 16、沈Q ID NO: 17和沈Q ID NO: 18、沈Q ID NO: 19和沈Q ID NO:20。
[0056]将上述各对引物分别配制成IOOiiM母液储存。
[0057] 2.制备其他试剂:制备PCR缓冲液1,其中含有1. OmM MgCl2,dATP,加 TP,dGTP,dCTP 各1.0 mM;制备酶混合液2,其中含有Taq酶0.5 X l〇3u/ml,UNG酶O. I X l〇3u/ml。
[005引4.组装试剂盒,见图1。该试剂盒中包含5管PCR反应液1、1管酶混合液2和20管1-10 号外显子特异性扩增引物母液3。根据PCR反应体系各成分使用量,计算12人份和24份两种 规格成分使用量,配制试剂盒各种成分并组装。
[0化9]实施例2。
[0060] 患者女性,12岁,2011年6月自觉颈部增粗,伴轻微手抖及多汗,就诊于当地医院, 甲功示FT3和FW升高及TS啡華低,甲状腺超声示双侧甲状腺增大,伴多发结节,诊断为"甲状 腺功能亢进症",予赛治15mg日一次口服。2011年10月复查甲功,示FT3、FT4及T甜均升高,予 赛治30mg日一次口服,颈部增粗加重,甲状腺功能不能恢复正常。之后赛治间断使用。2013 年5月为求进一步诊治于我院就诊,口诊嘱其停用赛治1个月后收入病房。
[0061] 体格检查:身高 147cm,体重 41kg,BMI 18.97kg/m2。血压 110/70 ~120/80mmHg,屯、 率90~110次/分,BMR25%(-15%-W%)。甲状腺III度大,质初,无压痛,无震颤及血管杂 音。四肢及关节无崎形,四肢肌张力V级,肌张力正常。无泌乳、肢端肥大和眼病症状。
[0062] 方法和结果。
[0063] 生化与物理检查:入院时甲状腺功能:血清FT3:14.25pmol/L(2.63-5.7pmol/L), FT4:28.79pmol/L(9.01-19.05pmol/L),T甜:21.12mIU/L(0.35-4.94mIU/L),甲状腺自身抗 体均阴性;垂体激素(GH、PRL、ACTH、F細及LH)均正常;血清糖蛋白激素 a亚单位(a-G洲) 0.3化g/ml (0.22-0.39ng/ml),a-GSU/T甜比值0.15(<1)(表1);甲状腺超声:弥漫性甲状腺 月中;甲状腺1"3摄舰率:211:52.5%(正常范围10%-32%),2411:94.4%(正常范围25%-62 % );双耳电测听及骨龄检查均正常。
[0064] 基因测序:收集患者和其家人外周血,应用基因组DNA提取试剂盒(Qiagen),提取 出外周血基因组DNA,委托北京华大公司对T祕全长外显子1-10进行PCR扩增及测序。引物序 列及扩增产物长度见图3。测序结果显示,患者第10号外显子的第453位密码子存在点突变, 密码子从CCT突变为ACT,导致其所编码的蛋白质由脯氨酸变为苏氨酸。而患者父母和姐姐 均未发现该突变。
[0065] 垂体MRI:垂体MRI平扫可见垂体左外侧有一6mm巧mm微腺瘤,造影剂增强后不被强 化;为了明确垂体微腺瘤是T細瘤还是意外瘤,经神经外科医生共同诊治,在征求患者及其 家属同意下,对女童进行经蝶窦腺瘤切除术。腺瘤组织质软,包膜完整。考虑到患者年龄和 垂体低功的风险,术者仅取出腺瘤组织,未切除周围垂体组织。
[0066] 垂体病理组织免疫组化:手术标本经4%多聚甲醒固定,石蜡包埋切片,进行皿染 色;切片采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶法,进行TSH-0亚单位、GH、PRL、ACTH、FW、LH 及HCG-a亚单位的免疫组化染色。结果:垂体腺瘤80-90 %细胞TSH-e亚单位、HCG-a亚单位染 色阳性(染色强度+~++)、40-50%细胞細、P化染色阳性(染色强度++~+++)、10-15%细胞 ACTH染色阳性(染色强度+~++)呈散在性分布。LH和FSH染色阴性。
[0067] 术后随访女患14个月,监测甲功和甲状腺超声,随访结果见表3。术后3个月,女患 自述月经来潮。术后4个月,女患身高增长5cm,监测細从0.47mIU/L升至13.70mIU/L,LH从 1.35mIU/mL 升至 3.46mIU/mL。
[0068] kT3抑制试验:术后4个月,按照Refetoff等建立的标准进行kT3抑制试验。患者 予W剂量逐渐递增的1^-了3(50ug/d,lOOug/d,200ug/d),每日剂量分两次给药(早、晚8点), 各剂量给药3天,在给药前及每个剂量结束后分别检测TSH、TC、CK、Fer及甜BG等。L-T3逐步 加量使得正常人TSH完全抑制,Fer和S皿G水平上调,TC和CK水平下调;患者给药后,T甜未被 完全抑制,且CK反常升高,Fer和甜BG升高趋势不显著。说明女患垂体、肌肉和肝脏组织均出 现对外源性kT3的不同程度抵抗。
[0069] 讨论。
[0070] 该女患者,其血清FT3、FT4和T甜均升高,基因测序发现T祕第10外显子出现P453T突 变,因此该患诊断RT地无疑。但该患者同时合并垂体微腺瘤,使得诊断变得困难,到底是RTH 0合并垂体TSH微腺瘤还是RT地合并垂体意外瘤。
[0071] 血清糖蛋白激素 a亚单位(a-GSU)升高和TSH对TRH兴奋实验无反应是诊断垂体TSH 瘤的有效指标,但是其敏感性较差,例如:垂体T甜瘤患者中仅有70%的人血清a-GSU升高, 80 %的人血清a-GSU/T甜比值大于1。尽管理论上讲T甜瘤患者TWl兴奋实验TSH无反应,但仍 有10-20%的TSH瘤患者TRH兴奋实验T甜呈现正常反应。
[0072] 随着高分辨率的MRI的应用,垂体TSH微腺瘤的报道也越来越多,T甜微腺瘤显示出 与T甜大腺瘤不同的生化特点,例如T細微腺瘤经常不会伴随血清其它垂体激素升高,也不 会出现肿瘤压迫症状。与T甜大腺瘤相比,TSH微腺瘤往往血清糖蛋白激素 a亚单位(a-GSU) 正常或血清a-GSU/TS化k值小于1,例如对15名TSH微腺瘤患者的随访研究报道其中10人a-GSU正常,而仅有4人a-G洲/T甜比值大于IdT甜微腺瘤患者往往TWl兴奋实验T甜呈现正常反 应,一项对16名TSH微腺瘤患者的随访研究报道,10名TSH微腺瘤患者中7人TWl兴奋实验TSH 呈现正常反应。因此根据生化指标无法鉴别RT册合并垂体TSH微腺瘤还是RT地合并垂体意 外瘤。
[0073] 本病例支持RT册合并垂体T細微腺瘤的证据之一:通过对有P453T突变的8个家系 的甲状腺功能的分析,我们发现P453T突变患者的T細水平均在正常范围。但本研究报道的 患者术前T甜值显著高于正常范围,其垂体瘤术后血清T甜恢复到正常范围,运说明垂体腺 瘤组织分泌的T甜可能是该患T甜水平显著升高的原因。
[0074] 支持RT地合并垂体T甜微腺瘤的证据之二:14个月的术后随访结果,患者垂体瘤术 后甲状腺峡部明显缩小,血清FT3和T甜水平逐步下降,血清T甜恢复至正常范围。但由于患 者依然存在甲状腺激素抵抗,其血清FT4,FT3仍然高于正常范围。RefetofT报道,RT册患者 的血清T4水平较高,T4/T3比值明显高于T甜瘤患者。我们推断,RT册主要升高T4,而T甜瘤主 要升高T3,运与我们术后随访发现患者血清FT3和T甜水平逐步下降,而血清FT4未见明显变 化的趋势相一致。因此,随访结果强烈支持该RT地患者合并有TSH瘤。
[0075] 本例患者腺瘤组织的激素染色与血清中激素水平呈现不一致的现象。回顾文献, 我们发现既往报道的T細瘤的腺瘤组织免疫组化也常见合并其他垂体激素染色阳性(WGH 和TOL为主),但其血清垂体激素检测仍可正常,提示腺瘤组织中GH和TOL阳性细胞分泌的GH 和TOL不足W导致血清中GH和TOL水平的升高。本研究报道的T甜微腺瘤组织质软,组织切片 未发现间质纤维化和巧化,推测可能与其处于疾病早期阶段有关。
[0076] 综上所述,本实用新型检测效率高,方法简单,结果准确,成本低,具有实质性的技 术效果,便与推广。
[0077] 尽管上述对本实用新型做了详细说明。任何熟悉此技术的人±皆可在不违背本实 用新型的精神及范畴下,对上述实施例进行修饰或改变。因此,举凡所属技术领域中具有通 常知识者在未脱离本实用新型所掲示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变, 仍应由本实用新型的权利要求所涵盖。
【主权项】
1. 一种TRi3基因突变检测试剂盒,其特征在于该试剂盒包括PCR缓冲液、酶溶液和外显 子特异性扩增引物,其中该试剂盒中设置有5管PCR反应液、1管酶混合液和20管1-10号外显 子特异性扩增引物母液。2. 根据权利要求1所述的TRi3基因突变检测试剂盒,其特征在于,所述10对1-10号外显 子特异性扩增引物编号为SEQ ID ΝΟ:1 和SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID N0:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16、 SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20。
【文档编号】C12Q1/68GK205473835SQ201521134516
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2015年12月31日
【发明人】滕晓春, 滕卫平, 单忠艳, 金婷, 王冉冉, 梁越, 何雪, 张涵祎
【申请人】中国医科大学附属第医院, 中国医科大学附属第一医院
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